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Mar 14, 2023

La dinámica de las células inflamatorias controla la neovascularización y la curación de tejidos después de una lesión inducida por radiación localizada en ratones

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 571 (2023) Citar este artículo

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La sobreexposición local a la radiación ionizante provoca inflamación crónica, daño vascular y caquexia. Aquí investigamos la cinética de las células inflamatorias desde el día (D) 1 hasta el D180 después de la irradiación de las patas traseras del ratón y analizamos el papel de los subconjuntos de monocitos (Mo) en la revascularización del tejido. En D1, encontramos que las células Mo y T se movilizan desde el bazo y la médula ósea hacia la sangre. La formación de nuevos vasos durante la fase temprana, como se demuestra por un aumento de ~1,4 y 2 veces en la puntuación angiográfica y la densidad capilar, respectivamente, se correlaciona con un aumento de las células T circulantes, y Mohi y macrófagos tipo 1 en el músculo irradiado. En D90 se observa rarefacción vascular y caquexia, asociadas con un número reducido de macrófagos tipo Molo y tipo 2 circulantes en el tejido irradiado. Además, la deficiencia de CCR2 y CX3CR1 influye negativamente en la neovascularización. Sin embargo, la transferencia adoptiva de Mohi mejora el crecimiento de los vasos. Nuestros datos demuestran las ondas inflamatorias dinámicas inducidas por la radiación y el papel principal de las células inflamatorias en la neovascularización.

Cada año se producen accidentes de alta dosis de radiación aguda, tras accidentes industriales (pérdida de fuentes radiactivas) o sobredosis tras aplicaciones médicas (radioterapia y procedimientos de radiología intervencionista). La lesión por radiación se caracteriza por ondas inflamatorias sucesivas e impredecibles durante los primeros días o años después de la irradiación, y esto conduce a la extensión horizontal y vertical de la lesión tisular, incluida la rarefacción vascular y la caquexia muscular1. El daño vascular y la rarefacción se consideran la principal causa de morbimortalidad a largo plazo en pacientes que conducen a isquemia tisular tras la exposición a radiaciones ionizantes2. La sobreexposición local a las radiaciones ionizantes tiene graves consecuencias para la salud, especialmente cuando la dosis absorbida supera los 25 Gy y conduce a la necrosis tisular1,3. La reparación de la lesión aguda del músculo esquelético es un proceso estrechamente regulado, que consiste principalmente en tres fases, que incluyen inflamación, regeneración y angiogénesis4,5. En el modelo preclínico de irradiación corporal total, se ha demostrado que el número de mionúcleos y células satélite por miofibra disminuyó de forma dependiente de la dosis6. Además, una sola dosis de irradiación de 18 Gy bloquea la regeneración muscular al inducir la letalidad de los mioblastos7. Estudios de patología muscular con dosis de irradiación superiores a 25 Gy han demostrado alteraciones morfológicas, hemorragia, necrosis, inflamación, fibrosis y destrucción de mitocondrias8,9,10,11. La isquemia es el proceso común tanto en enfermedades de lesiones radiolocales como en enfermedades cardiovasculares. En la enfermedad isquémica, la perfusión insuficiente de órganos después de la obstrucción de un vaso trombótico de la arteria de alimentación es un determinante importante de la remodelación postisquémica12. Sin embargo, la exposición de células de mamíferos, como las células endoteliales, a la radiación ionizante conduce principalmente a la muerte celular inducida por daños en el ADN13. La isquemia se caracteriza por daño/rarefacción vascular e inflamación que resulta en fibrosis caracterizada por una cicatriz basada en colágeno14. La respuesta tisular isquémica se basa en cuatro procesos principales, vasculogénesis, angiogénesis, arteriogénesis y crecimiento colateral, que contribuyen a la reparación y remodelación tisular durante las enfermedades vasculares isquémicas agudas y crónicas15. Estos procesos resultan de cambios en las fuerzas hemodinámicas dentro de la pared vascular que conducen a la modificación de la homeostasis vascular15,16.

La infiltración de células inflamatorias en áreas hipóxicas es un sello distintivo de la isquemia tisular, y el papel respectivo de los distintos subconjuntos de leucocitos en la neovascularización posisquémica (células T CD4+ y CD8+17,18, células NK19, células T reguladoras20, mastocitos21, monocitos/macrófagos22) no está claro. completamente entendido. En particular, los linfocitos T están involucrados en este proceso, como lo demuestra el hecho de que los ratones desnudos, que carecen de todos los subconjuntos de células T, muestran una reducción pronunciada en el crecimiento de vasos posisquémicos23. Los leucocitos y monocitos desencadenan la neovascularización a través de la liberación de varios factores angiogénicos/arteriogénicos, incluido el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral-α, interleucina (IL)-1β y metaloproteinasas24,25. Además, el papel de los monocitos en el proceso de neovascularización ha sido documentado por diferentes grupos18,26.

