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Oct 20, 2023

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npj medicina regenerativa

npj Regenerative Medicine volumen 7, Número de artículo: 71 (2022) Citar este artículo

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Las terapias con células alogénicas no son completamente efectivas en el tratamiento de la osteoartritis de la rodilla (OAK). Recientemente informamos que el trasplante de láminas de células de condrocitos autólogos junto con la osteotomía tibial alta de cuña abierta promovieron la reparación del cartílago hialino en humanos. Aquí describimos nuestra terapia regenerativa para OAK utilizando láminas de células de condrocitos alogénicos derivados de polidactilia (láminas PD) e insertos de cultivo sensibles a la temperatura. Diez pacientes con OAK y defectos del cartílago categorizados artroscópicamente como grado III o IV de Outerbridge recibieron la terapia. Se evaluaron la viscoelasticidad y el grosor del cartílago antes y después del trasplante. Las biopsias artroscópicas obtenidas 12 meses después del trasplante se analizaron histológicamente. Se analizó la expresión génica para evaluar las hojas de PD. En esta pequeña serie longitudinal inicial, el trasplante de láminas de PD fue efectivo en el tratamiento de OAK, como lo indican los cambios en las propiedades del cartílago. Los conjuntos de marcadores de genes en las hojas de PD pueden predecir los resultados después de la terapia y proporcionar marcadores para la selección de células donantes. Esta cirugía combinada puede ser una terapia regenerativa ideal con efectos modificadores de la enfermedad en pacientes con OAK.

La osteoartritis (OA) es la causa más común de pérdida de movilidad y es la forma más frecuente de enfermedad musculoesquelética en todo el mundo1,2. La OA afecta negativamente la calidad de vida, la productividad laboral y el costo de la atención médica. Recientemente informamos sobre nuestra investigación clínica sobre los efectos de la cirugía combinada y el trasplante autólogo de láminas de células de condrocitos en OA3. No se observaron eventos adversos graves relacionados con la cirugía combinada durante el período de tratamiento y seguimiento, y se confirmó una excelente regeneración de la superficie articular con cartílago hialino en la cirugía artroscópica de revisión. Todas las muestras de biopsia de cartílago regenerado revelaron una fuerte tinción de safranina O y expresión de colágeno tipo II (COL2). La puntuación de resultado de lesiones de rodilla y osteoartritis (KOOS) y la puntuación de rodilla de Lysholm (LKS) mejoraron significativamente después de la cirugía, y estas mejoras se mantuvieron durante más de 3 años. Sin embargo, el trasplante de láminas de células de condrocitos autólogos tiene varias limitaciones. Por ejemplo, la cirugía artroscópica, que requiere la extracción de cartílago y tejido sinovial, es necesaria antes del trasplante; las células recolectadas y sus propiedades difieren entre los individuos y, en ocasiones, se recolectan en cantidades insuficientes para fabricar láminas celulares, y a menudo se encuentran anomalías cromosómicas en células obtenidas de pacientes ancianos con osteoartritis de la rodilla (OAK). Dadas estas limitaciones y el hecho de que el cartílago articular es inmune tolerante, consideramos el uso de láminas de células alogénicas como una opción viable para evitar la necesidad de cosechar tejido.

Las células madre mesenquimales (MSC) alogénicas, las células madre derivadas del tejido adiposo y las células madre del cordón umbilical se utilizan a menudo en ensayos clínicos de tratamientos para la OAK. Sin embargo, la mayoría de estos métodos implican terapias celulares mediante inyección intraarticular. Estas terapias tienden a lograr una mejoría temporal de los síntomas, pero no la reconstrucción estructural o la producción de cartílago hialino nativo. El reciente aumento en el uso de estrategias basadas en células para la reparación del cartílago ha generado una necesidad urgente de fuentes de células listas para usar potentes y seguras. Nos hemos centrado en la cirugía de polidactilia como una forma de obtener muestras de tejido como fuentes de células alogénicas y hemos tenido éxito en la fabricación de láminas de células de condrocitos alogénicos derivados de polidactilia (láminas PD) utilizando insertos de cultivo sensibles a la temperatura4,5. Recientemente, Kondo et al. informó la seguridad y eficacia preclínica de láminas de condrocitos derivados de cartílago juvenil de origen polidactilia in vitro e in vivo utilizando un modelo de defecto osteocondral focal de rata6. Los condrocitos PD proliferan rápidamente, establecen una estructura en capas con una matriz extracelular suficiente y forman láminas que pueden manipularse fácilmente. Aunque el número de láminas de condrocitos autólogos que se pueden fabricar es limitado4, en teoría, se pueden fabricar más de 600 láminas de PD a partir de células del pase 2 (P2) y más de 3000 láminas de PD a partir de células P3. Aquí, describimos nuestro uso del trasplante de láminas PD combinado con una osteotomía tibial alta (HTO) y sugerimos que es una forma ideal de terapia regenerativa para pacientes con OAK.

Hemos diseñado una terapia combinada (Fig. 1a) en la que al tratamiento quirúrgico convencional de la OAK, que está cubierto por el Seguro Nacional de Salud en nuestro país, le sigue la extirpación del tejido no sano, la estimulación de la médula ósea y el trasplante de lámina de condrocitos (el " método RMSC") para tratar defectos del cartílago3. Este estudio fue diseñado para evaluar la efectividad del tratamiento total pero no los efectos adicionales de cada tratamiento. La HTO para pacientes con OAK es un procedimiento de conservación de las articulaciones que ha llamado la atención en todo el mundo. El cartílago articular a veces se regenera después de la mejora de la alineación de toda la pierna por HTO, pero se trata principalmente de cartílago fibroso, que tiene propiedades diferentes al cartílago hialino7,8. Presumimos que el trasplante de láminas de PD junto con HTO puede acelerar la regeneración del cartílago nativo, como el cartílago hialino, reducir los síntomas de OAK y ayudar a mantener las cualidades biológicas de la articulación de la rodilla.

