Noticias

Oct 20, 2023

La proteína heterocromatina 1 es un regulador en la precisión de empalme del ARN deficiente en la colitis ulcerosa

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6834 (2022) Citar este artículo

2655 Accesos

1 Citas

8 Altmetric

Detalles de métricas

Los defectos en el empalme del ARN se han relacionado con trastornos humanos, pero siguen estando poco explorados en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Aquí, informamos que la expresión de la cromatina y el regulador de empalme alternativo HP1γ se reduce en la colitis ulcerosa (UC). En consecuencia, la inactivación del gen HP1γ en el epitelio intestinal del ratón desencadena rasgos similares a los de la EII, que incluyen inflamación y disbiosis. Paralelamente, encontramos que su pérdida de función aumenta ampliamente el ruido de empalme, lo que favorece el uso de sitios de empalme crípticos en numerosos genes con funciones en la biología intestinal. Esto da como resultado la producción de progerina, una variante de empalme tóxica del ARNm de la prelamina A, responsable del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford del envejecimiento prematuro. El ruido de empalme también se detecta ampliamente en pacientes con CU en asociación con inflamación, con transcritos de progerina que se acumulan en la mucosa del colon. Proponemos que monitorear la actividad de HP1γ y la precisión de empalme de ARN puede ayudar en el manejo de la EII y, en general, del envejecimiento acelerado.

Las enfermedades intestinales inflamatorias (EII), incluidas la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), son trastornos intestinales inflamatorios crónicos caracterizados por una inflamación descontrolada que conduce a daño intestinal. Si bien se han identificado loci de genes de susceptibilidad, los factores genéticos representan solo una parte de la variación general de la enfermedad, lo que indica la necesidad de explorar mejor las interacciones entre los genes y el medio ambiente durante el desarrollo de las enfermedades1. La epigenética captura las tensiones ambientales y las traduce en patrones de expresión de genes específicos, lo que nos lleva a explorar las desregulaciones de la cromatina en la patogénesis de la EII. En un estudio anterior, identificamos la Proteína de Heterocromatina 1γ (HP1γ) como un regulador de genes inflamatorios en respuesta a enterobacterias2. Los miembros de la familia de proteínas HP1, que también incluye HP1α y HP1β en ratones y humanos, son lectores de las modificaciones de la histona H3K9me2/3. Desempeñan un papel clave en la formación y el mantenimiento de la heterocromatina, por lo que participan en el silenciamiento génico transcripcional3. Paralelamente, las proteínas HP1 muestran actividad de unión al ARN, como se describe en múltiples especies4, y en mamíferos, los estudios in vitro han demostrado que HP1γ se une a motivos repetitivos intrónicos del pre-ARN mensajero5 para promover el procesamiento co-transcripcional del pre-ARNm y el empalme alternativo6,7 ,8. Aquí, mostramos que, en el epitelio intestinal, la regulación mediada por HP1γ tanto de la transcripción como del metabolismo del ARN es necesaria para la homeostasis intestinal y es importante para comprender la EII.

Nuestras observaciones previamente informadas sobre el impacto de HP1γ en el control de la inflamación en el intestino en respuesta a la infección bacteriana2 nos llevaron a examinar la expresión de esta proteína en el contexto de la inflamación crónica. Con ese fin, examinamos una cohorte disponible de biopsias de colon en tejido no inflamado de pacientes con CU y de individuos sanos que se sometieron a colonoscopias de detección (Fig. 1a y Datos complementarios 1 para una descripción detallada de la población). La inmunofluorescencia cuantitativa (IF) mostró una expresión fuertemente disminuida de HP1γ en el epitelio colónico de pacientes con CU, en comparación con individuos sanos (pacientes de control) (Fig. 1a, b). La expresión comprometida de HP1γ en asociación con la CU se confirmó mediante el modelo de ratón EXCY2, que combina disfunción inmunitaria (deficiencia de Il10) y deficiencia de NADPH oxidasa 1 del epitelio (Nox1)9. En etapas tempranas, estos ratones exhibieron una colitis crónica espontánea que evolucionó a una displasia asociada a colitis y adenocarcinomas. La expresión reducida de HP1γ en el epitelio prevaleció en la etapa inflamatoria crónica inicial (de 1 a 5 meses de edad), mientras que en la etapa de cáncer, la expresión se recuperó, en coherencia con el aumento informado de la detección de miembros de la familia de proteínas Cbx en varios cánceres10, 11 (Fig. 1c, d).

a, b La expresión de HP1γ se ve afectada en pacientes con colitis ulcerosa (UC): (a) Inmunofluorescencia representativa en secciones de tejido colónico teñidas con anticuerpo anti-HP1γ (rojo) y Dapi (azul) de secciones de colon (barra de escala: 50 μm) y en ( b ) Cuantificación de ImageJ de la intensidad de señal / sección media de fluorescencia HP1γ en control (n = 10) y pacientes con CU (n = 16), expresada como valor relativo a los pacientes de control (c, d) Expresión bifásica de HP1γ en el IL10 / Modelo de ratones NOX1 KO, c inmunotinción con anticuerpo anti-HP1γ (rojo) y fluorescencia Dapi (azul) y en (d) cuantificación ImageJ de la intensidad de fluorescencia media. n = 6 ratones para cada grupo, barra de escala: 80 µm, (e) expresión de ARNm para Reg3b y Reg3g de vellosidades y epitelios de colon de ratones Ctrl (control) y Cbx3 KO (n = 3–6 ratones/grupo) (f) Expresión de ARNm de Tnf, Il1b y II6 por RT-qPCR del epitelio de colon de ratones Ctrl (control) y Cbx3 KO (n = 3–4 ratones/grupo) (g) Enriquecimiento significativo del transcriptoma Cbx3 KO de colon con firma proinflamatoria , GSEA calculó los valores P nominales bilaterales. ( h ) Evolución temporal de la diversidad Beta en ratones macho y hembra Villin-Cre Cbx3. Esquema que ilustra el curso temporal de la recolección de muestras fecales antes (que define el grupo A) y después de los tratamientos (Vhc o Tamox) (que define los grupos B–E), en ratones hembra (n = 8) y macho (n = 6). El análisis estadístico se proporciona en Datos complementarios 4. Todos los datos se presentan como la media ± SEM; Prueba t de Student bilateral (b, d, e, f). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Estas observaciones, que sugieren un papel para HP1γ en la inflamación crónica, nos llevaron a generar un modelo de ratón Villin-creERT2:Cbx3-/-, que permite la inactivación inducible del gen Cbx3 (que codifica la proteína HP1γ) en el linaje epitelial del intestino. En estos ratones, denominados ratones Cbx3 KO, la alimentación forzada con tamoxifeno resultó en el agotamiento completo de la proteína HP1γ en el epitelio de los tejidos analizados, aunque el agotamiento estuvo acompañado por una regulación al alza de las isoformas HP1α y HP1β (Figura 1 complementaria). ), como se informó previamente12. La observación de estos tejidos mediante tinción de inmunofluorescencia no indicó ningún cambio en las marcas de heterocromatina constitutiva, incluidos H3K9me3 y H4K20me3, y los cromocentros visualizados mediante tinción con DAPI aparecieron inalterados (Figuras complementarias 1, 2).

La secuenciación de ARN de próxima generación en células epiteliales purificadas de criptas, vellosidades y colon en ratones adultos jóvenes (de 8 a 10 semanas de edad) indicó cambios extensos en el panorama del transcriptoma en el epitelio de ratón Cbx3 KO, con puntajes característicos aumentados en las vías involucradas en la oxidación de lípidos, sintomática de daño oxidativo (Datos complementarios 2). Además, notamos una marcada disminución en la expresión de los ARNm que codifican péptidos antimicrobianos (AMP), incluidas las defensinas, las catelicidinas y el tipo de AMP del gen regenerador (Reg) (Datos complementarios 3 y Fig. 1e). En el colon, notamos además un aumento sustancial en la expresión génica inflamatoria confirmada por Q-PCR (Fig. 1f, g y Datos complementarios 2).

Tanto la inflamación como las alteraciones de la producción de AMP conducen a la disbiosis del microbioma intestinal13,14. Caracterizamos aún más los microbiomas fecales en ratones (n = 6 machos y n = 8 hembras) a través de la secuenciación Illumina de la región V3–V4 del 16 S bacteriano. ARNr. En el posterior análisis de coordenadas principales de UniFrac, los ratones Cbx3 KO se agruparon lejos de los WT, lo que indica un cambio en las comunidades microbianas (Fig. 1h y Datos complementarios 4 para detalles estadísticos). Este cambio se exacerbó en las hembras (valor de p = 0,006) en comparación con los machos (valor de p = 0,015), aunque las comunidades bacterianas eran similares en los dos sexos antes de la inactivación de Cbx3 (Fig. 1h). La composición bacteriana también se mantuvo sin cambios en ratones hembra Cbx3 fl/fl tratados con tamoxifeno en ausencia de la recombinasa Cre, descartando un efecto inducido únicamente por la administración de tamoxifeno (Fig. 3 complementaria).

Como el sexo puede influir en los factores de riesgo de EII15, realizamos análisis separados de ratones machos y hembras. En ratones hembra, se modularon 110 unidades taxonómicas operativas (OTU) en respuesta a la inactivación de HP1, mientras que en los machos, solo 60 OTU covariaron significativamente con la inactivación de HP1 (Datos complementarios 5). Particularmente en las hembras, observamos una sobrerrepresentación de bacterias colitogénicas como E. coli y Alistipes, y una profunda regulación a la baja de especies bacterianas antiinflamatorias como el productor de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) Ruminococcaceae (Fig. 4 complementaria) , siendo ambos fenómenos sintomáticos de una microbiota disbiótica reportada en IBD16.

Por lo tanto, la CU se asocia con una expresión reducida de HP1γ en el epitelio intestinal, mientras que la inactivación del gen afín en el intestino del ratón da como resultado características típicas de la ruptura de la homeostasis intestinal. Concluimos que en el epitelio del colon, HP1 ejerce funciones protectoras, contribuyendo a la homeostasis antiinflamatoria y de la microbiota.

A continuación, delineamos las funciones homeostáticas desempeñadas por HP1γ en el intestino delgado. El análisis del transcriptoma fue indicativo de un silenciamiento de los genes objetivo de E2F tras la inactivación de Cbx3 (Datos complementarios 2), de acuerdo con su papel informado en el control de la división celular mediado por retinoblastoma (Rb)17. De acuerdo con un efecto de la inactivación de Cbx3 en el ciclo celular, el marcador de proliferación Ki67 en los ratones mutantes se detectó ectópicamente más allá del compartimento proliferativo normal, extendiéndose a lo largo de las criptas y en la base de los ejes de las vellosidades (Fig. 5a complementaria). Además, un pulso de 1 h del análogo de timina 5-bromo-29-desoxiuridina (BrdU), que marcaba las células en la fase S, resultó en un marcado frecuente de las células dentro del compartimento de células madre intestinales (ISC) de ratones Cbx3 KO, como se evidencia por el aumento significativo en la detección de células positivas para BrdU en las posiciones 0 a +4 de la cripta (Fig. 2a, b). En los ratones de control (Ctrl), este marcaje se limitó predominantemente al compartimento de progenie de ISC inmediato, es decir, las células amplificadoras de tránsito, mientras que para el ISC, BrdU se incorporó de manera deficiente, en consonancia con la fase G1 prolongada de las células madre18. La expansión del nicho de células madre en los ratones Cbx3 KO también se documentó mediante un área de detección ampliada para el marcador de troncalidad Olfm4 (Figuras complementarias 5b, c). Finalmente, los cultivos de matrigel 3D enteroide ex vivo mostraron una formación acelerada de yemas cuando se recolectaron células de ratones Cbx3 KO (Figuras complementarias 6a, b). Sin embargo, tras un cultivo prolongado, la proporción de cogollos por organoide se redujo drásticamente en los organoides derivados de Cbx3 KO, posiblemente como consecuencia del agotamiento celular (Figuras complementarias 6a, b). En los organoides, la detección de células en fase S mediante la incorporación de EdU también reveló células positivas aberrantes a lo largo de los ejes de las vellosidades, con células positivas para EdU que llenaban la luz de los organoides (Fig. 2c y Fig. 6c complementaria).