Los monocitos son una población heterogénea con dos subtipos principales en ratones: Ly6ChiLy6G-7/4hi monocitos "inflamatorios" (Mohi) y Ly6CloLy6G-7/4lo monocitos "residentes" (Molo) correspondientes a las subpoblaciones CD14hiCD16− y CD14loCD16+ en humanos, respectivamente27. Mohi expresa la NO sintasa inducible (NOS) y citocinas proinflamatorias, como IL-1 e IL-12, mientras que Molo produce grandes cantidades de arginasa 1, la citocina antiinflamatoria IL-10 y VEGF. Mohi ingresa rápidamente a los sitios de inflamación, mientras que Molo ingresa a órganos linfoides y no linfoides en condiciones homeostáticas, patrulla el endotelio vascular de manera dependiente de CX3CR128 y favorece la regeneración de tejidos en diversos contextos29. Recientemente mostramos el papel central de la activación de monocitos/macrófagos en la orquestación del mecanismo de neovascularización en un modelo de ratón de irradiación colorrectal local22. Además, en un modelo de ratón con isquemia de miembros posteriores, el trasplante de Mohi, pero no de Molo, condujo a la activación de la neovascularización postisquémica26.

Se cree que el reclutamiento de monocitos a las áreas isquémicas ocurre principalmente a través de la señalización de quimiocinas/receptores de quimiocinas. En particular, CCL2 y su receptor afín CCR2, así como la fractalquina (CX3CL1) y los ligandos de CX3CR1 están implicados en este contexto30,31,32. De hecho, CCL2 aumenta en el sitio de crecimiento colateral y la revascularización mejora notablemente con el tratamiento con CCL233. De manera similar, en modelos isquémicos de miembros posteriores, la deficiencia en CCL2 o CCR2 reduce la inflamación posisquémica y el crecimiento de vasos25,34 y aumenta la atrofia del músculo gastrocnemio35. Por lo tanto, la modulación terapéutica de la respuesta inflamatoria puede ser prometedora para mejorar la respuesta reparadora para la prevención de la enfermedad postisquémica15,16.

Aquí, utilizando un modelo de ratón de lesión inducida por radiación localizada en las patas traseras, analizamos la dinámica de movilización y reclutamiento de células inflamatorias innatas y adaptativas en diferentes tejidos (médula ósea (BM), bazo, sangre y músculos) desde D1 hasta D180 post irradiación. Mostramos por primera vez las ondas inflamatorias que caracterizan la lesión por radiación ionizante. Estas ondas correspondieron a la alternancia entre las fases de proliferación/movilización observada en diferentes tejidos, como el bazo, la sangre y el músculo; sin embargo, fueron menos pronunciados en BM. Destacamos dos fases después de la irradiación de las patas traseras, correspondientes primero a una fase temprana con inflamación y neovascularización correlacionada con la movilización de células T CD4- y CD8 del bazo, la infiltración en el músculo de Mohi y su diferenciación en macrófagos proinflamatorios (Tipo 1 -como macrófagos/similares a M1). En la fase tardía, demostramos rarefacción vascular y caquexia, que se correlacionaron con una disminución de los recuentos de Molo en sangre y músculo y la diferenciación de Molo en macrófagos de tipo 2 (similares a M2) en el músculo.

Finalmente, investigamos con mayor precisión el papel de Mohi y M1-like en la neovascularización durante la fase temprana. La deficiencia en CCR2 o CX3CR1 obstaculizó los mecanismos de arteriogénesis, mientras que la inyección intramuscular de Mohi en ratones WT mejoró la arteriogénesis.

Para investigar el efecto de la irradiación en la pata trasera, primero evaluamos la cinética de evolución de la lesión mediante un análisis semicuantitativo de la extensión de la herida, la ulceración, la descamación húmeda y la retracción de la extremidad durante el proceso de cicatrización de la herida cada semana hasta el D180. Después de 14 días después de la irradiación, la puntuación de la lesión aumentó y alcanzó su punto máximo en D35 y luego disminuyó lentamente hasta D180 (Fig. 1a). Este efecto nocivo de la irradiación se asoció con caquexia/desgaste muscular (rabdomiólisis). El peso del gastrocnemio y tibial disminuyó progresiva y significativamente en D120, 150 y 180 en 2 y 1,5 veces, respectivamente, en comparación con el grupo no irradiado (P < 0,01, Fig. 1b).

una evolución cinética de las puntuaciones de las lesiones medidas cada semana y fotografías representativas de las lesiones de las patas traseras inducidas por la radiación en diferentes momentos. b Evolución del peso muscular medido en tibial y gastrocnemio, no irradiados (NIR) e irradiados, en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 post irradiación. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a NIR; n = 8 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