a Combinación de intervención quirúrgica convencional e implantación de láminas de condrocitos. Se fabricaron láminas de condrocitos alogénicos derivados de polidactilia (láminas PD) a partir de tejido de cartílago obtenido de cirugía de polidactilia. En el centro de procesamiento celular, los condrocitos aislados se pasaron una vez y se sembraron a -180 °C. Para fabricar hojas de PD, las células se descongelaron y se pasaron una vez y luego se sembraron en insertos de cultivo sensibles a la temperatura. Las hojas de PD se cultivaron más durante 14 a 16 días y se trasplantaron. Los pacientes de OAK fueron tratados primero con tratamientos quirúrgicos convencionales OWHTO, seguidos de la extirpación del tejido no saludable, la estimulación de la médula y el trasplante de láminas de condrocitos (método RMSC). b El protocolo general para el estudio clínico. La decisión final sobre el ingreso al estudio clínico se tomó durante la evaluación artroscópica. Para los pacientes que cumplían con los criterios de inclusión, se utilizó LIPA para evaluar los defectos del cartílago. Eliminación de RMSC de tejido no saludable, estimulación de la médula y trasplante de láminas de condrocitos, osteotomía tibial alta de cuña abierta OWHTO, fotoacústica inducida por láser LIPA, puntaje de resultado de lesión de rodilla y osteoartritis KOOS, puntaje de rodilla LKS Lysholm, imágenes por resonancia magnética MRI. c El diagrama de flujo CONSORT. Diagrama CONSORT para un estudio comparativo de brazo único, abierto, no controlado (es decir, inscripción, asignación de intervenciones, seguimiento y análisis de datos).

Las placas o insertos de cultivo sensibles a la temperatura (CellSeed Inc., Tokio, Japón), cuyo uso fue informado por primera vez por Okano et al.9,10, tienen una superficie inteligente especial. Con estos insertos, se pueden producir láminas de condrocitos manteniendo la matriz extracelular y luego reduciendo la temperatura para liberar las láminas, sin necesidad de digestión enzimática.

Fuimos los primeros en reportar la aplicación de láminas de condrocitos en capas para la reparación del cartílago articular11,12. Hemos informado evidencia de estudios en animales que indican el potencial de estas láminas de condrocitos en capas en el tratamiento de la artritis no traumática en ratas13, un defecto parcial en el cartílago articular de conejo14 y defectos osteocondrales en cartílago de rata15,16, conejo17,18,19 y minipig20. Este tipo de defectos suelen estar presentes en el ROBLE. También investigamos el modo de acción de las láminas de condrocitos en capas, y sugerimos que las láminas de condrocitos ejercen sus efectos de regeneración continua en el cartílago articular a través de la secreción continua de factores humorales como la actividad inhibidora del melanoma (MIA), el factor de crecimiento transformante β ( TGF-β) y prostaglandina E2, que son importantes en la regeneración del cartílago21,22.

Diez pacientes con OAK y defectos del cartílago se inscribieron en este estudio y recibieron terapia con hojas de PD. Se diseñó un riguroso protocolo de evaluación (Fig. 1b) para evaluar los puntos finales de seguridad y eficacia de la terapia y para evaluar los resultados clínicos y estructurales. Las propiedades de las láminas de PD alogénicas trasplantadas también se evaluaron minuciosamente mediante análisis de expresión génica para investigar su uso potencial para predecir los resultados clínicos y estructurales de la terapia. En esta pequeña serie de casos longitudinal inicial, queríamos determinar si la expresión de conjuntos de genes marcadores específicos en hojas de PD podría proporcionar marcadores potenciales para predecir los resultados de esta nueva terapia regenerativa para OAK.

La figura 2 muestra las propiedades de las hojas de PD trasplantadas en este estudio. Las láminas de PD se pueden manipular utilizando una membrana de soporte blanca circular de difluoruro de polivinilideno (Fig. 2a). Las estructuras multicapa se confirmaron mediante tinción histológica (Fig. 2b). La inmunotinción mostró que las láminas expresaban fuertemente fibronectina (FN), COL1 y agrecano (ACAN). Las hojas de PD casi no exhibieron expresión de COL2 (Fig. 2b). Las células de las láminas de PD estaban desdiferenciadas y las propiedades de las láminas de condrocitos eran diferentes de las del cartílago hialino. La Figura 2c-e muestra la distribución de las propiedades de las láminas de PD trasplantadas con respecto al número de células, la viabilidad y el grosor, respectivamente. La Figura 2f muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de las hojas de PD dispersas. Casi todas las células de las hojas de PD fueron positivas para el grupo de diferenciación 81 (CD81) y marcadores de células madre mesenquimales, CD90 (Thy-1), CD44 (receptor de ácido hialurónico) y CD105 (endoglina). Las células positivas para CD146 (molécula de adhesión de células de melanoma) y positivas para GD2 (disialogangliósido GD2) estuvieron presentes con una frecuencia de 20 a 70 % y las células positivas para CD49a (integrina α1) con una frecuencia de 5 a 25 %. Casi todas las células fueron negativas para los marcadores de linaje sanguíneo CD31 (molécula de adhesión de células endoteliales de plaquetas-1) y CD45 (antígeno común de leucocitos). La expresión del marcador fue similar a la de las láminas de condrocitos de rodilla adulta que se trasplantaron en un estudio clínico anterior que utilizó células autólogas. La producción del factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) y factores asociados a la eficacia previamente identificados5, actividad inhibidora del melanoma (MIA), inhibidor de la vía de señalización Dickkopf WNT 1 (DKK1), molécula específica de células endoteliales 1 (ESM1) y gremlin 1 (GREM1) confirmado por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Fig. 2g). El análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de los genes expresados ​​por las hojas de PD reveló una expresión generalizada de genes de interés relacionados con el cartílago (Fig. 2h).

Las hojas de PD se manipularon utilizando una membrana de soporte de PVDF circular. b Imágenes representativas de la sección transversal de la hoja PD. Tinción histológica con hematoxilina y eosina (HE), tinción inmunohistoquímica para colágeno tipo I (COL1), colágeno tipo II (COL2), agrecano (ACAN) y fibronectina (FN). barra de escala; 50 micras. c–e Distribución de las características de la hoja PD trasplantada de nueve lotes: El recuadro representa el rango intercuartílico de los valores. La parte superior e inferior de los bigotes representan los valores máximo y mínimo. La línea dentro del cuadro representa los valores de la mediana. El número de células (c) y la viabilidad de las células (d) se determinaron después de la digestión enzimática de una hoja de células. e El espesor de la hoja de PD se midió utilizando imágenes microscópicas de secciones transversales. f Análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie para las células en las hojas de PD. Las láminas de PD se digirieron enzimáticamente y se analizaron mediante tinción de un solo color. Los datos se expresan como la media ± SD del porcentaje de células que expresan marcadores de superficie de nueve lotes de hojas (Fig. 2 complementaria). Las células fueron positivas para CD81, CD90, CD44 y CD105 y negativas para CD31 y CD45. La tinción para CD146, CD49a y GD2 difirió entre los lotes. g Concentraciones de factores humorales secretados por hojas de PD. Cada marca indica muchas hojas. Algunas marcas se superponen. h El perfil de expresión génica de las hojas trasplantadas se analizó mediante qPCR para genes relacionados con el cartílago, y los resultados se informan en relación con la expresión de GAPDH. Se fabricaron un total de nueve lotes de láminas de DP utilizando células crioconservadas de tres donantes de pacientes con polidactilia. Tres lotes eran del donante 1 y se usaron para crear las hojas 1-1, 1-2 y 1–3 en h. Cuatro lotes eran del donante 2 y se usaron para crear las hojas 2-1, 2-2, 2-3 y 2–4. Dos lotes eran del donante 3 y se usaron para crear las hojas 3-1 y 3-2. Cada lote se utilizó para un paciente, excepto la hoja 3-2, que se trasplantó a dos pacientes (pacientes 9 y 10). Los datos con el mismo color eran del mismo lote de hojas de PD en g, h.