( a ) Inmunotinción con anticuerpo anti-BrdU (rojo) y Dapi (azul) de secciones de cripta ileal de ratones Ctrl y Cbx3 KO (barra de escala: 20 μm) y en ( b ) Cuantificación de las células positivas de BrdU (rojo) vs Dapi (azul) en el compartimento de células madre (posición 0 a +4) n = 3 animales Ctrl, n = 20 secciones; Cbx3 KO n = 15 secciones), (c) Imagen representativa de co-teñido EdU (rojo)/Dapi (azul) en organoides derivados de ratones Ctrl y Cbx3 KO (barra de escala: 100 μm) en n = 3 ratones/grupo y la cuantificación se proporciona en la Fig. 6c complementaria (d) Enriquecimiento significativo del transcriptoma Cbx3 KO de las vellosidades con la firma de células madre intestinales (ISC) Lgr5 + (Munoz et al., 2012), GSEA calculó los valores de P nominales de dos caras, ( e) Expresión de ARNm de Olfm4 y Ascl2 por RT-qPCR del epitelio de las vellosidades de ratones Ctrl y Cbx3 KO (n = 3–4 ratones/grupo) (f) Inmunofluorescencia representativa con anticuerpo de nucleolina, n = 6 ratones/grupo (barra de escala: 100 μm, 25 uM en el inserto) (g) Microscopía electrónica de transmisión representativa (n = 3 ratones por condición) que caracteriza la estructura nucleolar en la parte superior de las vellosidades: en (g-izquierda), se observó heterocromatina (hc) en el núcleo de ratones ctrl y en ratones Cbx3 KO se detectaron nucléolos canónicos (n), barra de escala = 5 µm, en (g-derecha): Ampliación que muestra el área de interés con un nucléolo canónico en el ratón Cbx3 KO (g: granular componente; fc: centro fibrilar; dfc; componente fibrilar denso) barra de escala = 2 µm, (h) niveles de expresión de rRNA 45 S y 18 S tanto en criptas como en vellosidades en ratones Cbx3 KO (n = 3–4 ratones/grupo), (i) inmunofluorescencia representativa con anti-lisozima anticuerpo (rojo) y Dapi (azul) en la cripta ileal (barra de escala: 20 μm) y (j) Cuantificación del área de expresión de lisozima. (n = 6 ratones/grupo, con un total de n = 40 campos/condiciones) (k) Expresión de ARNm de Sis (sacarasa isomaltasa) en el epitelio de las vellosidades (n = 4–8 ratones). Todos los datos se presentan como la media ± SEM; Prueba t de Student bilateral (b, d, e, h, j, k). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Junto con esta homeostasis proliferativa alterada, las vellosidades de ratones mutantes estaban sujetas a defectos de maduración, como lo ilustra un análisis GSEA, que muestra una fuerte asociación entre genes desregulados por la inactivación de Cbx3 y genes asociados con una firma de células madre intestinales, mientras que las reacciones de RT-qPCR revelaron aumento de la expresión de los marcadores de tallo Ascl2 y Olfm4 en los ratones mutantes (Fig. 2d, e). A lo largo del epitelio de las vellosidades de los ratones Cbx3 KO, también notamos la expresión de nucleolina, un marcador del nucléolo, y los estudios de microcopia electrónica proporcionaron evidencia de la presencia de estructuras nucleolares canónicas en la parte superior de las vellosidades, incluido el componente granular, centro fibrilar y componente fibrilar denso (Fig. 2f, g). Esto contrastaba marcadamente con la disminución esperada de la expresión de nucleolina a lo largo del eje cripta-vellosidad (Fig. 2f, g), una consecuencia de la dilución progresiva de los ribosomas en las poblaciones de células posmitóticas que normalmente prosperan en los ribosomas heredados de las células progenitoras19 . La producción ectópica de orgánulos nucleolares finalmente se documentó mediante un aumento de la producción de 18 s rRNA observado tanto en las criptas como en las vellosidades, en asociación con un enriquecimiento en genes involucrados en la biogénesis ribosomal (Fig. 2h y Fig. 5d complementaria). Por lo tanto, se perdió la represión homeostática de los orgánulos nucleolares que se producen durante la maduración de las células epiteliales. Es de destacar que la cuantificación del mapeo de lecturas a retrotransposones en los experimentos de RNA-seq documentó que, a diferencia de lo informado previamente para la inactivación de la H3K9 metiltransferasa Setdb1 en el epitelio intestinal20,21, la inactivación de HP1γ no dio como resultado una mayor expresión de estas repeticiones de ADN normalmente heterocromatinizadas . Por lo tanto, el dessilenciamiento del ADNr y la pérdida de la represión nucleolar a lo largo de las vellosidades en los ratones Cbx3 KO no ocurrieron en un contexto de desestabilización global de las estructuras heterocromáticas (Fig. 7 complementaria).

Finalmente, la producción de linajes maduros en los ratones Cbx3 KO se vio afectada tanto en los linajes de absorción como en los de secreción. Del mismo modo, el análisis GSEA de los datos de RNA-seq de ambos compartimentos mostró alteraciones en los programas de expresión génica de Paneth y enterocitos (Figura complementaria 5e, f), y notamos un defecto marcado en la expresión de lisozima, un marcador de células de Paneth, y de Sacarasa Isomaltasa, un marcador de diferenciación de enterocitos de absorción (Fig. 2i, k). En general, estos datos fueron indicativos de una desregulación en el control de la proliferación celular y en la producción de linajes maduros tras el agotamiento de HP1γ.

A continuación, buscamos definir funciones para HP1γ en la homeostasis del ARN en el epitelio intestinal. La espectrometría de masas reveló que los interactuantes de HP1γ estaban altamente enriquecidos en el componente del spliceosoma (Figuras complementarias 8a, b y Datos complementarios 6). Entre ellos, identificamos miembros del spliceosoma catalítico del paso 2 (también llamado complejo C spliceosomal tipo U2) y factores de empalme esenciales en el reconocimiento del sitio de empalme, como las proteínas ricas en Ser/Arg (SR). Desafiar algunas de estas interacciones proteína-proteína con la ARNasa no sugirió una implicación de las moléculas de ARN que intervienen, de acuerdo con informes anteriores22 (Fig. 8c complementaria). Esto fue consistente con los estudios sobre el papel de HP1γ en la regulación del corte y empalme de pre-ARNm6,22. Del mismo modo, el análisis de los datos de RNA-seq con la tubería de análisis multivariante de empalme de transcripciones (rMATS) confirmó que el empalme se vio muy afectado por la inactivación de HP1γ. Las variaciones significativas en el empalme incluyeron una tendencia hacia una mayor retención de intrones en el intestino delgado pero no en el colon, con una mayor y menor inclusión de exones alternativos (Fig. 3a y Datos complementarios 7–9, empalme alternativo significativo (FDR < 0,05) eventos en epitelios de criptas, vellosidades y colon). Algunos de estos eventos fueron validados por RT-qPCR (Figura 9 complementaria).

( a ) Tipos y cantidad de alteraciones de empalme detectadas en el colon, las vellosidades y los epitelios de las criptas por rMATS. Los tipos de alteraciones de empalme están codificados por colores como se indica. SE: exones omitidos, MXE: exones mutuamente excluyentes, A3'SS y A5'SS: sitios de empalme alternativos de 3'/5', RI: intrones retenidos. ( b ) Cuantificación de uniones de novo en condiciones de control (Ctrl) y Cbx3 KO (KO) en criptas, vellosidades y epitelios de colon después de consolidar las 3 réplicas de RNA-seq de ratones ctrl o Cbx3 KO en cada tejido. Las uniones de novo se definieron como uniones no anotadas en la versión mm9 del genoma del ratón y que no estaban presentes ni en las muestras WT ni en las mutantes. El valor de p indicado se calculó con una prueba t de Student de dos caras pareadas, n = 3 (criptas, vellosidades y colon). La cuantificación de uniones de novo en neuronas de Purkinje de ratón, ya sea WT o inactivadas para Rbm17, se muestra como un control positivo. ( c ) Puntuación maxEnt consolidada de los sitios de novo identificados con el enfoque descrito en ( b ), en comparación con la puntuación obtenida con uniones anotadas y con las obtenidas con secuencias seleccionadas al azar (negro y azul, respectivamente). Los valores que se muestran son de Cbx3 KO en criptas, vellosidades y colon (n = 3 ratones, el valor de p se calculó con Anova unidireccional ordinario). ( d ) Las uniones de novo se cuantificaron en genes que, transcripcionalmente, se vieron afectados menos del doble por la inactivación de Cbx3 KO. Para cada condición indicada, contamos los genes que ganaron la unión de novo dos veces o más (valor de p <0.05). ( e ) Las uniones de novo en el colon (Pkm y Cdh1) o las vellosidades (Lmna) se visualizaron con un navegador de genoma en la vecindad de los genes indicados. Cada barra representa una pareja donante/aceptora "de novo", que se extiende desde el sitio de empalme 5' al 3'. (f) Los gráficos de barras muestran el número de uniones de novo detectadas en los genes indicados en las criptas, las vellosidades y el colon (n = 3 ratones para cada condición, los datos se presentan como la media ± SEM; los valores de p indicados se calcularon con dos prueba de la t de Student de dos caras). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La ausencia de un patrón definido en el impacto de HP1γ en el empalme nos llevó a examinar si estos numerosos eventos de empalme serían el resultado de un empalme ruidoso23, relacionado con el cáncer y la neurodegeneración24,25,26,27. Con ese fin, identificamos uniones de empalme sin anotar presentes en solo una de las dos condiciones experimentales (ya sea WT o Cbx3 KO) para cada tejido. La abundancia de estas uniones a las que en adelante nos referiremos como "de novo" aumentó significativamente con la inactivación de Cbx3 (Fig. 3b). Este aumento estuvo en un rango similar al observado en las neuronas de Purkinje del cerebelo sin Rbm17, una proteína de unión al ARN que reprime el uso de empalme críptico26 (Fig. 3b). Los experimentos de RT-PCR documentaron además un mayor uso de sitios de empalme crípticos en el exón o el intrón inducido por la inactivación de HP1γ (Fig. 10 complementaria).

La evaluación de la calidad de los donantes y aceptores de empalme de consenso con un software dedicado reveló que, en promedio, las uniones de novo obtuvieron una puntuación más baja que las uniones anotadas, pero más altas que las secuencias aleatorias (Fig. 3c). Esto sugirió que la inactivación de HP1γ promovió el uso de sitios de empalme de consenso deficiente y posiblemente aumentó el rango de oportunidad de empalme. El examen de los datos disponibles públicamente identificó varios socios moleculares de HP1γ que, cuando se inactivan, dan como resultado un aumento significativo en el ruido de empalme. Estos socios incluyen PPL128, un componente de empalmesoma similar a la peptidil prolil isomerasa, ZC3H13, una proteína con dedos de zinc que recluta metiltransferasas de ARN involucradas en la modificación de la metilación de N6-adenosina (m6A)29,30, y la proteína rica en Ser/Arg SRSF531 (Fig. 11).