Se sabe que la MO y el bazo liberan células inflamatorias después de una lesión y contribuyen al proceso inflamatorio después de la irradiación22. Los leucocitos CD11b+ correspondientes a neutrófilos y monocitos se movilizaron desde la MO o el bazo a la sangre y luego se infiltraron en el músculo irradiado (Fig. 2a, b). No vimos ninguna acumulación de monocitos en el músculo, lo que sugiere que se diferenciaron en macrófagos36. No irradiado (NIR) corresponde a compañeros de camada sacrificados en diferentes momentos y mostró resultados comparables en cuanto al número de células inflamatorias en los tejidos (sangre, bazo, médula ósea y músculos) en todo momento.

a–d Análisis cuantitativo (izquierda) y selección de citometría de flujo representativa (derecha) de recuentos de células para neutrófilos (CD45 + CD11b+Ly6G+7/4hi, línea verde), Mohi (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4hi, línea roja ) y Molo (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4lo, línea azul) (controlado en células CD45+ y CD11b+) en médula ósea, bazo, sangre y músculo, respectivamente. e Análisis cuantitativo (izquierda) y selección de citometría de flujo representativa (derecha) de recuentos de células para DC (CD45 + CD11b+CD11c+MHCII+), Mɸ similar a M1 (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII+) y Mɸ similar a M2 Mɸ (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII−) en músculo, no irradiado (NIR) e irradiado, en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 post irradiación. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a NIR; n = 8–10 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

En BM, los neutrófilos (CD11b+Ly6G+7/4hi) proliferaron significativamente en D1, D150 y D180 (P < 0,001) en comparación con NIR (Fig. 2a). Mohi (CD11b+Ly6G-7/4hi) proliferó en D14 y D180 (P < 0,05) y Molo (CD11b+Ly6G-7/4lo) en D150 y D180 (P < 0,001) respectivamente en comparación con NIR (Fig. 2a). Curiosamente, en D5, los neutrófilos, Mohi y Molo se agotaron en comparación con NIR y luego proliferaron para volver al nivel basal en D7 hasta D90. Además, los números de neutrófilos, Mohi y Molo aumentaron en el bazo en D14 y D150 (P <0.001, Fig. 2b).

En sangre, los recuentos de neutrófilos, Mohi y Molo aumentaron desde D1 hasta el final del experimento (P < 0,001, Fig. 2c).

En el músculo, se reclutaron Mohi, Molo y neutrófilos y alcanzaron su punto máximo en D1, D5 y D60 y luego regresaron al nivel basal en D3, D30 y D120 (Fig. 2d). M2-like alcanzó su punto máximo en D1 (P <0.01, Fig. 2e), mientras que las células dendríticas alcanzaron su punto máximo en D60 (P <0.01, Fig. 2e) después de la irradiación muscular. También notamos un aumento, aunque no significativo, de tipo M1 en el músculo en D60.

Estos resultados sugieren que, después de la irradiación muscular, las células inflamatorias innatas se reclutan temprana y masivamente desde el bazo y la médula ósea hacia el músculo. Además, estos resultados muestran las ondas inflamatorias consecutivas recurrentes en el tiempo después de la lesión por radiación, que corresponden a fases alternas de proliferación de células inflamatorias innatas en BM y bazo (Fig. 2a, b) y movilización a través de la sangre (Fig. 2c), y luego su infiltración en el músculo irradiado (Fig. 2d, e).

Mostramos previamente, en un modelo de ratón de lesión colorrectal, que después de la irradiación, los linfocitos T fueron reclutados para el tejido lesionado22. Aquí encontramos que, en nuestro modelo, las células T CD4 y CD8 se movilizaron de manera similar desde el bazo y mostraron una fuerte disminución significativa desde D1 (P <0.001, Fig. 3a) hasta D90. Posteriormente, las células T proliferaron y casi alcanzaron el nivel basal en D120, y luego el número de células T disminuyó nuevamente en D150 y D180 (P <0.001, Fig. 3a) en comparación con NIR. En la sangre, el número de células T aumentó y alcanzó su punto máximo en D30 y D60 (P <0,001, Fig. 3b). En el músculo, las células T se reclutaron y alcanzaron su punto máximo en D1 y D30 (P <0.001, Fig. 3c).

a–c Análisis cuantitativo (izquierda) y selección de citometría de flujo representativa (derecha) de recuentos de células para CD4 (CD45+CD3+CD4+) y CD8 (CD45+CD3+CD8+) en bazo, sangre y músculo, no irradiados (NIR) y irradiado, en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 después de la irradiación. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a NIR; n = 8–10 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

Estos resultados muestran que la irradiación localizada de las patas traseras indujo un agotamiento del número de células T en el bazo, lo que sugiere su movilización y reclutamiento desde el bazo al músculo irradiado. De manera similar a las células innatas, observamos ondas consecutivas de movilización y reclutamiento de células T en la sangre y los músculos. Sin embargo, no observamos tales ondas en el bazo, probablemente porque las células T se movilizaron inmediatamente.