No se observaron eventos adversos graves relacionados con las cirugías combinadas, como infección profunda o pseudoartrosis, durante el período de seguimiento. Se informaron otros eventos adversos e incluyeron trombosis venosa profunda en un paciente, dolor en 10 pacientes, leucocitosis en 10 pacientes y aumento de los niveles de proteína C reactiva en 10 pacientes. La trombosis venosa profunda se curó con terapia conservadora. Se consideró que estos eventos adversos estaban relacionados con la osteotomía tibial alta en cuña abierta (OWHTO). Creemos que es poco probable que estos hayan estado relacionados con el trasplante de hojas de PD.

El LKS mejoró significativamente de 40,1 ± 13,9 puntos antes de la operación a 80,5 ± 15,7 puntos al final del seguimiento. Todas las subescalas de KOOS (síntoma, dolor, función en la vida diaria, función en el deporte y la recreación, y calidad de vida) también mejoraron significativamente (Fig. 3a, b y Tabla complementaria 1, 2).

Se utilizó un KOOS para evaluar los efectos sobre los parámetros relacionados con la rodilla. Los promedios de los pacientes para las subescalas KOOS, síntomas, dolor, ADL y QOL mejoraron significativamente desde la línea de base. *p < 0,05, **p < 0,01. AVD actividades de la vida diaria, QOL calidad de vida. b El promedio de pacientes para LKS mejoró significativamente desde la línea de base. El recuadro representa el rango intercuartílico de las puntuaciones. La parte superior e inferior de los bigotes representan las puntuaciones máxima y mínima, excepto los datos de 12 meses que contienen el valor atípico. La línea dentro del cuadro representa la puntuación media. *p < 0,05, **p < 0,01. c–f Se utilizó un análisis correlacional para seleccionar un conjunto de marcadores genéticos que fuera predictivo de cada una de las medidas de resultado. El gráfico de dispersión muestra las correlaciones entre las puntuaciones de los genes y el dolor KOOS a los 12 meses (c), LKS a los 12 meses (d) y OARSI (e) e ICRS II (f). La puntuación génica se calculó a partir de la expresión génica del conjunto de marcadores genéticos predictivos para el dolor KOOS (PTGS2, TGFB1, MIA y G0S2), el LKS (COL1A2, MATN2, SOX9 y TGFB1) y la puntuación histológica OARSI (CCN2, COMP, ACKR4, ESM1 y GREM1) y la evaluación general de ICRS II (COL2A1, COL27A1, ACKR4 y ESM1), como se describe en la sección Métodos (Tablas complementarias 4–7). El número asignado a cada símbolo indica el paciente correspondiente. g Resultados histológicos de biopsias de pacientes y resultados de evaluaciones clínicas. C = cartílago articular, B = hueso subcondral, línea discontinua = límite entre la región del cartílago articular y la región del hueso subcondral. Se tomaron biopsias del cóndilo medial femoral de áreas de cartílago regenerado 12 meses después de la operación. barra de escala = 1 mm. Las secciones histológicas de todos los pacientes teñidos con safranina O. La inmunotinción mostró la expresión de colágeno tipo II (COL2) en todos los pacientes.

Los defectos del cartílago y las ubicaciones se describen en la Tabla 1. Brevemente, el área total media del defecto fue de 15,9 cm2 para un paciente y >20 cm2 en cuatro pacientes. Diez pacientes tenían defectos del cóndilo femoral medial (MFC) (área media de 10,7 cm2), seis pacientes tenían defectos trocleares (Tr) (área media de 4,6 cm2) y cinco pacientes tenían defectos de beso de la tibia (área media de 4,0 cm2).

El ángulo femorotibial y el porcentaje del eje mecánico (%MA) cambiaron significativamente de 179,4° ± 2,8° a 168,9° ± 2,8° y de 24,1 ± 10,8 a 67,5 ± 9,2 antes y después del trasplante, respectivamente.

La resonancia magnética nuclear (RMN) confirmó la regeneración del cartílago en áreas que carecían de cartílago antes de la operación (Figura 1 complementaria). Los resultados de la puntuación de la Observación por resonancia magnética del tejido reparador del cartílago 2.0 (MOCART 2.0) mejoraron significativamente (Tabla 1).

Los resultados de la evaluación fotoacústica inducida por láser (LIPA) se muestran en la Tabla 1. Las características viscoelásticas del cartílago regenerado se expresan como la relación relativa al cartílago normal en la misma articulación. Las características mejoraron después del trasplante, y el grosor medio del cartílago regenerado fue de 3,54 mm.

Todas las biopsias revelaron una fuerte tinción para safranina O y expresión de COL2 (Fig. 3g). Aunque el grado en que se produjo la regeneración varió entre los pacientes y algunos casos representan un signo de degeneración, estos resultados sugieren, no obstante, que se había producido una regeneración del cartílago hialino. Los resultados de la puntuación histológica de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI), la puntuación de Mankin y la evaluación general de la Sociedad Internacional de Reparación del Cartílago (ICRS II) se muestran en la Tabla 1. La calidad del cartílago regenerado fue muy alta, con un promedio ICRS II puntuación de 80,8 (64-96, 0: tejido fibroso, 100: cartílago hialino), como se muestra en la Tabla 1, aunque también había fibrocartílago.