Finalmente, el examen del ruido de empalme inducido por la inactivación de Cbx3 gen por gen documentó aún más que, en una gran mayoría de genes no afectados en su nivel de expresión, la cantidad de sitios de empalme activos aumentó significativamente (Fig. 3d y Datos complementarios 10 para la lista de genes). Estos genes incluían reguladores de la homeostasis intestinal. En particular, observamos que el gen Pkm, que produce los ARNm de Pkm1 ​​y Pkm2 mediante corte y empalme alternativo, este último protege contra la colitis32, mostró un aumento considerable en el corte y empalme de novo en el colon (Fig. 3e, f, paneles izquierdos). Asimismo, el gen Cdh1 que codifica la E-cadherina, esencial para la función de barrera epitelial33, y sujeto a terminación prematura por corte y empalme alternativo34, se vio afectado por la inactivación de Cbx3 tanto en las criptas como en el colon (Fig. 3e, f paneles centrales). Finalmente, observamos un impacto particularmente fuerte en el gen Lmna con un aumento promedio de 9 veces en las uniones de novo en las vellosidades (Fig. 3e, f, panel derecho).

La importancia biológica del ruido de empalme no se ha caracterizado bien en los mamíferos, lo que nos llevó a investigar si el aumento del uso de uniones de empalme de novo en el gen Lmna en las vellosidades que carecen de HP1γ podría dar como resultado la producción de progerina. El gen LmnA incluye 12 exones y, mediante corte y empalme alternativo, producirá ARNm de lamina A y lamina C. Ocasionalmente, un raro evento de empalme también resultará en la producción de progerina, una versión truncada de la lámina A que actúa como una isoforma de proteína negativa dominante responsable del síndrome de progeria de Hutchinson Gilford (HGPS)35,36. En este síndrome de envejecimiento prematuro, la producción de esta variante de empalme se ve facilitada por una mutación genómica que aumenta el uso de un sitio de empalme de progerina que en las células normales se usa con bajos rendimientos al usar un sitio de empalme de consenso deficiente37.

Por lo tanto, aplicamos RT-PCR y Taqman PCR cuantitativa para la detección de transcritos de lamina A y progerina en el epitelio intestinal del ratón (Figura complementaria 12a y Figura 4a, b). La RT-PCR de punto final que usa cebadores anidados en el exón 9 y 12 para LmnA mostró evidencia de detección de transcritos de progerina en ratones Cbx3 KO pero no en ratones Ctrl (Fig. 12a complementaria). La PCR cuantitativa Taqman documentó además una incidencia significativamente mayor del evento de empalme específico de progerina tras la inactivación de Cbx3 en el epitelio de las vellosidades (Fig. 4b). La secuenciación de los productos finales de PCR confirmó que este producto de empalme era idéntico al detectado en ratones G609G HGPS (Fig. 4c). Sin embargo, la abundancia del producto de empalme se mantuvo notablemente más baja que la observada en el epitelio de colon o intestino delgado de ratones Lmna G609G HGPS, en coherencia con el aumento de la fuerza de la progerina 5'SS proporcionada por la mutación37 (Fig. 4b y Fig. 12b complementaria) .

(a, b) Ensayos Taqman lamina A y progerina en ctrl (n = 4), Cbx3 KO (n = 8), WT y HGPS G609G (n = 4 ratones/grupo), prueba U de Mann-Witney (c) Ejemplos de datos de secuenciación de los productos finales Taqman PCR en muestras de vellosidades Cbx3 KO, fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) derivados de ratones G609G utilizados como control, (d) inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-progerina en lisados ​​de epitelio derivados de ratones Ctrl, Cbx3 KO y como control interno, Cbx3 fl/fl que no expresa la recombinasa Cre tratada con tamoxifeno. El experimento es representativo de 2 repeticiones independientes, con un total de n = 4 ratones/grupo (e) Inmunofluorescencia representativa con anticuerpo anti-progerina (rojo) y Dapi (azul), barra de escala: 20 μm y en (f) cuantificación proporcionada por el porcentaje (%) de células que expresan progerina según la posición a lo largo del eje de la cripta ileal (Cbx3 KO n = 23 secciones, n = 3 ratones). Los datos se presentan como la media ± SEM, (g) Inmunofluorescencia con anticuerpo anti-Lamin B1 (verde) marcando la envoltura nuclear (Barra de escala: 50 µm, Inserto: 15 µm y en (h) cuantificación proporcionada por el porcentaje de células con núcleo deformado, n = 5–9 ratones en cada grupo, contando en ctrl = 4757 núcleos y Cbx3 KO = 29753 núcleos, respectivamente. Los datos se presentan como la media ± SEM, prueba t de Student bilateral. Los datos de origen se proporcionan como un Archivo de datos de origen.

A continuación, utilizamos la PCR de gotitas digitales (ddPCR) para evaluar en cada condición el porcentaje de empalme en (PSI) del evento de empalme específico de progerina, correspondiente a la cantidad de isoforma de progerina dividida por la cantidad total de canónico (lámina A) y progerina. isoformas. En las criptas Ctrl y las vellosidades detectamos una media de 415 ± 166 copias/ul y 0,16 ± 0,15 copias/ul de productos de empalme canónicos y específicos de progerina respectivamente, mientras que en Cbx3 KO estas cifras ascendieron a 1566 ± 725 copias/ ul para lamina A y 2,8 ± 0,42 copias/ul para progerina (Fig. 12c complementaria). Como se esperaba, la detección de progerina en ADNc derivado de células epiteliales de criptas purificadas de ratones HGPS fue mayor con 33,86 copias/ul y 11,8 copias/ul de lamina A. La traducción a PSI promedio mostró un aumento de 0,045 a 0,21 tras la inactivación de Cbx3, documentando una mayor ocurrencia del evento de empalme específico de progerina que no se debió a la mayor expresión del gen Lmna en los ratones mutantes (Figura complementaria 12d y Datos complementarios 11). A continuación, investigamos si el nivel de transcripción de progerina detectado en el intestino delgado de los ratones Cbx3 KO produjo producción de progerina. Usando un anticuerpo monoclonal anti-progerina bien caracterizado (Fig. 13 complementaria), detectamos fácilmente la proteína de progerina tanto en el epitelio de las vellosidades como en las criptas, como se visualiza mediante inmunotransferencia (Fig. 4d). Es de destacar que la ausencia de señal de progerina en Cbx3 fl / fl que no alberga una Cre-recombinasa inducible permitió descartar un efecto de la inducción de tamoxifeno en la producción de progerina (Fig. 4d). La acumulación de proteína progerina en las criptas y las vellosidades se documentó aún más mediante inmunocitoquímica (Fig. 14 complementaria). Este enfoque reveló que la progerina se detectó principalmente en la progenie inmediata de ISC (arriba de la posición + 4, Fig. 4e, f), lo que evidencia un gradiente de expresión de progerina a lo largo del eje cripta-vellosidad en ratones Cbx3 KO. La eliminación de Cbx3 (KO) mediada por crispr / Cas9 in vitro en células enterocíticas TC7 confirmó la producción de transcritos de progerina y la acumulación de proteína de progerina nucleocitoplasmática (Figuras complementarias 15a, b).

La acumulación de progerina altera principalmente la estructura de la lámina nuclear38. Por lo tanto, examinamos si se detectó toxicidad para la lámina nuclear A tras la inactivación de Cbx3. La observación del intestino delgado de ratones Cbx3 KO reveló una deformación de la envoltura nuclear en una fracción de las células epiteliales tras la inmunotinción con laminB1 (Fig. 4g, h). También se observaron defectos similares in vitro sobre la inactivación de Cbx3 (KO) mediada por crispr/Cas9 (KO) en la línea de células enterocíticas TC7, lo que resultó en invaginaciones profundas de la membrana nuclear detectables por microscopía electrónica, lo que refleja un fenotipo de laminopatía (Figura complementaria 15c, d) . En general, estos datos mostraron que el defecto de HP1γ aumentó el rango de oportunidad de las variantes de empalme de ARNm de lamina A, lo que condujo a la producción de progerina en ausencia de mutación HGPS en el epitelio intestinal.

Los niveles reducidos de HP1γ asociados con la CU (Fig. 1a, b) nos llevaron a buscar un aumento del ruido de empalme en pacientes con CU. Para investigar esto, extrajimos datos de RNA-seq de 206 pacientes jóvenes con CU y 20 donantes sanos compatibles de la gran cohorte PROTECT39 de CU sin tratamiento inicial multicéntrico inicial. Este conjunto de datos se seleccionó porque estaba bien controlado y tenía una profundidad de secuenciación suficiente para el análisis de empalme. La cuantificación de las uniones de novo reveló un aumento muy significativo (valor P = 10−59) en el ruido de empalme en los pacientes con CU, en comparación con los donantes sanos (Fig. 5a). La comparación de pacientes con CU que muestran niveles de unión de novo en el cuartil superior con aquellos con niveles en el cuartil inferior (ver esquema en la Fig. 5b), reveló además que el ruido de empalme alto se correlacionó con una mayor actividad de genes asociados con la respuesta inflamatoria y con expresión reducida de genes mitocondriales, ambos relacionados con la gravedad de la enfermedad en el estudio inicial39 (Fig. 5b, c y Datos complementarios 12 que incluyen la descripción del paciente con CU y los análisis de enriquecimiento de anotaciones funcionales). En consonancia con esto, la puntuación de gravedad histológica fue más alta (basada en el cálculo, valor de p = 0,03). El ruido de empalme también pareció tener un valor predictivo para la cicatrización de la mucosa después de 4 semanas (4H) de medicación (definida como calprotectina fecal <250 mcg/g), ya que los niveles altos de calprotectina fecal 4H fueron más frecuentes en el cuartil superior (80 % frente a 57 %). % en el cuartil inferior), y los pacientes en remisión fueron menos (43 % frente a 67 % en el cuartil inferior - Figura complementaria 16a, b). Examinamos más a fondo el ruido de empalme por gen, como en los ratones Cbx3 KO. De 2743 genes bajo escrutinio, seleccionados como expresados ​​en las biopsias (mínimo 10 lecturas de secuencias de ARN por gen) y no afectados por CU (menos del doble de cambio en la expresión entre donantes sanos y pacientes con CU), 415 genes (15 %) mostraron un aumento en las uniones de novo> 1.5 veces (p Val <0.01) en pacientes con CU, mientras que solo 11 genes (0.4%) mostraron niveles reducidos de estas uniones (Fig. 5d y Datos complementarios 13). Estos genes incluían LMNA (Fig. 5e), lo que nos llevó a examinar la producción de progerina en una cohorte de biopsias de colon. Los ARN totales se extrajeron de biopsias de colon de pacientes con CU (n = 19) y se compararon con individuos sanos (n = 17) o pacientes con enfermedad de Crohn (EC) (n = 16) con afectación del colon (Datos complementarios 14 para una descripción detallada de la población). Luego se determinaron los niveles de expresión de ARNm de lamina A y progerina mediante ensayos taqman, incluida la verificación de los productos finales de la PCR mediante secuenciación. En pacientes con CU, los niveles de eventos de empalme específicos de progerina se regularon significativamente (p Val = 0.0002) (Fig. 5f, g), mientras que la producción del producto de empalme de lamina A no lo fue (Fig. 5h). No se detectó correlación entre la expresión de ARNm de progerina y la edad del paciente (Fig. 16c complementaria). Inversamente, en pacientes con CD, el empalme específico de progerina no se vio afectado (Fig. 5f), mientras que el producto de empalme específico de lamina A se reguló (p Val = 0.016) (Fig. 5h), este aumento se refiere principalmente a los pacientes con CD más jóvenes. <45 años, como se muestra en el análisis de regresión lineal (Figura complementaria 16d, e).