Se sabe que CCL2 y CX3CL1 contribuyen a la neovascularización a través de la atracción y retención de monocitos y células T en la pierna isquémica26,37.

La expresión de ARNm de CCL2 aumentó significativamente en 11 y 14 veces en D14 y D30, respectivamente, en músculo irradiado en comparación con NIR (Fig. 4a). De manera similar, la expresión de ARNm de CX3CL1 aumentó significativamente 3,7 veces en D30 y 7,7 veces en D90 en el músculo irradiado en comparación con el tejido NIR (Fig. 4b).

a Evaluación cuantitativa de ARNm de CCL2 y CX3CL1 en músculo. b, c Evaluación cuantitativa (paneles del lado izquierdo) y fotomicrografías representativas (paneles del lado derecho) de células positivas para CD68 (b, indicadas por flechas) o células positivas para CD3 (c, indicadas por flechas) por mm2 en el no irradiado ( NIR) y músculo irradiado. Los resultados se expresaron como porcentajes relativos a NIR, ajustados al 100 % y el músculo irradiado se normalizó al músculo NIR en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 después de la irradiación, escala barra: 100 µm. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a NIR; n = 6 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

La regulación al alza de las quimioquinas se asoció con la infiltración de macrófagos y linfocitos en el músculo. En D7 y D14 después de la irradiación, el número de macrófagos positivos para CD68 aumentó 3,5 y 4 veces (P < 0,001), respectivamente, y disminuyó en D30, en comparación con el tejido NIR. El número de linfocitos CD3 positivos aumentó 39 veces en D7, 24 veces en D14 y 18 veces en D30 (Fig. 4b, c y Fig. 1 complementaria).

Estos resultados muestran que la irradiación localizada da como resultado la regulación positiva de quimiocinas como CCL2 y CX3CL1 y el reclutamiento de células inflamatorias.

A continuación, analizamos los actores proangiogénicos eNOS en el músculo después de la irradiación. Los niveles de ARNm de eNOS en el músculo irradiado aumentaron 2.8, 2.6, 2.5 y 2.3 veces, respectivamente, en D7, D14, D30 y D90 en comparación con NIR (Fig. 5a). En consecuencia, los niveles de proteína eNOS también aumentaron significativamente en D30 en 2,3 veces en comparación con NIR (P <0,001, Fig. 5b).

a–d Cuantificación de ARNm de eNOS y niveles de proteína en músculo. e, f Evaluación cuantitativa y microfotografías representativas de microangiografía (c; los vasos aparecen en blanco) y densidad capilar (d; los capilares aparecen en rojo, las flechas indican ejemplos de capilares positivos para isolectina B4, barra de escala: 100 µm). Los resultados se expresaron como porcentajes relativos a los no irradiados (NIR), establecidos en 100 %, y el músculo irradiado se normalizó a músculo NIR, en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 después de la irradiación. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a NIR; n = 5–8 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

Además, evaluamos el proceso de neovascularización después de la irradiación en el músculo utilizando enfoques independientes y complementarios de microangiografía e inmunohistoquímica. La puntuación angiográfica aumentó significativamente 1,4 veces (P < 0,01) en D14 en comparación con el grupo NIR. Además, la densidad capilar aumentó en D7 y D14 en 1.7- (P <0.05) y dos veces (P <0.001), respectivamente, en comparación con el grupo NIR (Fig. 5c, d). Además, mediante el enfoque de variable latente bayesiana38, analizamos la correlación entre el proceso de neovascularización y la movilización/reclutamiento de células inflamatorias durante la fase temprana (D0-D30) y la fase tardía (D60-D180). Desde D1 a D30 después de la irradiación, encontramos una correlación significativa entre la formación de nuevos vasos y la movilización de células CD4/CD8 (P < 0,01 ambas) del bazo y su aumento en la sangre (P < 0,05 ambas) (Tabla 1). Del mismo modo, el aumento del número de infiltrados de Mohi y su diferenciación a M1-like en el músculo irradiado se asoció con la neovascularización (P < 0,01 ambos) (tabla 1).