Para identificar las hojas de DP que promovían resultados superiores, se identificaron conjuntos de marcadores genéticos predictivos de los resultados clínicos y estructurales posoperatorios en función del análisis correlacional entre el perfil de expresión génica y los resultados. Los análisis se describieron previamente en el estudio sobre láminas de células autólogas3. Los conjuntos de marcadores potenciales se seleccionaron de genes relacionados con el cartílago (lista en la Tabla complementaria 3) con la mayor probabilidad de aparición en una matriz de 100 conjuntos de coeficientes de correlación de Pearson utilizando el proceso de exclusión de cinco.

La puntuación del gen se calculó utilizando los datos de expresión génica del conjunto de marcadores como se describe en Métodos (Tablas complementarias 4–7). La figura 3c-f muestra los diagramas de dispersión que indican las puntuaciones genéticas de las hojas de PD trasplantadas y los resultados clínicos para cada caso individual. Los conjuntos de marcadores para cada puntaje de resultado fueron los siguientes: para KOOS (Fig. 3c) PTGS2, TGFB1, MIA y G0S2; para LKS (Fig. 3d) COL1A2, MATN2, SOX9 y TGFB1; y para la puntuación histológica OARSI (Fig. 3e) CCN2, COMP, ACKR4, ESM1 y GREM1; para la evaluación general de ICRS II (Fig. 3f) COL2A1, COL27A1, ACKR4 y ESM1.

Mujer de 51 años intervenida de trasplante de lámina PD combinada con OWHTO por OAK de rodilla izquierda. El ángulo femorotibial y el %MA cambiaron de 183° a 167° y de 11,4 a 68,9, respectivamente (Fig. 4a). El hueso subcondral quedó expuesto en un área amplia en la MFC (Fig. 4b) y la meseta tibial medial (Fig. 4c). Después de usar LIPA para evaluar las propiedades viscoelásticas en el cartílago residual y el hueso subcondral, realizamos una microfractura (Fig. 4d) y trasplante de láminas de PD (Fig. 4e). Un año después del trasplante, se observó cartílago regenerado que cubría completamente el área del defecto en la MFC (Fig. 4f) y la meseta tibial medial (Fig. 4g). La resonancia magnética preoperatoria mostró un defecto de cartílago de espesor completo en el MFC. Esta área defectuosa parecía estar recubierta con láminas de PD y se rellenó con tejido regenerativo después de 3 meses, y el tejido regenerativo era claramente visible y se mantuvo 12 meses después del trasplante (Fig. 4h).

Fotografías de rayos X (a), imágenes artroscópicas (b-g) e imágenes de resonancia magnética (h). una fotografía preoperatoria de rayos X de la rodilla izquierda confirmó una deformidad en varo y un estrechamiento del espacio articular medial. La fotografía de rayos X 12 meses después de la operación mostró que la alineación se mantuvo después de OWHTO. A los 24 meses después de la operación (12 meses después de que se retiraron los implantes), se mantuvo la alineación y se absorbió el injerto de fosfato de beta-tricarcio. b, c El defecto del cartílago preoperatorio del cóndilo femoral medial y la lesión en beso de la meseta tibial provocaron la exposición del hueso subcondral. d Fotografías intraoperatorias del cóndilo femoral medial después de una microfractura. Las láminas de PD se trasplantaron tal como se pusieron sin suturar. f, g La presencia de cartílago regenerado se confirmó en la segunda vista artroscópica (12 meses después de la operación). h Vista sagital de la articulación femorotibial medial. Las imágenes ponderadas en T2 se obtuvieron mediante una resonancia magnética de 3,0 Tesla. Evolución del tiempo desde el defecto del cartílago preoperatorio hasta el cartílago regenerado después de la cirugía. La imagen de RM preoperatoria muestra un área amplia del defecto del cartílago en el cóndilo medial del fémur, una lesión en beso en la tibia y la acumulación de líquido sinovial. El cartílago regenerado se detectó a los 3 meses de la cirugía y se mantuvo en el tiempo. El hueso subcondral irregular causado por la estimulación de la médula se detectó inicialmente y se alisó a los 12 meses.

Hemos confirmado el modo de acción, seguridad y eficacia de las láminas de PD en experimentos con el modelo xenogénico4 y en otros estudios19,21,23 antes de realizar el estudio clínico.

En el estudio actual, especulamos que el modo de acción de los factores humorales de las hojas de PD fue el mecanismo más probable porque no usamos inmunosupresores. En nuestra investigación anterior, encontramos variabilidad en el potencial terapéutico de las láminas de DP después del trasplante ortotópico xenogénico y reconocimos la importancia de la selección de donantes para futuros estudios5. Cavalli et al.24 informaron que los condrocitos de polidactilia pueden expandirse in vitro y mantener una tasa proliferativa rápida y constante hasta por cinco pases, lo cual es una característica importante de una fuente de células estándar. El paso adecuado de las células PD también es fundamental en los ensayos clínicos. Para abordar este problema, identificamos conjuntos de marcadores de genes potenciales para predecir el resultado del trasplante de hojas de PD (Fig. 3c-f). Los genes marcadores para cada puntaje de resultado son diferentes. TGFB1 apareció en común en KOOS y LKS, los cuales están en el cuestionario de síntomas de autoinforme. ESM1 y ACKR4 aparecieron en la puntuación histológica de OARSI y en la evaluación general de ICRS II, estando ambas puntuaciones relacionadas con la evaluación del tejido de la biopsia. El conjunto marcador de genes puede ser útil para seleccionar la fuente de células alogénicas para la fabricación de láminas celulares antes del uso clínico.

Debido a que analizamos la expresión de genes relacionados con el cartílago en solo una pequeña serie longitudinal inicial, es posible que se hayan extraído otros genes si se hubiera utilizado un conjunto de genes diferente para el análisis. El conjunto actual de marcadores de genes puede mejorarse reemplazando los genes con otros más predictivos recientemente identificados.

El cartílago articular a veces se regenera después de la estimulación de la médula ósea o la artroplastia por abrasión combinada con HTO. Sin embargo, estos tejidos regenerados son principalmente cartílago fibroso, que difiere del cartílago hialino nativo7,8,25,26,27 y no proporciona los mismos efectos de carga a largo plazo que el cartílago hialino. Anteriormente, comparamos los resultados clínicos entre pacientes sometidos a OWHTO y artroplastia total de rodilla (TKA). En estos pacientes, el KOOS fue más bajo en los pacientes que se sometieron a OWHTO que en los que recibieron ATR, y los síntomas residuales, como rechinamiento de rodillas, chasquidos y rigidez, fueron peores después de OWHTO que después de ATR28. En este punto, en el estudio actual, confirmamos que la regeneración del cartílago hialino se había producido después del trasplante de láminas de PD combinado con OWHTO. Nuestros hallazgos sugieren que se pueden esperar efectos terapéuticos a largo plazo junto con una mejora en la alineación de las extremidades inferiores después del tratamiento combinado.