(a) Cuantificación de uniones de novo en donantes sanos (Cont, n = 20) y en pacientes con CU (n = 206) a partir de los datos de ARN-seq de la cohorte PROTECT UC (GSE109142). Las uniones de novo se definieron como uniones no anotadas en la versión hg19 del genoma humano y que no estaban presentes tanto en donantes sanos como en pacientes con CU. Los valores mostrados se normalizaron por el número total de lecturas en cada experimento de RNA-seq para tener en cuenta las eventuales variaciones en la profundidad de la secuenciación. El valor de p se calculó con una prueba t de Student de dos colas para datos no apareados. El centro de la gráfica de caja indica la mediana, la (x) indica la media, los límites de la caja indican los cuartiles 1 y 3, los bigotes superior e inferior definen los mínimos y máximos. Cuando hay valores atípicos, los bigotes se extienden 1,5 veces el rango intercuartílico. Los valores atípicos se muestran como puntos. (b) Gráfico de cadenas que representa el recuento normalizado de uniones de novo para cada donante (sano en azul, pacientes con CU en rojo). Las áreas enmarcadas representan aproximadamente los pacientes incluidos en los cuartiles indicados. ( c ) Los genes expresados ​​​​diferencialmente (> 1.5 veces, P Val < 0.01) entre pacientes en los cuartiles inferior y superior se compararon con las anotaciones de Gene Ontology. Se indican rutas significativamente (P val < 0,01) enriquecidas en la categoría de "procesos biológicos". ( d ) Las uniones de novo se cuantificaron en genes que, transcripcionalmente, se vieron afectados <1.5 veces entre donantes sanos y pacientes con CU. Para cada condición indicada, contamos los genes que ganaban unión de novo 1,5 veces o más (p Val <0,01). (e) Las uniones de empalme en un donante sano representativo y un paciente UC representativo se visualizaron con un navegador de genoma en la vecindad del gen LMNA (indicado en rojo). Cada barra representa una pareja donante/aceptora, que se extiende desde el sitio de empalme 5' al 3'. Los histogramas en las pistas superiores representan la densidad de lectura local en los datos de RNA-seq. El paciente con CU se eligió en el cuartil superior pero no muestra el recuento de uniones de novo más alto (f–h) Ensayos Taqman lamina A y progerina en control (n = 17), enfermedad de Crohn (CD, n = 16) y colitis ulcerosa (UC, n = 19), las poblaciones de cDNA se extrajeron de biopsias de colon. Prueba U de Mann-Witney. (h) ejemplo de datos de secuenciación de los productos finales de la PCR Taqman en un paciente con UC, se utilizó fibroblasto humano de un paciente con HGPS como control positivo, UC = colitis ulcerosa. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Por lo tanto, estas observaciones identifican una extensa desregulación de la precisión de empalme en UC. La transcripción de progerina surge como un marcador potencial de CU y de este aumento del ruido de empalme. Finalmente, nuestras observaciones enfatizan el valor predictivo del ratón Cbx3 KO en el modelado de esta enfermedad.

Si bien el papel del metabolismo del ARN se ha descrito ampliamente en enfermedades neurodegenerativas, cardíacas y de envejecimiento prematuro40, en los trastornos intestinales no se ha explorado en gran medida. El presente trabajo define HP1γ como una proteína que protege la precisión del empalme del ARN en el epitelio intestinal, lo que limita el impacto de los eventos de empalme no canónicos que ocurren naturalmente. La actividad de empalme no canónico se denomina con frecuencia "ruido de empalme"23. Mientras que en modelos animales no mamíferos, el empalme ruidoso puede promover la diversidad en las variantes de empalme de ARNm, con posibles funciones fisiológicas41,42, su importancia en los mamíferos sigue siendo difícil de alcanzar. En este último caso, la actividad generalizada de empalme erróneo puede ser un factor impulsor de la evolución del genoma43, pero también se ha relacionado con la patología humana, incluido el cáncer y las enfermedades neurogenerativas que involucran la activación global de sitios de empalme no canónicos25,26,27,44. Se demostró que solo unas pocas proteínas de unión al ARN, incluidas Rbm17, hnRNP y TP4326,27, amortiguan el empalme críptico a nivel mundial. Con base en el presente estudio, HP1 ahora se puede agregar a esta lista, con un papel fundamental en el epitelio intestinal. El efecto de la deficiencia de HP1γ en el empalme fue suficiente para inducir la producción de progerina, una variante de empalme normalmente reprimida del gen Lmna en ausencia de la mutación HGPS. De manera más general, los efectos de la inactivación de HP1γ en el empalme se explicaron por una reducción aparentemente general en la precisión del empalme. Esto fue documentado por los datos de RNA-seq, en los que las lecturas de unión se detectaron cada vez más en uniones de empalme no anotadas y en sitios con secuencias de consenso de donantes o aceptores muy pobres. El efecto también fue observable mediante PCR semicuantitativa, lo que produjo un conjunto complejo de productos en los ratones mutantes con cebadores que producían una sola especie a partir de los tejidos de tipo salvaje. Si bien esta menor rigurosidad en la selección del sitio de empalme puede tener múltiples causas, incluido un posible desacoplamiento entre la transcripción y el empalme, observamos que nuestro enfoque proteómico de los socios moleculares de HP1γ detectó numerosos factores de empalme que garantizan el uso de solo sitios de empalme genuinos. Estos incluían componentes del spliceosoma principal (dependiente de U2), así como factores de empalme auxiliares esenciales para el reconocimiento de secuencias consenso por parte del spliceosoma. Al examinar los datos de eliminación disponibles para algunos de estos factores de empalme, encontramos que su inactivación resultó en un ruido de empalme similar al observado tras la inactivación de Cbx3. Los factores de empalme examinados incluyeron el SRSF5 rico en Ser/Arg que anteriormente se demostró que reduce la producción de progerina al redirigir el empalme hacia la utilización de lamina A 5'SS37,45, PPL1, un componente del empalme similar a la peptidil prolil isomerasa cuya inactivación conduce a alteraciones del empalme con un uso aberrante de sitios de empalme débiles28, y también ZC3H13, una proteína con dedos de zinc que regula los niveles de ARN N6-metiladenosina29, una modificación involucrada en varios aspectos del metabolismo del ARN, incluido el empalme del ARN46,47,48. Por lo tanto, proponemos un modelo en el que HP1γ reduce el ruido de empalme al favorecer el reclutamiento en la plantilla de cromatina de proteínas involucradas en la precisión de las decisiones de empalme. La dependencia de HP1γ de los reguladores auxiliares del empalme también puede ilustrarse por su impacto regional en el empalme, posiblemente en función de los reguladores de empalme disponibles en cada tipo de tejido o célula. En particular, notamos un gradiente de expresión de progerina a lo largo del eje de la cripta-vellosidad, dejando de lado el compartimento ISC. Este último sugiere una modulación del empalme posiblemente relacionada con el estado de desarrollo celular, una noción respaldada por el modelo HGPS-iPSCs, en el que la progerina solo se observó tras el compromiso celular49. Si bien nuestros datos apuntan principalmente hacia un impacto de HP1γ a través del reclutamiento de spliceosomas, también se puede considerar una participación de HP1γ en la degradación de productos de empalme defectuosos, como sugiere la implicación del homólogo de levadura HP1 en el acompañamiento de transcripciones pericentroméricas a la maquinaria de descomposición del ARN50.

Antes de que el papel de HP1 se asociara con el empalme, esta proteína se conocía principalmente como mediadora del silenciamiento dependiente de heterocromatina, reprimiendo la transcripción en secuencias de ADN repetidas, incluidos los loci de ADNr, y en un subconjunto de promotores de genes2,17,51,52,53 . Nuestra inactivación de HP1γ en el intestino del ratón demostró claramente que la represión transcripcional dependiente de HP1 es esencial para la biología del intestino, ya que participa en el silenciamiento de los genes que controlan la proliferación y la inflamación. Estos experimentos también revelan un papel para HP1γ en los loci de rDNA, reprimiendo los genes ribosómicos durante la maduración de las células epiteliales. Sin embargo, a diferencia de lo que se observó previamente con la inactivación de la metiltransferasa H3K9 Setdb1 en el intestino20,21, o la triple desactivación de HP1α, HP1β y HP1γ en el hígado54 (Fig. 7 complementaria), la inactivación de HP1γ no afectó el silenciamiento de las bacterias endógenas. retrovirus (ERV), normalmente controlados por estructuras heterocromáticas intercaladas. Asimismo, la organización general de los cromocentros se conservó tras la inactivación de HP1γ. Sin embargo, la posibilidad de un impacto de la deficiencia de HP1γ en la integridad de las estructuras de heterocromatina sin pérdida global del estado de heterocromatina no puede excluirse en este punto.

En conclusión, nuestras observaciones ilustran las funciones homeostáticas de HP1γ involucradas en actividades esenciales tanto en la eucromatina como en la heterocromatina. El papel previamente descrito de HP1 en la longevidad de los tejidos en todas las especies53,55 puede estar en gran parte enraizado en esta polivalencia. Si bien ninguna enfermedad humana se ha relacionado claramente con las mutaciones del gen HP1, se informó una disminución de la expresión de HP1 en síndromes de envejecimiento acelerado, incluido el síndrome de Werner y HGPS56,57,58. De manera similar, identificamos una potente reducción de la expresión de HP1 en pacientes con CU, así como en modelos de ratón relevantes para esta enfermedad. A partir de nuestro modelo de ratón Cbx3 KO, concluimos que la deficiencia de HP1γ puede respaldar vías aberrantes que nutren tanto la inflamación como los defectos de empalme en genes homeostáticos clave. Del mismo modo, el aumento de la detección de progerina en el tejido del colon UC nos lleva a especular que, al igual que lo que observamos en los ratones Cbx3 KO, la variante de empalme de lamina A es solo la "punta del iceberg", indicativo de una alteración más extensa en el ARN. la precisión de empalme soportada por los pacientes con UC, y claramente ilustrada por la cohorte de pacientes de PROTECT UC. Todavía en su infancia con respecto a la enfermedad intestinal59,60,61, la identificación de mecanismos que se basan en disfunciones de empalme de ARN en el intestino crónicamente inflamado debería transformar nuestra comprensión de la disminución funcional en el epitelio intestinal de los pacientes con EII.

Se cruzaron ratones C57BL/6 Cbx3fl/fl (proporcionados por la Dra. Florence Cammas, IRCM, Montpellier, Francia) con ratones Villin-CreERT2 (proporcionados por el Dr. Cohen-Tannoudji, Institut Pasteur, París, Francia) para producir el C57BL/6 Villin- modelo de ratón creERT2:Cbx3-/- (este estudio). Los ratones C57BL/6 heterocigotos LmnaG609G/G609G (aquí denominados ratones HGPS) fueron proporcionados por la Dra. Maria Eriksson (Karolinska Institutet, Suecia). Los ratones machos y hembras fueron alimentados con una dieta estándar (SD) para roedores (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan) compuesta por un 60% de carbohidratos alimentados ad libitum. Los animales se mantuvieron bajo un ciclo de encendido/apagado de luz de 12 h/12 ​​h (8 am/8 pm), una temperatura de 22 °C ± 2 y una humedad entre 50 y 70 %. Se administró tamoxifeno (0,5 mg/g) diluido en ácido clinoleico al 20% por sonda oral, en 3 dosis cada 5 días como se describe62. Los ratones de control recibieron ácido clinoleico al 20% solo por sonda oral. Los controles adicionales que usaban ratones Cbx3fl/fl que no expresan la recombinasa Cre se trataron de manera idéntica con tamoxifeno. Todos los experimentos que utilizaron el modelo de ratón Villin-creERT2:Cbx3-/- se realizaron con ratones macho o hembra de 2 a 3 meses de edad. Se inyectó BrdU (Sigma) por vía intraperitoneal (ip) a 100 μg/g de peso corporal del animal, 1 h antes del sacrificio. Los estudios en animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Paris Descartes (número de autorización 17-022).