Sin embargo, en D60, la puntuación angiográfica volvió al nivel basal y luego disminuyó significativamente en D90, D120 y D150 (P <0.01) en comparación con el grupo NIR (Fig. 5c). Además, en D30, la densidad capilar volvió al nivel NIR y disminuyó significativamente de D60 a D180 (P <0.05) en comparación con el grupo NIR (Fig. 5d). Más importante aún, de D60 a D180, demostramos mediante el enfoque bayesiano que la disminución de los recuentos de Molo en sangre (P < 0,05) y en el músculo (P < 0,001), así como su diferenciación en M2-like en el músculo (P < 0,05 ) se correlacionó con este proceso de rarefacción vascular (tabla 1).

Para abordar directamente el papel de los monocitos/macrófagos en el proceso de neovascularización después de la irradiación de las patas traseras, investigamos con mayor precisión el papel de Mohi y Molo mediante el uso de ratones deficientes en CCR2 o CX3CR1. En ratones Ccr2-/-, los niveles circulantes de Mohi (P < 0,001, Fig. 6a) y Molo (P < 0,01, Fig. 6b) se redujeron significativamente en comparación con los ratones de tipo salvaje en D3 después de la irradiación. Además, Lu et al. mostró que la movilización de monocitos (Mohi y Molo), pero no de linfocitos o neutrófilos, se vio afectada de la MO a la sangre y de la sangre al músculo lesionado en ratones Ccr2-/-, lo que sugiere que el bajo nivel de monocitos analizados en la sangre no se debió a la presencia de extremidades posteriores. irradiación39. De manera similar, también demostramos la baja cantidad de macrófagos en el músculo CCR2-/- en comparación con los ratones WT 10 días después de la irradiación (P <0.05; Fig. 6d). A continuación, buscamos evaluar el impacto de las vías de señalización de CCR2 y CX3CR1 en el crecimiento de vasos después de la irradiación. Diez días después de la irradiación, la puntuación angiográfica se redujo en ratones deficientes en CCR2 y CX3CR1 en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje (P <0.001, Fig. 6e).

a–c Análisis cuantitativo de recuentos de células para Mohi, Molo y neutrófilos en sangre en ratones WT o ratones deficientes en CCR2 y CX3CR1. **P < 0,01; ***P < 0,001 frente a WT irradiado, n = 3–4 animales/punto temporal. d Análisis cuantitativo de la infiltración de macrófagos CD68+ de la sangre a los músculos lesionados en D10 después de la irradiación en ratones WT o ratones deficientes en CCR2 y CX3CR1, n = 5 animales/punto de tiempo. e Evaluación cuantitativa y microfotografías representativas de microangiografía en ratones WT o ratones deficientes en CCR2 y CX3CR1 10 días después de la irradiación de las patas traseras. f Evaluación cuantitativa y microfotografías representativas de microangiografía 10 días después de la irradiación de las patas traseras en animales inyectados por vía intramuscular con PBS, 105 Mohi o 105 Molo. *P < 0,05 frente a ratones inyectados con PBS. Los resultados se expresaron como porcentaje relativo al no irradiado (NIR), establecido en 100 % y el músculo irradiado se normalizó al músculo NIR, n = 5–12 animales/punto de tiempo, ANOVA +/− SEM.

Como era de esperar, nuestros resultados muestran claramente que la interrupción de las vías CCL2/CCR2 y CX3CL1/CX3CR1 dificulta el crecimiento de vasos posisquémicos.

Debido a que los monocitos de Molo son escasos en la MO y difíciles de recolectar en cantidades suficientes de la sangre, utilizamos Mohi y Molo esplénicos como sustitutos de los subconjuntos de monocitos circulantes. Además, se demostró que los subconjuntos de monocitos de sangre y bazo son casi idénticos en transcriptoma y función40. El día después de la irradiación de las patas traseras, los ratones WT C57BL/6 recibieron una inyección intramuscular de PBS, 105 Mohi o 105 Molo. 10 días después de la irradiación, la transferencia de Mohi mejoró la puntuación angiográfica (P < 0,5, Fig. 6f) en comparación con los ratones tratados con PBS. Por el contrario, la inyección de Molo no mejoró la puntuación angiográfica.

Estos hallazgos identifican claramente un papel central para la activación de Mohi en la orquestación de la inflamación vascular y la promoción de la neovascularización en la fase aguda después de la irradiación de las patas traseras.