Anteriormente informamos sobre nuestro uso del trasplante autólogo de láminas de condrocitos y continuamos observando los resultados clínicos a largo plazo3. Para el estudio anterior, el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón (MHLW, por sus siglas en inglés) nos indicó que trasplantemos hojas de células solo en rodillas con defectos que miden <4,2 cm2, que es el tamaño de una hoja de células. Sin embargo, para el estudio actual, pudimos preparar suficientes hojas de PD para cubrir defectos más grandes y no limitamos la inscripción de pacientes debido al tamaño del defecto. En este estudio clínico, algunos pacientes tenían defectos que medían >20 cm2. En general, los criterios de exclusión comunes que definen la "rodilla roja" son lesiones que miden >8 cm2, desalineación, edad >55 años, lesiones por besos y adelgazamiento difuso del cartílago29, y algunos pacientes con rodilla roja se inscribieron en este estudio actual. Aunque no hubo eventos adversos graves después del trasplante de las hojas de PD, aún debemos completar los ensayos clínicos de fase III con un estudio comparativo bien controlado restringiendo la inscripción a pacientes sin rodilla roja.

El número de hojas de DP trasplantadas, la ubicación de los defectos y el tamaño total de los defectos no se relacionaron con los resultados clínicos ni con las puntuaciones histológicas. Sin embargo, estos resultados pueden haber estado influenciados por el hecho de que todos los pacientes recibieron un número suficiente de hojas de DP para cubrir completamente los defectos.

Nuestro estudio tiene tres limitaciones. Primero, el estudio incluyó solo 10 pacientes con OA general que se sometieron a OWHTO. Esta cirugía asociada puede haber afectado los resultados de la terapia. En segundo lugar, observamos resultados prometedores para el uso de hojas de PD durante al menos 1,5 años, pero se necesitan observaciones a más largo plazo para evaluar completamente esta nueva terapia combinada. Finalmente, nuestro estudio clínico fue diseñado como un estudio de un solo brazo, no aleatorizado y no controlado, y se necesitan más estudios con más pacientes y condiciones.

Continuamos desarrollando las técnicas para preservar y transportar láminas celulares en preparación para una futura comercialización. Continuamos investigando el método de vitrificación para facilitar la crioconservación de láminas celulares manteniendo sus macro y microestructuras para garantizar una alta tasa de viabilidad de las células constituyentes30. La bolsa de vitrificación circulante y la caja de almacenamiento de vitrificación son útiles para la conservación a largo plazo de láminas de células vitrificadas, lo que hará que la aplicación clínica de las láminas de células crioconservadas sea aún más factible31.

Confirmamos la seguridad y eficacia del trasplante de láminas de PD. Diez pacientes fueron sometidos a trasplante de lámina de PD combinado con OWHTO. La artroscopia de revisión 1 año después del trasplante mostró cartílago regenerado que cubría completamente las áreas defectuosas. La evaluación LIPA sugirió que el cartílago regenerado tenía propiedades mecánicas normales, y el análisis histológico de las muestras de biopsia indicó un cartílago de tipo hialino. Esta cirugía combinada puede proporcionar una terapia regenerativa ideal con efectos modificadores de la enfermedad en pacientes con OAK.

Los experimentos se realizaron bajo la aprobación y orientación del Comité de Revisión de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tokai. Presentamos estos datos de investigación preclínica al MHLW en Japón y solicitamos un plan de provisión de medicina regenerativa Clase I bajo la ley para la seguridad de la medicina regenerativa. El permiso se emitió el 27 de abril de 2016 y se permitió que comenzara la investigación clínica utilizando hojas de PD. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado de los padres o tutores de los donantes. Algunas muestras quirúrgicas fueron irreversiblemente desidentificadas. Todos los experimentos con células y tejidos humanos se realizaron de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Experimentos con Animales de la Universidad de Tokai y se realizaron de acuerdo con las pautas del Reglamento Institucional para Experimentos con Animales y las Pautas Fundamentales para la Realización Adecuada de Experimentos con Animales y Actividades Relacionadas en Instituciones de Investigación Académica bajo la jurisdicción de el Ministerio de Educación, Cultura, Deporte, Ciencia y Tecnología para el manejo y cuidado de los animales.

Nuestro estudio clínico se diseñó como un estudio comparativo no controlado, no aleatorizado y de un solo brazo. Este estudio (Registro de Ensayos Clínicos de UMIN, UMIN000015205, y Registro de Ensayos Clínicos de Japón, jRCTa030190242) fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tokai y por el MHLW de Japón. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El diagrama de flujo CONSORT se muestra en la Fig. 1c.

Las láminas de células para el trasplante se fabricaron a partir de células de donantes que exhibieron la capacidad de iniciar la regeneración del cartílago hialino después del trasplante ortotópico xenogénico en un modelo de conejo blanco japonés con defecto de espesor total del cartílago5,19. También realizamos hibridación genómica comparativa de matriz (matriz CGH) y análisis de cariotipo de las células P2 PD utilizadas para fabricar las láminas celulares y como células cultivadas a largo plazo (células P12) para evaluar la estabilidad genética de las células PD durante la fabricación in vitro. No se detectaron alteraciones en el número de copias mediante matriz CGH, y no se encontraron anomalías de cariotipo, según lo juzgado por las pautas del Sistema Internacional para la Nomenclatura Citogenética Humana, en las células utilizadas como fuente de células.