Todos los pacientes fueron seguidos en el Departamento de Gastroenterología (hôpital Beaujon, París). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética local (CPP-Ile de France IV No. 2009/17 y No2014-A01545-42) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la inscripción. Se obtuvo una biopsia de pellizco del colon que permitió la extracción de la capa epitelial durante la investigación endoscópica en áreas no inflamadas para permitir una comparación con tejidos sanos en la población de control. Las biopsias se realizaron en el colon derecho o izquierdo o, en caso de cáncer, a una distancia mínima de 10 cm del sitio del cáncer. Para el estudio inmunohistológico se incluyeron 26 pacientes, 10 controles sanos y 16 pacientes con CU (detalle de la población en Datos Suplementarios 1). Para el estudio transcripcional se incluyeron 56 pacientes, con 17 controles sanos, 19 pacientes con CU y 16 con EC con afectación colónica (detalle de la población proporcionado en Datos Suplementarios 12). El ARN total se extrajo de biopsias humanas con RNAble (Eurobio) y se cuantificó con un espectrofotómetro ND-1000 NanoDrop (NanoDrop Technologies). La transcripción inversa del ARNm total se realizó utilizando M-MLV RT (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Los pacientes con fibroblastos dérmicos humanos que portaban la mutación HGPS p.Gly608Gly se obtuvieron del Repositorio de células de Coriell. Se utilizó Caco2 (células TC7, autenticadas por ECACC) para generar la línea celular Cbx3 mediada por CRISPR/Cas9. El vector pSpCas9(BB)−2A-GFP (PX458) que expresa la endonucleasa Cas9 (obsequio de Feng Zhang, plásmido Addgene n.º 48138) se vinculó con un ARN de guía única (sgRNA) diseñado específicamente para el gen Cbx3. Se definieron dos guías de secuencia (GAAGAAAATTTAGATTGTCC y GAATATTTCCTGAAGTGGAA) mediante el software ZiFiT Targeter versión 4.2. La inserción de la guía de secuencia se realizó en el sitio de restricción BbsI del vector PX458 y se comprobó mediante secuenciación. La transfección en células TC7 se realizó mediante lipofectamine 2000 y se seleccionaron clones individuales para cada guía de secuencia mediante FACS de acuerdo con la señal de GFP. Las transfecciones en HEK293T se realizaron mediante precipitados de fosfato cálcico de ADN utilizando 5 µg del vector de expresión pLVX para tomate marcado con Flag-V5, SRp20, RBM39 o TRA2β63 y con 5 µg de pSG5-HA64.

El intestino (íleon o colon) se recogió y se lavó con PBS a 4 °C y se cortó en trozos de unos 5 mm. Los fragmentos intestinales se fijaron con formalina durante la noche a 4 °C. Una vez fijados, los fragmentos intestinales se incluyeron en bloques de parafina. Los cortes en parafina se realizaron en un micrótomo Leica RM2125 RTS, con un espesor de 4 μm. Posteriormente, se realizó la desparafinización y rehidratación de las muestras por inmersión en Xileno (2 × 10 min), etanol absoluto 5 min, etanol 90% 5 min, etanol 70% 5 min y agua destilada (2 × 5 min), todos a TA Finalmente, el antígeno se desenmascaró utilizando la técnica de ebullición con EDTA durante 30 min a 95 °C, seguido de 20 min a TA Todas las muestras se trataron secuencialmente con glicina 0,1 M en PBS durante 15 min, BSA al 3 % en PBS durante 30 min y Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 2 h (tejido de ratón). En caso de tinción con nucleolina, las secciones de tejido se incubaron durante 1 min a TA con proteinasa K 0,05 mg/ml, seguido de un lavado con glicina 2 mg/ml durante 15 min a TA. Luego se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C, se lavaron con Tween-20 al 0,05 % en PBS, se incubaron durante 1 h en el anticuerpo secundario específico conjugado con Alexa 488 o Cy3 (Jackson, EE. UU.), 15 min con DAPI (1 μg /ml), lavado en PBS y montado con el medio antidecoloración VECTASHIELD® (Vector Laboratories). Anti-HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific), HP1α (2H4E9, Novus Biologicals), Ki67 (ab16667, Abcam), Olmf4 (D6Y5A, señalización celular), BrdU (MA3-071) como anticuerpos primarios. Los núcleos se tiñeron usando 4, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 62248, Thermo Scientific).

Las imágenes de microscopía se obtuvieron con un microscopio de iluminación estructurada ZEISS Aptome.2 (Zeiss, Alemania), utilizando un objetivo de aceite de 63x (1,4 NA). Para evitar la superposición de señales, las imágenes se obtuvieron mediante excitación secuencial a 488 y 543 nm para detectar A488 y Cy3, respectivamente. Las imágenes se procesaron con el software ZEISS ZEN lite. El análisis cuantitativo de la señal de inmunofluorescencia se realizó en ImageJ. Los valores se representan con la intensidad de fluorescencia media, en relación con las muestras de control.

La técnica se adaptó de Nigro et al., 201965. Se recogieron intestino delgado o colon, se lavaron con PBS a 4 °C y se cortaron en trozos de unos 5 mm de longitud. Para el aislamiento epitelial, los fragmentos intestinales se incubaron durante 30 min a 4 °C en EDTA 10 mM, después de lo cual se transfirieron a BSA al 0,1 % en PBS y se agitaron durante 30–60 s. Los sobrenadantes (que contenían las células epiteliales) se filtraron con un filtro de células de 70 µm. En este paso, las criptas pasaron por el filtro de células y las vellosidades quedaron retenidas en él. A continuación, las fracciones de cripta y vellosidad se centrifugaron por separado y los gránulos se congelaron en nitrógeno líquido hasta que se procesaron. Se accedió a la calidad de la separación mediante la expresión de expresión selectiva de marcadores de tallo en las criptas pero no en las vellosidades, según lo confirmado por secuenciación de ARN. Para la producción de organoides, el sedimento de la cripta se desagregó y se cultivó en Matrigel como se describe65. La tinción de EdU se realizó con el kit de proliferación de células Click-iT™ EdU para imágenes (Thermo Fisher), siguiendo las indicaciones del fabricante.

En las células TC7, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizó mediante el método de criofijación/sustitución por congelación. Las células se fijaron durante la noche a 4 °C con paraformaldehído al 3,7 %, glutaraldehído al 1 %, en tampón de cacodilato 0,1 M. Después de la fijación, las células se sedimentaron y contrastaron con tetróxido de osmio (OsO4) y acetato de uranilo. Luego, las células se incluyeron en medio de sustitución por congelación durante al menos 3 días a -80 °C, se deshidrataron en concentraciones crecientes de metanol a -20 °C, se incluyeron en Lowicryl K4 M a -20 °C y se polimerizaron con radiación ultravioleta. Las secciones ultrafinas se montaron en rejillas de níquel, se tiñeron con citrato de plomo y acetato de uranilo y se examinaron con un microscopio electrónico JEOL 1011.

Los fragmentos de tejido intestinal de alrededor de 500 mm se fijaron durante la noche a 4 °C con paraformaldehído al 3,7 %, glutaraldehído al 1 % en tampón de cacodilato 0,1 M durante la noche a 4 °C. Se lavaron pequeños fragmentos de tejido en tampón de cacodilato 0,1 M, se deshidrataron en concentraciones crecientes de metanol a -20 °C, se incluyeron en Lowicryl K4 M a -20 °C y se polimerizaron con radiación ultravioleta. Se montaron secciones ultrafinas.

El ARN total se extrajo usando Trizol (TR-118, Molecular Research Center, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante y el tratamiento con ADNasa. Las muestras de ARN se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro (Nanodrop Technologies ND-1000). El ADNc de primera hebra se sintetizó mediante RT-PCR utilizando un kit de síntesis de ADNc de primera hebra RevertAIT H Minus (Thermo Scientific). qPCR se realizó utilizando el sistema Mx3005P (Stratagene) con accesorio de automatización. Para la PCR semicuantitativa de progerina y lamina A de ratón, se utilizaron cebadores anidados en el exón 9 y 12 (F: GTGGAAGGCGCAGAACACCT R: GTGAGGGGGGAGCAGGTG), como se informó66. Para la amplificación por PCR en tiempo real, se utilizó el ensayo TaqMan con cebadores prediseñados para GAPDH de ratón (Mm99999915_g1), lamina A de ratón que no reconoce la progerina o el ADN (ID del ensayo: APGZJEM), progerina de ratón (F: ACTGCAGCGGCTCGGGG R: GTTCTGGGAGGCTCTGGGCT y sonda: CGCTGAGTACAACCT). Estos pares de cebador-sonda se utilizaron además para el ensayo TaqMan ddPCR en muestras de ADNc. La PCR digital de gotas (ddPCR) se realizó en muestras de ADNc utilizando el ensayo basado en sonda TaqMan descrito anteriormente para lmna de ratón y progerina con ddPCR Supermix para sondas (Bio-Rad). Se generaron gotas a partir de la mezcla de reacción usando un generador de gotas (Bio-Rad QX200). La amplificación por PCR se realizó de la siguiente manera: después de la activación de la enzima 95 °C durante 10 min (1 ciclo), 50 ciclos de dos pasos durante 20 s a 95 °C, 40 s a 60 °C, seguido de desactivación de la enzima 10 min a 98 ° C. Las gotitas de PCR se midieron en el lector de gotitas automatizado (Bio-Rad QX200). El recuento de transcritos sin procesar por μl se calculó mediante el software Quantasoft (Bio-Rad). Para cada muestra y transcripciones, se realizaron al menos dos experimentos repetidos.

Para detectar lamina A y progerina en cDNA humanos, los pares cebador-sonda fueron los siguientes: lamina A humana (F: TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG R: AGTTCTGGGGGCTCTGGGT y sonda ACTCGCAGCTACCG), progerina humana (F: ACTGCAGCAGCTCGGGG R: TCTGGGGGCTCTGGGCTCCT y sonda CGCTGAGTACAACCT), GAPDH humana (Hs00266705_g1). Para la qPCR basada en SYBRGreen (Takara), se han utilizado los siguientes cebadores: ratón Ascl2 (F: GGT GAC TCC TGG TGG ACC TA; R: TCC GGA AGA TGG AAG ATG TC) ratón Olfm4 (F:ATC AGC GCT CCT TCT GTG AT R: AGG GTT CTC TCT GGA TGC TG) ratón TNF-α (F: GATCTCAAAGACAACCAACATGTG R: CTCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG) ratón IL1-β (F:TACAGGCTCCGAGATGAACAAC R: TGCCGTCTTTCATTACACAGGA) ratón IL6 (F: ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTT R: CAGGTCTGTTGGGAGTGGTATC) ratón Sacarasa isomaltasa (F: CGTGCAAATGGTGCCGAATA R: TCCTGGCCA TACCTCTCCAA) GAPDH (F: TGACCACAGTCCATGCCATC; R: GACGGACACATTGGGGGTAG) ratón 45 S (F: GAACGGTGGTGTGTCGTT; R: GCGTCTCGTCTCGTCTCACT). Ratón 18 S: (F: GATGGTAGTCGCCGTGCC; R: CCAAGGAAGGCAGCAGGC).