La sobreexposición local a la radiación ionizante tiene graves consecuencias para la salud, especialmente cuando la dosis absorbida supera los 25 Gy y conduce a la necrosis tisular1. La lesión por radiación se caracteriza por ondas inflamatorias sucesivas e impredecibles durante los primeros días o semanas después de la irradiación, y esto conduce a la extensión superficial y profunda de la lesión tisular, incluida la rarefacción vascular y la caquexia muscular1. En este informe, mostramos, por primera vez, las ondas inflamatorias dinámicas que caracterizan las lesiones inducidas por radiación. En el bazo y la médula ósea, estas ondas correspondían a fases alternas entre la proliferación y movilización celular a través de la sangre y luego su infiltración en los músculos irradiados. Estas ondas fueron mucho más pronunciadas para los neutrófilos, Mohi y luego Molo principalmente en el bazo y el músculo. Sin embargo, en la sangre, el número de células circulantes innatas aumentó de D1 a D180 después de la irradiación, mientras que en el músculo irradiado, su número fue bastante bajo, lo que sugiere una acumulación en la sangre. Además, se observaron ondas de células T en sangre y músculo. Muchos estudios ya han demostrado la movilización y el reclutamiento de células inflamatorias después de la irradiación localizada colorrectal22, la isquemia femoral o el infarto de miocardio20,24,41. Sin embargo, en comparación con el modelo isquémico cardiovascular clásico14, el número de macrófagos similares a M2 en el músculo irradiado aumentó solo en D1. Tenemos varias hipótesis que podrían explicar esta observación, incluyendo (i) la proliferación de células M2 residentes en el tejido, (ii) el defecto en la salida de M2 ​​(capacidad de migración)42 o (iii) la resistencia de la apoptosis inducida por radio de las células M2 proceso en el músculo.

Varios estudios han demostrado previamente que el endotelio isquémico irradiado muestra propiedades proinflamatorias. Las células endoteliales expresan quimiocinas como CCL2 y CX3CL1, lo que lleva al reclutamiento e infiltración de células inflamatorias a través de sus receptores CCR2 o CX3CR1 para mejorar la formación de nuevos vasos26,30. Mostramos que el tejido irradiado expresa, durante la fase temprana (D0-D30 post-IR), factores proangiogénicos (eNOS) y proarteriogénicos (CX3CL1, CCL2) para inducir la movilización de células T proinflamatorias CD4-, CD8, y Mohi del bazo y BM a través de la sangre y su reclutamiento e infiltración en tejido irradiado que conduce a la diferenciación de Mohi en macrófagos similares a M1. Posteriormente, observamos una fase tardía (D60-D180 post-IR) caracterizada por una correlación entre el reclutamiento reducido de Molo antiinflamatorio y su diferenciación en M2-like, rarefacción vascular y caquexia. Aunque, en D90 después de la irradiación, pudimos detectar un aumento de la expresión de ARNm de CX3CL1 y eNOS, no observamos un aumento similar de las proteínas correspondientes, lo que está de acuerdo con la rarefacción vascular y la caquexia.

Estos resultados están en línea con la literatura sobre el papel de CCL2 y CX3CL1 en participar en el reclutamiento de células inflamatorias y mejorar la neovascularización. Por lo tanto, después de la oclusión de la arteria femoral, la infusión local o la sobreexpresión de CCL2 aumentó el número de monocitos circulantes y se demostró que su acumulación apoya la conductancia colateral y periférica y la neovascularización26,31. Los ratones deficientes en CX3CL1 contenían significativamente menos macrófagos que los controles en el modelo de aterogénesis43. Estos datos se suman a la evidencia acumulada que muestra que las rutas de monocitos/quimiocinas juegan un papel central en la regulación de la angiogénesis. Además, los linfocitos T también están involucrados en este proceso ya que los ratones desnudos, que carecen de todos los subconjuntos de células T, muestran una reducción pronunciada en el crecimiento de vasos posisquémicos23. Además, se ha sugerido que los subconjuntos de células T CD4 y CD8 desempeñan un papel en la remodelación vascular. De hecho, los ratones deficientes en CD4 y CD8 exhiben una reducción significativa en el crecimiento de vasos posisquémicos17,18.

A continuación, mostramos que los monocitos contribuyeron al proceso de neovascularización después de una irradiación localizada de las patas traseras mediante el uso de ratones deficientes en CCR2 y CX3CR1. La eliminación de CCR2 o CX3CR1 redujo el número de monocitos circulantes y disminuyó la puntuación angiográfica como se informó anteriormente. Se ha demostrado que CCR2 y CX3CR1 controlan el reclutamiento de monocitos en tejidos isquémicos30,44. CCR2 está principalmente involucrado en la regulación de los niveles circulantes de Mohi. De interés, la falta de CCR2 anula específicamente la infiltración de Mohi en el miocardio isquémico29,40. Además, se ha demostrado que la expresión de CCR2 por parte de las células de la MO, pero no por las células del tejido muscular lesionado, es necesaria para generar una respuesta inflamatoria después de una lesión muscular esquelética aguda45 para permitir la posterior arterialización de los capilares musculares46. Mohi facilita la arteriogénesis y la angiogénesis al producir factores de crecimiento35,47,48,49. Además, se ha demostrado que la señalización de CX3CR1 promueve la supervivencia de los monocitos que son células de vida corta50: es posible que se requiera la señalización de CX3CR1 endógena para la supervivencia de los monocitos que se originan en la MO recién movilizados. Esto está respaldado por nuestra observación de un número menor de monocitos Molo en ratones CX3CR1-/- en comparación con animales WT. Los ratones deficientes en CX3CR1 revelaron un reclutamiento y revascularización adecuados de monocitos para la reparación de la piel y la angiogénesis de heridas; sin embargo, la respuesta de las células mieloides y la magnitud de la neovascularización se atenuaron en comparación con los ratones de tipo salvaje51. Además, en la aterosclerosis, muchos estudios han demostrado que la señalización de CX3CL1/CX3CR1 estuvo implicada en la angiogénesis durante la formación de microvasos en placa44,52,53.