Se obtuvo tejido cartilaginoso de tres pacientes (edad promedio: 12,3 meses, rango: 10 a 15 meses, un niño y dos niñas) que se sometieron a una cirugía de polidactilia en el Hospital Universitario de Tokai. En la Fig. 1a se muestra un resumen del proceso de fabricación de láminas de PD. El tejido del cartílago se picó con tijeras y luego se incubó en medio de Eagle/F12 modificado por Dulbecco (DMEM/F12; Gibco, Grand Island, NY, EE. Lenexa, KS, EE. UU.), solución de antibiótico-antimicótico al 1 % (AB; Gibco) y colagenasa tipo 1 a 5 mg/mL (Worthington, Mannheim, Alemania) durante 1,5 h a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 y 95% aire. La suspensión celular se lavó y se pasó a través de un filtro de 100 μm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

Las células recolectadas se sembraron a una densidad de 0,5 a 1 × 104 células/cm2 en placas de cultivo de seis pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.) en DMEM/F12 suplementado con 20 % de FBS y 1 % de AB, y se incubaron a 37 °C. Después de 4 días, se añadió al medio 100 μg/mL de ácido ascórbico (AA; Nissin Pharmaceutical, Yamagata, Japón) y se reemplazó el medio cada 3 o 4 días. Las células se criopreservaron utilizando STEM-CELLBANKER™ (ZENOAQ, Fukushima, Japón) cuando alcanzaron la subconfluencia. Las células se descongelaron y sembraron una vez a una densidad de 0,5 a 1 × 104 células/cm2 en DMEM/F12 complementado con 20 % de FBS, 1 % de AB y 100 μg/mL de AA. Cuando las células alcanzaron la subconfluencia, se separaron con TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, Tokio, Japón) y se sembraron en insertos de cultivo sensibles a la temperatura (CellSeed Inc., Tokio, Japón) a 1 × 104 células/cm2. El medio se reemplazó cada 3 o 4 días. Después de 2 semanas, las placas de cultivo se mantuvieron a 25 °C durante 30 min para promover el desprendimiento de las hojas de PD de los insertos y se recolectaron las hojas de PD. Para analizar las propiedades de las hojas de PD mediante qPCR en tiempo real, análisis de citometría de flujo y tinción histológica e inmunohistoquímica, las hojas de PD se recolectaron el día 13 de cultivo.

Las láminas de PD se lavaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; Gibco). Luego, las láminas se incubaron en TripLE Express® (Gibco) a 37 °C durante 15 min y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Las hojas de células se resuspendieron en 0,25 mg/ml de colagenasa P (Roche, Basilea, Suiza) a 37 °C durante un máximo de 30 min y luego se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Las células aisladas finalmente se resuspendieron en DMEM/F12, y el recuento celular y la viabilidad se determinaron utilizando el ensayo de exclusión con azul de tripano.

Después de obtener el recuento de células, las células aisladas se lavaron con DPBS que contenía albúmina de suero bovino al 0, 2% (BSA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA; Gibco). Se mezclaron alrededor de 1,5 × 105 células en cada tubo con los siguientes anticuerpos: hCD31-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:10; IM1431U, Beckman & Coulter, Brea, CA, EE. UU.), CD44-FITC (1:10; 555478, BD Biosciences, Franklin, NJ, EE. UU.), hCD45–FITC (1:10; A07782, Beckman & Coulter), hCD81–aloficocianina (APC) (1:10; 551112, BD Biosciences), hCD90–APC (1:100; 559869, BD Biosciences), CD105–ficoeritrina (PE) (1:5; A07414, B76299, Beckman & Coulter), CD146–PE (1:5; 5050-PE100T, BioCytex, Marsella, Francia), CD49-PE (1 :5; 559596, BD Biosciences) y GD2 (1:10; 554272, BD Biosciences). Las células se incubaron durante 90 min a 4 °C y luego se lavaron con DPBS que contenía BSA al 0,2 % y EDTA 1 mM. GD2 se reconoció incubando las células con el anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con FITC (1:20; 349031, BD Biosciences) durante 10 min a 4 °C. Se usó anticuerpo IgG1 de ratón marcado con fluorosonda (1:10; Beckman & Coulter) como control negativo. Las células teñidas se analizaron con un clasificador de células FACSVerse ™ (BD Biosciences) (Fig. 2 complementaria).

Las hojas de PD se recolectaron después del cultivo y luego se incrustaron y congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (Sakura Finetek Japón, Tokio, Japón). Las secciones de 10 μm de espesor se tiñeron con hematoxilina y eosina utilizando métodos estándar (Figura 3 complementaria). Se inmunotiñeron secciones de 20 μm de espesor con COL1 antihumano (1:200; 1310-01, Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU.), COL2 (1:200; F-57, Kyowa Pharma Chemical, Toyama, Japón), FN (1:1000; MA5-11981, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y ACAN (1:20; 967800, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) a 4 °C durante la noche. Las secciones se lavaron e incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con el anticuerpo secundario Ig anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200; A-11017, Thermo Fisher Scientific) para COL2 y FN o burro conjugado con Alexa Fluor 546. Ig anti-cabra (1:400, A-11056, Thermo Fisher Scientific) para COL1 y ACAN. Después de la inmunotinción, las secciones se lavaron y montaron con VECTASHIELD Antifade Mounting Medium con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Las imágenes microscópicas se capturaron con un microscopio BZ-X810 (Keyence, Osaka, Japón).

Las hojas de PD se rompieron en TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific) usando un dispositivo SHAKE Master Neo (Bio Medical Science, Tokio, Japón), y el ARN total se aisló usando un RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) según a las instrucciones del fabricante. La cantidad y la calidad del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific) y un bioanalizador Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.).

El ARN total se convirtió en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen). Se usaron un kit TaqMan PreAmp Master Mix y TaqMan Gene Expression Assays (ambos de Thermo Fisher Scientific) (Tabla complementaria 3) para preamplificar el ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante. TaqMan qPCR se realizó con un sistema 7500 qPCR o QuantiStudio 3 (ambos de Thermo Fisher Scientific). Los valores de expresión relativa para cada gen (valores –ΔCt) se calcularon utilizando GAPDH como control interno.

Para recolectar los sobrenadantes de las láminas de PD fabricadas, las láminas se transfirieron a 3 ml de DMEM/F12 suplementado con FBS al 1 % y AB al 1 % el día 14 de cultivo y se cultivaron durante otras 72 h. Se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min para eliminar los restos celulares. Las concentraciones de TGF-β1 (R&D Systems), MIA (Roche), inhibidor de la vía de señalización Dickkopf WNT 1 (Thermo Fisher Scientific), molécula específica de células endoteliales 1 (ESM1; Abcam, Cambridge, Reino Unido) y gremlin 1 (GREM1; Cloud-Clone Corp., Katy, TX, EE. UU.) se midieron con kits ELISA. La señal detectada para el medio en blanco que contenía FBS al 1 % se sustrajo para ajustar las proteínas contenidas en FBS.

Diez pacientes (cuatro hombres y seis mujeres) que tenían defectos del cartílago categorizados artroscópicamente como grado III o IV de Outerbridge se inscribieron y recibieron la terapia. Su edad media en el momento de la operación era de 54 años (rango 45-58) y su índice de masa corporal medio era de 28,3 kg/m2 (rango 23,5-35,5). Los grados de Kellgren y Lawrence de las radiografías de rodilla fueron grado 2 en dos pacientes, grado 3 en seis y grado 4 en dos (Tabla 1). Realizamos trasplante de lámina de PD al primer paciente en febrero de 2017 y al último en diciembre de 2019.