Para la validación de empalme en tejidos intestinales de ratón, se utilizó el paquete MAJIQ para detectar genes empalmados diferencialmente entre Cbx3 KO y los ratones Ctrl. Para cada muestra, se usaron recuentos de lecturas que cubrían las uniones indicadas para calcular la proporción de cada unión que involucraba los exones fuente y objetivo, y se representaron como histogramas de porcentaje de la variante indicada. El índice de empalme (Δψ) se calculó usando la fórmula Δψ = variante1/(variante1 + variante2) y se representó como una relación o un porcentaje como se indica en las Figs. Las 6 muestras de RNA-seq se utilizaron para calcular los promedios (± desviación) y el valor de p con la prueba t de Student (bilateral): P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 ( ***). Los cebadores utilizados para las validaciones de empalme se describen en la Tabla complementaria 1 en Información complementaria.

El ARN total se extrajo del control y las células epiteliales Cbx3 KO del intestino delgado (criptas y vellosidades) y del epitelio del colon (n = 3 para cada grupo de ratones, por lo que en total 6 × 3 = 18 muestras de ARN) por tiocianato de guanidinio-fenol- extracción con cloroformo y tratamiento con ADNasa, siguiendo las especificaciones del fabricante. La preparación y la secuenciación de la biblioteca de ARN total fueron realizadas por Novogene Co., Ltd, como un servicio de secuenciación de lncRNA, incluida la preparación de la biblioteca direccional de lncRNA con agotamiento de rRNA (Kit magnético Ribo-Zero), cuantificación, agrupación y secuenciación PE 150 (datos sin procesar de 30 G) en la plataforma Illumina HiSeq 2500. El filtrado y el recorte de los datos de secuenciación de ARN dejaron alrededor de 230 a 300 millones de pares de lecturas/muestra.

El análisis de expresión génica y el análisis de empalme diferencial fueron realizados por Novogene Co., Ltd, utilizando el paquete DESeq2 (v1.18.1)67 y rMATS (v4.1.0)68 (parámetros: --libType fr-firststrand –novelSS), respectivamente, en el genoma de referencia del ratón mm10. Para evaluar los sitios de empalme crípticos, los datos de RNA-seq internos y los datos de Rbm17 KO RNA-seq disponibles públicamente (GEO GSE79020) se realinearon en el archivo de anotación mm9 del ratón de Ensembl (versión 67). Los datos de RNA-seq de la cohorte PROTECT se alinearon en el archivo de anotación GRCh37/hg19 humano de Ensembl. Los archivos BAM resultantes se usaron para generar archivos de peces gordos, usando bamCoverage (parámetro: --normalizeUsing CPM) de Deeptools (v3.1.3)69. Luego, las coordenadas de los cruces anotados y no anotados se recuperaron de los archivos BAM utilizando regtools (https://github.com/griffithlab/regtools). Para cada una de las 6 condiciones, se agruparon las uniones no anotadas de las 3 réplicas, antes de eliminar las uniones presentes en las condiciones WT y KO. Finalmente, las uniones que abarcan más de 20 kb se filtraron como posibles artefactos de la alineación. Las uniones restantes, nunca compartidas entre WT y muestras mutantes, se consideraron de novo. Para cuantificar la fuerza de los sitios de empalme, se recuperaron secuencias de ADN que comprenden los últimos 3 nucleótidos del exón y los primeros 6 nucleótidos del intrón para el extremo 5' de la unión. Para el extremo 3' de la unión se recuperaron las secuencias de los últimos 20 nucleótidos del intrón y los primeros 3 nucleótidos del exón. Luego, se calculó la fuerza de los sitios de empalme para cada unión utilizando el algoritmo MaxEnt69. El algoritmo MaxEnt también se aplicó a uniones aleatorias generadas mediante la aplicación de la función "shuffle" de la suite bedtools (v.2.25.0)70 a los archivos de lecho que contenían uniones de novo.

Para la cuantificación de elementos LTR, los datos internos de RNA-seq y HP1 triple KO RNA-seq (GEO GSE119224) se mapearon en el genoma de ratón mm10 con anotación Ensembl (versión 95) usando STAR (v2.6.0b)71 (Parámetros: - -outFilterMismatchNmax 1 --outSAMmultNmax 1 --outFilterMultimapNmax 30). La cuantificación de lectura en las diferentes familias LTR se realizó con featureCounts (v1.6.1)72 de la suite Subread (parámetros: -s 2 para GSE119244 y parámetros: -p -B -C -s 2 para Colon, Crypt y Villi). Las familias LTR (ERK, ERV1, ERVL y ERL-MaLR) se recuperaron del UCSC mm10 RepeatMasker.

Se realizó un análisis GSEA (con -nperm 1000 -permute gene_set -collapse false parameters) usando la misma matriz de expresión (v2.2.2), comparando muestras ctrl y Cbx3 KO en la cripta, las vellosidades y el colon. Las firmas transcripcionales utilizadas para el análisis se extrajeron de la literatura para la firma lgr5 ISC73, las firmas de enterocitos y células Paneth74 y las bases de datos GSEA (conjunto de genes distintivos MSigDB).

El ADN genómico se obtuvo de muestras fecales utilizando el kit QIAamp power fecal DNA (Qiagen), y la cantidad de ADN se determinó utilizando un fluorómetro TECAN (Qubit® dsDNA HS Assay Kit, Invitrogen). La región hipervariable V3-V4 del gen 16 S rRNA se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: un cebador de fusión directa de 43 nucleótidos 5′CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TAC GGR AGG CAG CAG3 que consta de 28 nt illumina (fuente en negrita) y el cebador bacteriano de amplio rango de 14 nt 343 F y una fusión inversa de 47 nucleótidos 5′GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TTA CCA GGG TAT CTA ATC CT3′ que consta del adaptador illumina de 28 nt ( negrita) y el cebador bacteriano de amplio rango de 19 nt 784 R. Las reacciones de PCR se realizaron usando 10 ng de ADN, cebadores 0,5 µM, dNTP 0,2 mM y 0,5 U de la polimerasa Taq libre de ADN, MolTaq 16 S DNA Polimerasa (Molzym). Las amplificaciones se realizaron utilizando el siguiente perfil: 1 ciclo a 94 °C por 60 s, seguido de 30 ciclos a 94 °C por 60 s, 65 °C por 60 s, 72 °C por 60 s, y finalizando con un paso a 72 ° C durante 10 min. Las reacciones de PCR se enviaron a la plataforma @Bridge (INRAe, Jouy-en-Josas) para su secuenciación utilizando la tecnología Illumina Miseq. La multiplexación simple se realizó utilizando un índice casero de 6 pb, que se agregaron a R784 durante una segunda PCR con 12 ciclos usando un cebador directo (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) y un cebador inverso (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-índice GTGACTGGAGTTCAGACGTGT). Los productos de PCR resultantes se purificaron y cargaron en el cartucho Illumina MiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad de la corrida se verificó internamente usando PhiX y luego se asignaron secuencias a su muestra con la ayuda del índice previamente integrado. Las lecturas filtradas de alta calidad se ensamblaron y procesaron utilizando la canalización FROGS (Find Rapidly OTU with Galaxy Solution) para obtener las OTU y su respectiva asignación taxonómica gracias a la instancia Galaxy (https://migale.inra.fr/galaxy). En cada conjunto de datos, más del 97 % de las secuencias de extremos emparejados se ensamblaron utilizando al menos una superposición de 10 pb entre las secuencias directa e inversa. Los siguientes pasos sucesivos implicaron eliminar el ruido y agrupar las secuencias en OTU utilizando SWARM, eliminando quimeras utilizando VSEARCh. Luego, las abundancias de los racimos se filtraron al 0,005 %. El cien por ciento de los conglomerados se afiliaron a OTU mediante el uso de una base de datos de referencia silva138 16 S y el procedimiento de asignación taxonómica del clasificador RDP (Ribosomal Database Project). Los índices de riqueza y diversidad de la comunidad bacteriana, así como la agrupación y las ordenaciones, se calcularon utilizando el paquete Phyloseq (v 1.19.1) en el software RStudio75. La divergencia en la composición de la comunidad entre las muestras se evaluó cuantitativamente mediante el cálculo del índice de diversidad β (UniFrac y matrices de distancia UniFrac ponderadas). Para el mapa de calor, se ajustó un modelo binomial negativo a cada OTU, utilizando DESeq267 con parámetros predeterminados, para estimar los cambios logarítmicos (FC) de abundancia. Los valores de P se corrigieron para pruebas múltiples mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de falsos descubrimientos y se seleccionaron UTO significativas en función del tamaño del efecto (FC > | 2 | , valor de P ajustado < 0,05).

Los eluatos de inmunoprecipitación se digirieron siguiendo un protocolo FASP76 ligeramente modificado. Brevemente, las proteínas se redujeron utilizando DTT 100 mM (ditiotreitol) durante 1 hora a 60 °C. Las proteínas se alquilaron durante 30 min mediante incubación en la oscuridad a temperatura ambiente con 100 µl de yodoacetamida 50 mM. Las muestras se digirieron con 2 µL de tripsina modificada de grado de secuenciación (Promega, WI, EE. UU.) durante 16 h a 37 °C. Los péptidos se recogieron mediante centrifugación a 15 000 × g durante 10 min, seguido de un lavado con bicarbonato de amonio 50 mM y secado al vacío.

Los péptidos se resuspendieron en 21 µl de ACN al 10 %, TFA al 0,1 % en agua de grado HPLC antes del análisis de MS. Para cada ejecución, se inyectaron 5 µL en un nanoRSLC-Q Exactive PLUS (RSLC Ultimate 3000) (Thermo Scientific, Waltham MA, EE. UU.). Los péptidos se cargaron en una precolumna µ (Acclaim PepMap 100 C18, cartucho, 300 µm de d.i. x 5 mm, 5 µm) (Thermo Scientific), y se separaron en una columna de cromatografía líquida de fase inversa de 50 cm (0,075 mm de D.I., Acclaim PepMap 100, C18, 2 µm) (Thermo Scientific). Los disolventes de cromatografía fueron (A) ácido fórmico al 0,1 % en agua y (B) acetonitrilo al 80 %, ácido fórmico al 0,08 %. Los péptidos se eluyeron de la columna con el siguiente gradiente 5–40 % B (38 min), 40–80 % (1 min). A los 39 min, el gradiente se mantuvo al 80 % durante 4 min y, a los 43 min, volvió al 5 % para reequilibrar la columna durante 16 min antes de la siguiente inyección. Se corrieron dos blancos entre cada serie para evitar el arrastre de muestras. Los péptidos que eluyeron de la columna se analizaron mediante MS/MS dependiente de los datos, usando el método de adquisición top-10. Los péptidos se fragmentaron utilizando disociación por colisión de mayor energía (HCD). Brevemente, la configuración del instrumento fue la siguiente: la resolución se fijó en 70 000 para exploraciones de MS y 17 500 para exploraciones de MS/MS dependientes de datos con el fin de aumentar la velocidad. El objetivo de AGC de MS se estableció en 3,106 conteos con un tiempo de inyección máximo establecido en 200 ms, mientras que el objetivo de AGC de MS/MS se estableció en 1,105 con un tiempo de inyección máximo establecido en 120 ms. El rango de exploración de MS fue de 400 a 2000 m/z.