Finalmente, destacamos un papel importante de los monocitos Mohi en el crecimiento de vasos posisquémicos. La administración muscular de Mohi mejoró la arteriogénesis, mientras que la inyección de Molo no tuvo efecto en este proceso. Mostramos que la transferencia adoptiva del subconjunto inflamatorio de monocitos temprano después de la inducción de la isquemia de las patas traseras mejora notablemente la reperfusión después de la isquemia. Se ha demostrado, en un modelo de conejo de ligadura aguda de la arteria femoral, que el crecimiento de la arteria colateral depende directamente del número de monocitos circulantes25. Además, el potencial proarteriogénico distintivo podría resultar de la expresión diferencial de factores angiogénicos como MMP-926,54 a través de la liberación de VEGF55 unido a la matriz extracelular. En el infarto de miocardio, una depleción selectiva de macrófagos M2 tenía un pronóstico catastrófico con un aumento de la frecuencia de ruptura cardiaca. La reparación del tejido fue rescatada por completo por un suministro externo de macrófagos similares a M256. Estos resultados están de acuerdo con el papel de las células similares a M1 y similares a M2 en la reparación de tejidos que corresponde a sus funciones secuenciales y complementarias, ya que los macrófagos similares a M1 inician el proceso de curación al estimular la angiogénesis38,57 mientras que las células similares a M2 promueven estabilización de la angiogénesis y la maduración de los tejidos mediante el apoyo al aumento del diámetro de las fibras en regeneración58 durante la regeneración del músculo esquelético en ratones.

Por lo tanto, los monocitos/macrófagos podrían usarse como biomarcadores para evaluar y manejar el tejido irradiado para ofrecer un tratamiento personalizado de medicina regenerativa al paciente. La infiltración de macrófagos similares a M1-/M2 podría investigarse mediante tres métodos diferentes. La más adecuada para la evaluación de la infiltración de macrófagos es la citometría de flujo con mezclas de anticuerpos, pero este enfoque depende de la cantidad de tejido recolectado. Por lo tanto, la PCR y la tinción inmunohistoquímica podrían usarse para analizar la expresión de citocinas o células inflamatorias.

En resumen, mostramos que las células inflamatorias desempeñan un papel importante después de la irradiación de las patas traseras para permitir el proceso de neovascularización y mantener los vasos sanguíneos para limitar el desarrollo de la caquexia.

Todos los procedimientos con animales realizados fueron aprobados por el comité institucional de ética y experimentación con animales (C2EA) del Instituto de Protección Radiológica y Seguridad Nuclear (IRSN). Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices veterinarias francesas y las formuladas por la Comunidad Europea para uso en animales de experimentación (APAFIS#12903-2018010418086132 v1 y APAFIS #19137-2019021313569870 v1). Se utilizaron ratones C57Bl/6 macho (8 semanas de edad) como animales de experimentación (Janvier, Francia). Los machos CCR2-/-, CR3CR1-/- de ocho semanas de edad y sus compañeros de camada C57BL/6 de tipo salvaje (WT) se compraron en Jackson Laboratories. Todos los animales se mantuvieron en condiciones estables de microambiente (22 ± 1 °C), con alternancia de ciclos de luz y oscuridad de 12 h y recibieron alimentos y agua estándar de laboratorio. Los ratones se anestesiaron con inhalación de isoflurano (2 %) y su pata trasera derecha se expuso a una dosis única de irradiación de 80 Gy utilizando rayos X de 10 MV a 2,6 Gy/min en un campo de irradiación de 2 x 24 cm (Elekta Synergy Platform, Elekta SAS, Boulogne-Billancourt, Francia).

La cinética de la evolución de la lesión se evaluó mediante un análisis semicuantitativo. Se asignó una puntuación entre 0 (normal) y 1 (lesión máxima) a cada signo clínico, incluida la extensión de la herida, la ulceración, la descamación húmeda y la retracción de la extremidad, lo que dio como resultado una lesión total con una puntuación de hasta 5 durante el desarrollo de la herida y el proceso de curación cada semana posterior. irradiación.