Los criterios de inclusión para este estudio de investigación clínica fueron tener OAK en el compartimento medial, que generalmente se indica para OWHTO (Tabla 2). En otros estudios de investigación clínica de trasplante autólogo de láminas de condrocitos, el tamaño de la lesión del cartílago dañado se reguló en <4,2 cm2,3. Sin embargo, no hubo regulación de tamaño para este estudio de investigación clínica del trasplante de hojas de PD porque se podían preparar más de diez hojas de PD por adelantado. El número total de defectos a trasplantar con láminas de PD fue de 21 (10 para MFC, 6 para Tr, 5 para kissing lesions); los tamaños medios de los defectos fueron 10,8, 4,6 y 4,0 para MFC, Tr y kissing, respectivamente. El tamaño total máximo del defecto fue de 22,0 cm2 en un paciente (Tabla 1).

Diseñamos una terapia combinada en la que el tratamiento quirúrgico convencional para OAK, que está cubierto por el Seguro Nacional de Salud en Japón, fue seguido por el método RMSC (Fig. 1a). Los condrocitos alogénicos criopreservados se descongelaron y cultivaron durante 3 semanas para fabricar láminas de PD antes de la cirugía de trasplante. Se fabricaron un total de nueve lotes: tres lotes del donante 1, cuatro lotes del donante 2 y dos lotes del donante 3. Cada lote se usó para un paciente, excepto el noveno lote, que se trasplantó a dos pacientes. Realizamos OWHTO como lo describen Takeuchi et al.32 y buscamos lograr un %MA postoperatorio de 62.5. Después de la osteotomía biplana (tuberosidad oblicua y proximal), se trasplantó hueso artificial en el espacio abierto y se fijó en el sitio de la osteotomía usando TomoFix® (DePuy Synthes, Bettlach, Suiza) o TriS® (Olympus Terumo Biomaterials, Tokio, Japón).

Después de OWHTO, la articulación de la rodilla se abrió unos 5 cm utilizando el abordaje pararrotuliano medial. Se observaron el MFC, la meseta tibial medial y la articulación femororrotuliana, y se realizó RMSC (Película complementaria). Brevemente, después de la eliminación del tejido no saludable y la estimulación de la médula ósea (microfractura en siete pacientes y artroplastia por abrasión en tres), se trasplantaron láminas de PD para cubrir toda la superficie del defecto del cartílago. Las láminas de DP se pueden trasplantar sin suturas ni parches de periostio debido a sus excelentes propiedades adhesivas. Este método RMSC3 es una forma eficiente de regenerar cartílago hialino porque inserta MSC derivadas de médula ósea y varios factores humorales secretados por láminas de PD en el espacio del defecto del cartílago. Las láminas de DP se trasplantaron a la MFC en 10 pacientes, la meseta tibial medial en cinco y la articulación femororrotuliana en seis. El número medio de hojas trasplantadas fue de 13 (9-15). Los grados de Outerbridge y la ubicación y el tamaño de los defectos del cartílago se muestran en la Tabla 1.

Todos los pacientes fueron inmovilizados inmediatamente después de la cirugía mediante una férula de yeso que se mantuvo durante 2 semanas a 20° de flexión de la rodilla para no perturbar las láminas trasplantadas. Luego, los pacientes comenzaron con ejercicios de rango de movimiento y carga parcial de peso a las 2 semanas, y carga completa de peso a las 4 semanas después de la cirugía. En general, las actividades de bajo impacto se iniciaron a los 6 meses y las de alto impacto se permitieron a los 8 meses.

Evaluamos los resultados clínicos utilizando KOOS y LKS orientados al paciente antes de la operación y al mes, 3, 6 y 12 meses después de la operación33,34.

La evaluación por imágenes se realizó mediante fotografías de rayos X y resonancia magnética. Se examinaron fotografías de rayos X para determinar la alineación de la rodilla, el estado del hueso subcondral y la progresión de la OAK. El progreso se evaluó utilizando la escala de calificación de Kellgren-Lawrence antes y después de la operación. Los exámenes de resonancia magnética se realizaron con un escáner Achieva 3.0-T TX (Philips Healthcare, Best, Países Bajos), dentro de una bobina de ocho canales TX SENSE Knee (Philips Healthcare). Las imágenes fueron tomadas con 10° de flexión de rodilla. Se utilizaron imágenes de RM sagitales y coronales para evaluar las áreas de defectos del cartílago antes y después de la operación.

Para la evaluación de la terapia se utilizó el método MOCART 2.0 descrito por Schreiner et al.35 (tabla 1). La evaluación artroscópica de los defectos del cartílago incluyó su condición, tamaño y grado de Outerbridge, y se realizó antes y después de la operación. Se utilizó el método LIPA para evaluar las propiedades viscoelásticas del cartílago antes y después de la operación (Película complementaria). El uso de LIPA fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional para la Investigación Clínica de la Universidad de Tokai, y el método se ha aplicado clínicamente para evaluar las propiedades mecánicas del cartílago en pacientes36. Se utilizó el método LIPA por vía artroscópica durante la primera cirugía (trasplante de lámina PD y OWHTO) ya los 12 meses del postoperatorio (segundo look y extracción de implantes).

Los resultados histológicos se evaluaron 12 meses después de la operación mediante una biopsia realizada por artroscopia tomada cerca del centro del cartílago regenerado. Las muestras se descalcificaron con solución B de EDTA al 10 % (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) durante 9 días a 4 °C. Y luego, las muestras se incluyeron en cera de parafina y se cortaron secciones de 3 μm, se desparafinizaron, se tiñeron con safranina O y se inmunotiñeron para COL1 y COL2 utilizando métodos previamente informados15. La evaluación general ICRS II37 y la puntuación histológica OARSI fueron evaluadas de forma independiente por tres cirujanos ortopédicos capacitados. La puntuación microscópica del cartílago se evaluó mediante el método descrito por Little et al.38, quienes proporcionaron imágenes representativas de cada puntuación. Hubo variaciones mínimas en la puntuación entre los tres anotadores. La puntuación de Mankin se obtuvo de manera similar. utilizando esta escala, con cartílago normal se le da una puntuación de 0 sobre 14 puntos.