Los archivos sin procesar correspondientes a las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron utilizando el software MaxQuant 1.5.5.1 contra la base de datos Human Uniprot KB/Swiss-Prot 2016-0177. Para buscar la masa principal y los iones de fragmentos, establecemos una desviación de masa de 3 ppm y 20 ppm respectivamente, no se permiten coincidencias entre ejecuciones. La carbamidometilación (Cys) se estableció como modificación fija, mientras que la oxidación (Met) y la acetilación N-term se establecieron como modificaciones variables. Las tasas de descubrimiento falso (FDR) a nivel de proteína y péptido se establecieron en 1%. Las puntuaciones se calcularon usando MaxQuant como se describió anteriormente77. Los péptidos se cuantificaron según las intensidades de señal de MaxQuant MS1. Los análisis estadísticos y bioinformáticos, incluido el gráfico de volcanes, se realizaron con el software Perseus versión 1.6.7.0 (disponible gratuitamente en www.perseus-framework.org). Para la comparación estadística, establecimos dos grupos, IP y control negativo, cada uno con 3 réplicas biológicas. Luego retuvimos solo las proteínas que se cuantificaron 3 veces en al menos un grupo. A continuación, los datos se imputaron para completar los puntos de datos faltantes mediante la creación de una distribución gaussiana de números aleatorios con una desviación estándar del 33 % en relación con la desviación estándar de los valores medidos y un cambio descendente de 3 desviaciones estándar de la media para simular la distribución de señal baja. valores. Realizamos una prueba T y representamos los datos en un gráfico de volcán (FDR < 0.05, S0 = 1).

HEK293T (CRL-1573, ATCC) o células HeLa (CCL-2, ATCC) se extrajeron en tampón TNEN300:0,1 (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM, NP40 al 0,1 %, 1 U/µl de ARNasina (Promega), 1X inhibidor de la proteasa (Roche)) durante 30 min en hielo con resuspensión a través del calibre de la jeringa. La cromatina desnaturalizada se eliminó mediante pipeteo. Los extractos se diluyeron a NaCl 150 mM y la mitad se complementó con 0,2 µg/ml de RNasaA (sin DNasa, Roche) o con 0,1 U/µL de RNasa. Una cuarta parte de la placa de 10 cm se inmunoprecipitó durante la noche a 4 °C sobre una rueda con 3 µg de anticuerpos anti-V5 para células HEK293 transfectadas y con 1,5 µg de anticuerpos anti-SRSF1 para células HeLa. Los complejos se recuperaron con dynabeads de proteína G (Dynal) durante 2 h a 4 ° C en la rueda. Las perlas se lavaron 5 veces en 1 mL de TNEN150:0.1 durante 7 min a 4 °C en rueda antes de la desnaturalización en tampón de carga a 100 °C durante 10 min. Las proteínas se resolvieron en SDS-PAGE Criterion 4–12% (Bio-Rad).

Las células epiteliales intestinales purificadas de ratones (al menos n = 3 experimentos separados) se lisaron a 4 °C en un tampón que contenía Tris 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 0,1 mM, MgCl2 5 mM, NP-40 al 1 %, 10 % de glicerol, NaCl 150 mM y luego se aclara por centrifugación a 14.000 rpm durante 30 min a 4 °C. Las proteínas se separaron en geles SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante procedimientos estándar. Se han utilizado los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-progerina de ratón (13A4DA, sc-81611, Santa Cruz, dilución 1/50), anti-HP1α (2H4E9, Novus Biologicals, dilución 1/100), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific, dilución 1/100) y anticuerpos HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific, dilución 1/100) y γ tubulina (4D11, Thermo Scientific, dilución 1/2000). anti-HA (12CA5, Sigma, Dilución 1/1000), anti-Flag M2 (Sigma, dilución 1/1000), anti-V5 (Bethyl A190-120A, dilución 1/1000), anti-SRSF1 (Santa Cruz sc- 33652, dilución 1/250), anticuerpos anti-Rabbit IgG Bright700 (BioRad, dilución 1/5000), anti-Mouse IgG Bright700 (BioRad, dilución 1/5000). La señal de transferencia Western se adquirió con Chemidoc Imaging (Bio Rad).

Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism. Las diferencias entre los grupos se ensayaron utilizando una prueba t de Student bilateral utilizando GraphPad Prism. En todos los casos, se supuso que los datos experimentales cumplían con los requisitos de la prueba t (distribución normal y varianza similar); en aquellos casos en los que el supuesto de la prueba t no era válido, se utilizó un método estadístico no paramétrico (prueba de Mann-Whitney). Las diferencias entre tres o más grupos se probaron mediante ANOVA de una vía. Se consideró significativo un valor de p < 0,05. Las barras de error indican el error estándar de la media.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq, los archivos mm9.bigwig derivados y los archivos de novo junction.bed generados en este estudio se han depositado en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la serie GEO GSE192800. Los datos de proteómica se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD031580. Los datos de secuenciación del gen 16 S rRNA generados en este estudio están disponibles a través de los números de acceso de BioProject PRJNA803986.

Los archivos fastq sin procesar de RNA-seq de GSE109142 (cohorte UC PROTECT), GSE145309 (ratón ES Crispr KO Zc3h13) y GSE119244 (triple knock-out de hígado de ratón HP1α, HP1β y HP1γ) se obtuvieron de la base de datos GEO de NCBI. PRJNA669300 (cerebros Ppil1A99T/A99T KI E14.5) y PRJNA708182 (corazón de ratón SRSF5 KO) se obtuvieron de la base de datos de BioProject. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Annese, V. Genética y epigenética de la EII. Farmacia Res. 159, 104892 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Haruz, H. et al. Shigella flexneri se dirige al subcódigo HP1γ a través de la fosfotreonina liasa OspF. EMBO J. 33, 2606–2622 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allshire, RC & Madhani, HD Diez principios de formación y función de la heterocromatina. Nat. Rev Mol. Biol celular. 19, 229–244 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Casale, AM, Cappucci, U., Fanti, L. y Piacentini, L. La proteína 1 de heterocromatina (HP1) es intrínsecamente necesaria para la regulación postranscripcional del mantenimiento de células madre de línea germinal (GSC) de Drosophila. ciencia Rep. 9, 4372–12 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rachez, C. et al. Las repeticiones intrónicas de pre-ARNm de unión a HP1γ modulan las decisiones de corte y empalme del ARN. EMBO Rep. 22, e52320 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saint-André, V., Batsche, E., Rachez, C. & Muchardt, C. La trimetilación de histona H3 lisina 9 y HP1γ favorecen la inclusión de exones alternativos. Nat. Estructura. mol. Biol. 18, 337–344 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Smallwood, A. et al. CBX3 regula el procesamiento eficiente del ARN en todo el genoma. Genoma Res. 22, 1426–1436 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yearim, A. et al. HP1 participa en la regulación del impacto global de la metilación del ADN en el empalme alternativo. Representante celular 10, 1122–1134 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Treton, X. et al. La deficiencia combinada de NADPH oxidasa 1 e interleucina 10 induce estrés crónico del retículo endoplásmico y causa una enfermedad similar a la colitis ulcerosa en ratones. PLoS ONE 9, e101669 (2014).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y.-H. & Ann, DK Expresión bifásica de la proteína 1 de heterocromatina (HP1) durante la progresión del cáncer de mama: funciones potenciales de HP1 y la estructura de la cromatina en la tumorigénesis. J.Nat. ciencia 1, e127 (2015).

PubMed PubMed Central Google Académico

Fan , Y. , Li , H. , Liang , X. & Xiang , Z. CBX3 promueve la proliferación de células de cáncer de colon mediante la función independiente de la quinasa CDK6 durante el ciclo celular . Oncotarget 8, 19934–19946 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Oyama, K. et al. La eliminación de HP1γ en los miocitos cardíacos afecta los niveles de H4K20me3 pero no afecta el crecimiento cardíaco. epigeneto. Cromatina 11, 18–15 (2018).

Artículo Google Académico

Zeng, MY, Inohara, N. & Nuñez, G. Mecanismos de la disbiosis bacteriana provocada por la inflamación en el intestino. inmunol. de mucosas. 10, 18–26 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zong, X., Fu, J., Xu, B., Wang, Y. y Jin, M. Interacción entre la microbiota intestinal y los péptidos antimicrobianos. Animación Nutrición 6, 389–396 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Greuter, T. et al. Diferencias de género en la enfermedad inflamatoria intestinal. Digestión 101 (Suplemento 1), 98–104 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Halfvarson, J. et al. Dinámica del microbioma intestinal humano en la enfermedad inflamatoria intestinal. Nat. Microbiol 2, 17004–17007 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nielsen, SJ et al. Rb se dirige a la metilación de la histona H3 y HP1 a los promotores. Naturaleza 412, 561–565 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Carroll, TD, Newton, IP, Chen, Y., Blow, JJ y Näthke, I. Las células madre intestinales Lgr5+ residen en una fase G1 sin licencia. J. Cell Biol. 217, 1667–1685 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altmann, GG Una disminución gradual en el tamaño nucleolar con la maduración de las células epiteliales columnares en el intestino de rata adulta bajo condiciones normales y experimentales diversas. J. celular. ciencia 77, 289–304 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, R. et al. La necroptosis de las células madre intestinales por inestabilidad del genoma desencadena la inflamación intestinal. Naturaleza 580, 386–390 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Južnić, L. et al. SETDB1 es necesario para la diferenciación epitelial intestinal y la prevención de la inflamación intestinal. Tripa 70, 485–498 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Ameyar-Zazoua, M. et al. Las proteínas Argonaute acoplan el silenciamiento de la cromatina al empalme alternativo. Nat. Estructura. mol. Biol. 19, 998–1004 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wan, Y. & Larson, DR Heterogeneidad de empalme: separando la señal del ruido. Genoma Biol. 19, 86–10 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Chen, L., Tovar-Corona, JM & Urrutia, AO Aumento de los niveles de empalme ruidoso en los cánceres, pero no para las transcripciones derivadas de oncogenes. Tararear. mol. Gineta. 20, 4422–4429 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoshida, K. et al. Mutaciones frecuentes de la vía de la maquinaria de empalme en la mielodisplasia. Naturaleza 478, 64–69 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Tan, Q. et al. Empalme críptico extenso tras la pérdida de RBM17 y TDP43 en modelos de neurodegeneración. Tararear. mol. Gineta. 25, 5083–5093 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Humphrey, J., Emmett, W., Fratta, P., Isaacs, AM y Plagnol, V. Análisis cuantitativo del empalme críptico asociado con el agotamiento de TDP-43. BMC Med. genoma 10, 38–17 (2017).

Artículo Google Académico

Chai, G. et al. Las mutaciones en los genes spliceosomales PPIL1 y PRP17 causan hipoplasia pontocerebelosa neurodegenerativa con microcefalia. Neurona 109, 241–256.e9 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wen, J. et al. Zc3h13 regula la metilación del ARN nuclear m6A y la autorrenovación de células madre embrionarias de ratón. mol. Celda 69, 1028–1038.e6 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chelmicki, T. et al. La metilación del ARN m6A regula el destino de los retrovirus endógenos. Naturaleza 591, 312–316 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhang, X. et al. La eliminación del factor de empalme Srsf5 interrumpe el empalme alternativo y provoca la falta de compactación del miocardio ventricular. iScience 24, 103097 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sol, X. et al. La PKM2 epitelial intestinal sirve como protección contra la colitis experimental mediante la activación de la señalización de β-catenina. inmunol. de mucosas. 12, 1280–1290 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Grill, JI, Neumann, J., Hiltwein, F., Kolligs, FT & Schneider, MR La deficiencia intestinal de cadherina electrónica agrava la colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano. Excavar. Dis. ciencia 60, 895–902 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sharma, S., Liao, W., Zhou, X., Wong, DTW y Lichtenstein, A. La omisión del exón 11 del ARN de E-cadherina regula a la baja su expresión en las células cancerosas de cabeza y cuello. mol. Cáncer Ther. 10, 1751-1759 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eriksson, M. et al. Las mutaciones puntuales recurrentes de novo en la lámina A causan el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford. Naturaleza 423, 293–298 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Scaffidi, P. & Misteli, T. Lamin Defectos nucleares dependientes de A en el envejecimiento humano. Ciencia 312, 1059–1063.

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vautrot, V. et al. La expresión mejorada de la proteína SRSF5 refuerza la producción de ARNm de lamina A en células HeLa y fibroblastos de pacientes con progeria. Tararear. Mutat. 37, 280–291 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Goldman, RD et al. La acumulación de lámina A mutante provoca cambios progresivos en la arquitectura nuclear en el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 101, 8963–8968 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haberman, Y. et al. Los transcriptomas de la mucosa de la colitis ulcerosa revelan mitocondriopatía y mecanismos personalizados que subyacen a la gravedad de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. Nat. común 10, 38–13 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scotti, MM & Swanson, MS Empalme incorrecto de ARN en enfermedades. Nat. Rev. Genet. 17, 19–32 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dong, Y., Cirimotich, CM, Pike, A., Chandra, R. & Dimopoulos, G. Anopheles Los factores de empalme regulados por NF-κB dirigen los repertorios específicos de patógenos del receptor de reconocimiento de patrones hipervariable AgDscam. Microbio huésped celular 12, 521–530 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hattori, D. et al. La discriminación robusta entre neuritas propias y no propias requiere miles de isoformas Dscam1. Naturaleza 461, 644–648 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickrell, JK, Pai, AA, Gilad, Y. & Pritchard, JK El empalme ruidoso impulsa la diversidad de isoformas de ARNm en células humanas. PLoS Genet. 6, e1001236 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hsieh, Y.-C. et al. La Interrupción Mediada Por Tau Del Empalme Del Spliceosoma Desencadena El Empalme Críptico Del ARN Y La Neurodegeneración En La Enfermedad De Alzheimer. Informe celular 29, 301–316.e10 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fong, LG et al. Activación de la síntesis de progerina, la prelamina A mutante en el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, con oligonucleótidos antisentido. Tararear. mol. Gineta. 18, 2462–2471 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao, W. et al. El lector nuclear m(6)A YTHDC1 regula el empalme del ARNm. mol. Celda 61, 507–519 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Haussmann, IU et al. m6A potencia el empalme de pre-ARNm alternativo de Sxl para la determinación sólida del sexo de Drosophila. Naturaleza 540, 301–304 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhao, BS, Roundtree, IA y He, C. Regulación génica postranscripcional mediante modificaciones del ARNm. Nat. Rev Mol. Biol celular. 18, 31–42 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liu, G.-H. et al. Recapitulación del envejecimiento prematuro con iPSC del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford. Naturaleza 472, 221–225 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keller, C. et al. HP1 (Swi6) media el reconocimiento y la destrucción de las transcripciones de ARN heterocromático. mol. Celda 47, 215–227 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Eissenberg, JC et al. La mutación en una proteína cromosómica específica de heterocromatina está asociada con la supresión de la variación del efecto de posición en Drosophila melanogaster. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 87, 9923–9927 (1990).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanulli, S. et al. HP1 remodela el núcleo del nucleosoma para promover la separación de fases de la heterocromatina. Naturaleza 575, 390–394 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Larson, K. et al. La formación de heterocromatina promueve la longevidad y reprime la síntesis de ARN ribosomal. PLoS Genet. 8, e1002473 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saksouk, N. et al. Las proteínas HP1 de ratón son esenciales para prevenir la tumorigénesis hepática. Oncogen 39, 2676–2691 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jeon, H.-J. et al. Efecto de la estabilidad de la heterocromatina sobre el envejecimiento de las células madre intestinales en Drosophila. mecánico Desarrollo de envejecimiento 173, 50–60 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, W. et al. Envejecimiento de células madre. Un modelo de células madre del síndrome de Werner revela alteraciones de la heterocromatina como impulsoras del envejecimiento humano. Ciencia 348, 1160–1163 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shumaker, DK et al. La lámina nuclear mutante A conduce a alteraciones progresivas del control epigenético en el envejecimiento prematuro. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 103, 8703–8708 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scaffidi, P. & Misteli, T. Desregulación dependiente de Lamin A de las células madre adultas asociadas con el envejecimiento acelerado. Nat. Biol celular. 10, 452–459 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Häsler, R. et al. Alteraciones del empalme de pre-ARNm en la enfermedad inflamatoria intestinal humana. EUR. J. Cell Biol. 90, 603–611 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Häsler, R. et al. Desacoplamiento de la regulación génica de la mucosa, empalme de ARNm y firmas de microbiota adherente en la enfermedad inflamatoria intestinal. Tripa 66, 2087–2097 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Berger, K., Somineni, H., Prince, J., Kugathasan, S. y Gibson, G. Empalme alterado asociado con la patología de la enfermedad inflamatoria intestinal. Tararear. genoma 15, 47–10 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Le Gallou, S., Nojima, T., Kitamura, D., Weill, J.-C. & Reynaud, C.-A. El modelo AID-Cre-ERT2: una herramienta para monitorear las respuestas inmunes de las células B y generar hibridomas selectivos. Métodos Mol. Biol. 1623, 243–251 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mauger, O. et al. El empalme alternativo regula la expresión de las metiltransferasas G9A y SUV39H2 y cambia drásticamente las funciones de SUV39H2. Ácidos Nucleicos Res. 43, 1869–1882 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seeler, JS, Marchio, A., Sitterlin, D., Transy, C. & Dejean, A. Interacción de SP100 con proteínas HP1: un vínculo entre los cuerpos nucleares asociados con la leucemia promielocítica y el compartimiento de cromatina. proc. Academia Nacional. ciencia USA 95, 7316–7321 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nigro, G., Hanson, M., Fevre, C., Lecuit, M. & Sansonetti, PJ Organoides intestinales como una herramienta novedosa para estudiar las interacciones entre microbios y epitelio. Métodos Mol. Biol. 1576, 183–194 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Osorio, FG et al. Terapia dirigida por empalme en un nuevo modelo de ratón de envejecimiento humano acelerado. ciencia Traducir Medicina. 3, 106ra107 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada de cambio de pliegue y dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 550–21 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Shen, S. et al. rMATS: detección robusta y flexible de empalmes alternativos diferenciales a partir de datos replicados de RNA-Seq. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, E5593–E5601 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramírez, F. et al. deepTools2: un servidor web de próxima generación para el análisis de datos de secuenciación profunda. Ácidos Nucleicos Res. 44, W160–W165 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Quinlan, AR & Hall, IM BEDTools: un conjunto flexible de utilidades para comparar características genómicas. Bioinformática 26, 841–842 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR: alineador RNA-seq universal ultrarrápido. Bioinformática 29, 15–21 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: un programa eficiente de propósito general para asignar lecturas de secuencias a características genómicas. Bioinformática 30, 923–930 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Muñoz, J. et al. La firma de células madre intestinales Lgr5: expresión robusta de los marcadores celulares quiescentes '+4' propuestos. EMBO J. 31, 3079–3091 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Haber, AL et al. Un estudio unicelular del epitelio del intestino delgado. Naturaleza 551, 333–339 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McMurdie, PJ & Holmes, S. Phyloseq: un paquete de bioconductores para el manejo y análisis de datos de secuencias filogenéticas de alto rendimiento. Pac. Síntoma Biocomputación. 235–246 (2012).

Lipecka, J. et al. La sensibilidad del análisis de espectrometría de masas depende de la forma de la unidad de filtración utilizada para la preparación de muestras asistida por filtro (FASP). Proteómica 16, 1852–1857 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permite altas tasas de identificación de péptidos, precisiones de masa de rango de ppb individualizadas y cuantificación de proteínas de todo el proteoma. Nat. Biotecnología. 26, 1367-1372 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Florence Cammas por proporcionar los ratones Cbx3fl/fl. Agradecemos al Dr. Zhou Zhongjun (Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina Li Ka Shing de la Universidad de Hong Kong) por proporcionarnos MEF de ratones HGPS. Agradecemos al Dr. Cohen-Tannoudji por proporcionar los ratones Villin-CreERT2 (Institut Pasteur, París, Francia). Este trabajo ha sido apoyado por la subvención «Agence National de la Recherche» (ANR) (EPI-CURE, R16154KK de LA) y REVIVE (de CM), un programa de ANR 'Laboratoire d'Excellence' (2011–2021).

Universidad Paris Cité, INSERM, CNRS, Instituto Necker para Niños Enfermos, F-75015, París, Francia

Jorge Mata-Garrido, Yao Xiang, Yunhua Chang-Marchand, Caroline Reisacher, Elisabeth Ageron & Laurence Arbibe

Plataforma de proteómica Necker, Universidad de París Cité-Estructura federativa para la investigación de Necker, INSERM US24/CNRS UAR3633, 75015, París, Francia

Ida Chiara Guerrera

Grupo de Nanomedicina, Instituto Valdecilla-IDIVAL, 39011, Santander, España

Iñigo Casafont

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Facultad de Medicina, Universidad de Cantabria, 39011, Santander, España

Iñigo Casafont

Instituto Micalis, Instituto Nacional de Investigación en Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (INRAE), AgroParisTech, Universidad Paris-Saclay, UMR1319, F-78350, Jouy-en-Josas, Francia

Aurelia Bruneau y Claire Cherbuy

Centro de Medicina del Microbioma de París (PaCeMM) FHU, AP-HP, F-75571, París, Francia

Aurelia Bruneau y Claire Cherbuy

UMR-S 1149, Universidad Paris Cité, Inserm, Centro de Investigación de Inflamación, equipo de Inflamación Intestinal, F-75018, París, Francia

Xavier Treton, Anne Dumay y Eric Ogier-Denis

Centro Paris IBD, Centro Hospitalario Privado Ambroise Pare-Hartmann, Neuilly, Francia

Javier Treton

INSERM 1242 y Centro Eugene Marquis, Rennes, Francia

Eric Ogier-Denis

Sorbonne Université, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), CNRS Unidad de Adaptación Biológica y Envejecimiento (B2A), Epigenética y metabolismo del ARN en enfermedades humanas, 75005, París, Francia

Eric Batsché, Mickael Costallat y Christian Muchardt

Departamento de Biociencias y Nutrición, Centro de Medicina Innovadora, Karolinska Institutet, SE-141 57, Huddinge, Suecia

Gwladys Revêchon y Maria Eriksson

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

JM-G. diseñó y realizó la mayoría de los experimentos, y participó en la redacción del artículo; YX realizó experimentos sobre empalmes y YC-M. en ratones HGPS; CR realizó experimentos QPCR en ratones Cbx3 KO y pacientes con EII; EA realizó estudios de inmunofluorescencia; ICG realizó análisis proteómico; IC produjo datos EM, AB realizó extracción de ADN y PCR para análisis de microbiota; CC realizó análisis de microbiota a partir de la secuenciación de 16 S; XT, EOD proporcionó informes médicos y muestras clínicas y AD proporcionó datos de ADNc y QPCR de los pacientes; EB diseñó, llevó a cabo e interpretó experimentos de empalme, ddPCR y participó en la redacción del artículo; MC llevó a cabo la mayor parte de la bioinformática en los datos de RNA-seq del modelo de ratón y de los pacientes con CU; GR y ME proporcionaron ratones HGPS; CM diseñó y participó en la bioinformática explorar el empalme, y en la redacción del documento. LA concibió el proyecto, supervisó el estudio, escribió y editó el documento.

Correspondencia a Laurence Arbibe.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Mata-Garrido, J., Xiang, Y., Chang-Marchand, Y. et al. La proteína heterocromatina 1 es un regulador en la precisión de empalme del ARN deficiente en la colitis ulcerosa. Nat Comun 13, 6834 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

Descargar cita

Recibido: 24 enero 2022

Aceptado: 27 de octubre de 2022

Publicado: 18 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.