Los conjuntos de marcadores de genes predictivos se seleccionaron de los 43 genes y genes de control examinados (GAPDH y ACTB) (Tabla complementaria 3) como aquellos cuya expresión se correlacionaba con el puntaje de dolor KOOS y LKS, el puntaje histológico OARSI y el puntaje de evaluación general ICRS a los 12 meses después de la operación. En primer lugar, se identificaron 36 genes (Tablas complementarias 4–7) con valores de ΔCt normalizados superiores a –10 ciclos con expresión génica detectable. Para cada evaluación de resultados, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson entre el nivel de expresión de cada uno de los genes y las puntuaciones individuales (puntuación histológica de KOOS, LKS, OARSI y puntuación de evaluación general de ICRS) utilizando el proceso de exclusión de cinco, y los genes se clasificaron de mayor a menor para los valores absolutos de los coeficientes. A partir de esto, se calculó una matriz de 100 conjuntos de coeficientes de correlación de Pearson. Los genes representativos se seleccionaron de forma independiente como marcadores predictivos para cada una de las medidas de resultado seleccionando > 0,5 de valor absoluto para los coeficientes de correlación de Pearson para los genes enumerados según su probabilidad de aparición. Finalmente, se seleccionaron como marcadores predictivos cuatro o cinco conjuntos de genes con la mayor probabilidad de aparición. La puntuación del gen se calculó como el valor normalizado de la expresión de cada gen en función de las funciones lineales: Puntuación del gen = Σ(–Δvalor Ct) (Tablas complementarias 4–7).

Los datos se analizaron mediante análisis de varianza de medidas repetidas y la prueba post hoc de Bonferroni para identificar las diferencias entre las puntuaciones preoperatorias y posoperatorias para los resultados clínicos (n = 10) para las puntuaciones KOOS y LKS general. Los valores de p < 0,05 fueron significativos.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos a la profesora Rumiko Shimazawa (Escuela de Medicina de la Universidad de Tokai) y al Dr. Setsuko Hashimoto (CellSeed, Inc.) por sus contribuciones a este proyecto. También agradecemos al Centro de Apoyo para la Investigación y Educación Médica de la Universidad de Tokai por el apoyo técnico en el análisis histológico. Uno de los autores ha recibido financiación de las siguientes fuentes. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de Investigación para Aplicaciones Prácticas de la Medicina Regenerativa (Números de subvención JP15bk0104001, JP17bk0104063 y JP20bk0104101 a MS) de la Agencia de Investigación y Desarrollo Médico de Japón.

Departamento de Cirugía Ortopédica, Ciencias Quirúrgicas, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokai, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japón

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe y Masato Sato

Centro para la Investigación y el Avance Innovadores Musculoesqueléticos (C-MiRA), Escuela de Graduados de la Universidad de Tokai, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japón

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe y Masato Sato

Departamento de Ingeniería Médica, Colegio Médico de Defensa Nacional, 3-2 Namiki, Tokorozawa, Saitama, 359-8513, Japón

Miya Ishihara

Centro de procesamiento celular, Hospital Universitario de Tokai, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japón

Yoshihiko Nakamura

Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, 3-25-26 Tonomachi, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanagawa, 210-9501, Japón

Reiko Kato

DNA Chip Research Inc., 1-15-1 Kaigan, Suzue Baydium 5F Minato-ku, Tokio, 105-0022, Japón

Ryo MatobaMás

Centro Nacional para la Salud y el Desarrollo Infantil, 2-10-1 Okura, Setagaya-ku, Tokio, 157-8535, Japón

Takehiko Takagi, Hidenori Akutsu y Akihiro Umezawa

Departamento de Farmacología Clínica, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokai, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japón

Hiroyuki Kobayashi

Departamento de Cirugía Plástica, Ciencias Quirúrgicas, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokai, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japón

Tadashi Akamatsu

Instituto de Ingeniería y Ciencias Biomédicas Avanzadas, Universidad Médica Femenina de Tokio, 8-1 Kawada-cho, Shinjuku, Tokio, 162-8666, Japón

Masayuki Yamato

Cell Sheet Tissue Engineering Center, Departamento de Farmacia y Química Farmacéutica, Universidad de Utah, 30 South 2000, East Salt Lake, UT, 84112, EE. UU.

Teruo Okano

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KH: Contribuciones al estudio clínico y redacción de manuscritos. ET: Aportaciones al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. MI: Contribuciones al estudio clínico, especialmente la realización del método de artroscopia fotoacústica inducida por láser y corrección de manuscritos. GM: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. T. Takagaki: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. NK: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. MM: Aportaciones al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. T. Takahashi: Contribuciones al estudio clínico y básico ya la fabricación de láminas celulares. EO: Aportaciones al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. AW: Contribuciones al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. SN: Aportes al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. RK: Contribuciones al estudio clínico y básico y fabricación de láminas celulares. RM: Contribuciones a los análisis estadísticos y revisión de manuscritos. T. Takagi: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. HA: Suministro de células alogénicas y aportes al estudio básico y fabricación de láminas celulares. AU: Suministro de células alogénicas y aportes al estudio básico y fabricación de láminas celulares. HK: Contribuciones a análisis estadísticos y revisión de manuscritos. TA: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. MY: Contribuciones al diseño experimental, líder en tecnología de láminas celulares y corrección de manuscritos. PARA: Contribuciones al diseño experimental, plomo para la tecnología de hojas celulares y revisión de manuscritos. MW: Contribuciones al estudio clínico y corrección de manuscritos. MS: Garante, contribuciones al diseño de estudios clínicos, diseño experimental, líder de todos los elementos in vitro del trabajo experimental, provisión de fondos y preparación de manuscritos.

Correspondencia a Masato Sato.

Cada autor certifica que MS ha estado involucrado en las siguientes actividades financieras relevantes fuera de este trabajo y/u otras relaciones o actividades que los lectores podrían percibir que han influido, o que dan la apariencia de influir potencialmente, en este manuscrito: financiamiento de CellSeed Inc. MS es uno de los inventores de las patentes (PCT/JP2006/303759, PCT/JP2017/031136) de los solicitantes Tokai University y CellSeed Inc. para el proceso de fabricación de láminas de condrocitos. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Hamahashi, K., Toyoda, E., Ishihara, M. et al. Trasplante de hoja de células de condrocitos alogénicos derivados de polidactilia con osteotomía tibial alta como terapia regenerativa para la osteoartritis de rodilla. npj Regen Med 7, 71 (2022). https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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Recibido: 04 noviembre 2021

Aceptado: 05 diciembre 2022

Publicado: 16 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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