Los gastrocnemios se extirparon, se enjuagaron en PBS y se congelaron en nitrógeno líquido. Los tejidos se cortaron utilizando un criostato en secciones de 7 μm de espesor.

Los macrófagos y las células positivas para CD3 se visualizaron después de la tinción con anticuerpo CD68 (1/250, Biorad) o CD3 (1/250, DAKO) seguido de una tinción con burro 488-AF-anti-rata o IgG anti-conejo (1/250 , Jackson ImmunoResearch) respectivamente. Las células positivas para CD68 y CD3 se contaron en campos elegidos al azar con el uso del software Image J (NIH). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para analizar la estructura muscular.

Después de la irradiación, la neovascularización se evaluó mediante dos métodos diferentes como anteriormente59.

En el momento del sacrificio, los ratones fueron anestesiados (Alfaxan (80 mg/kg de peso corporal) y Xilazina (10 mg/kg de peso corporal), y se les realizó laparotomía longitudinal para introducir un catéter de polietileno en la aorta abdominal e inyectar medio de contraste (bario sulfato, 1 g/mL).Luego se realizó una angiografía de las patas traseras y se adquirieron imágenes (dos por animal) con el uso de un transductor digital de rayos X de alta definición.Las imágenes se ensamblaron para obtener una vista completa de las patas traseras. El número de píxeles ocupados por los vasos se midió en el área de cuantificación con el uso del software Primed angio (Trophy System, París, Francia).El área de cuantificación estaba limitada por la ubicación de la ilíaca, la rodilla, el borde del fémur , y el límite externo de la pierna.Los resultados se expresaron luego como una relación entre la pierna irradiada y la no irradiada.

Se extirpó el músculo gastrocnemio de la derecha (extremidad irradiada) y de la izquierda (extremidad NIR) y se congeló en compuesto OCT (Sakura Finetek France, Villeneuve d'ASCQ, Francia) para la criosección. Las secciones de músculo congeladas (7 µm) se tiñeron usando un GSLI-isolectina B4 marcado con DyLight 594 (Vector Laboratories, dilución 1:200) para identificar los capilares. Se determinó el número de capilares por mm2 en el área muscular.

Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de la sedación con inhalación de isoflurano (4%) en los días 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 o 180 después de la irradiación de las patas traseras (n = 8-10 ratones por punto de tiempo). Se extrajo sangre periférica mediante punción de vena cava inferior con solución de heparina. La sangre completa se lisó después de la tinción de inmunofluorescencia usando la solución de lisis BD FACS (BD Biosciences), y el número total de leucocitos en sangre se determinó usando portaobjetos de Kova. Se extrajeron células de médula ósea del fémur y se filtraron a través de una malla de nailon de 40 μm (BD Biosciences). Se recogieron los bazos y se pasaron suavemente a través de una malla de nailon de 40 μm (BD Biosciences). Tanto para los esplenocitos como para las células derivadas de la médula ósea, la suspensión celular se centrifugó a 400 xg durante 10 min a 4 °C. Los glóbulos rojos se lisaron usando tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma-Aldrich) y los esplenocitos y las células de la médula ósea se lavaron con PBS. Se recogieron los músculos irradiados y no irradiados, se trituraron con tijeras finas y se pasaron suavemente a través del desagregador de tejidos de 12 pocillos Bel-Art Scienceware (ThermoFisher Scientific). Luego, las células se filtraron a través de una malla de nailon (40 μm) y se centrifugaron (10 min, 400 × g, 4 °C).

Las células aisladas del tejido de interés se incubaron en la oscuridad a 4 °C durante 30 min con la siguiente mezcla de anticuerpos. Para la detección de células inflamatorias, las células totales se seleccionaron en anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD11b conjugado con FITC (ThermoFisher Scientific), anti-Ly-6B.2 conjugado con APC (clon 7/4, Biorad), PE- anti-Ly6G conjugado, anti-CD64 conjugado con PB, anti-F4/80 conjugado con APC, anti-MHCII conjugado con PerCP5.5 (BD Biosciences), anti-CD4 conjugado con FITC (clon RM4-5; eBioscience), PercpCy5 anti-CD8 conjugado (clon 53-6.7, BD Pharmingen), anti-CD3 conjugado con APC (clon 17A2, eBioscience), anti-CD11c conjugado con PE-Cyanine7 (clonN418, eBioscience) durante 30 min a 4 °C.

Usamos diferentes mezclas de anticuerpos en diferentes tejidos de la siguiente manera:

Médula ósea: mezcla 1: Mo: anti-CD11b conjugado con FITC, anti-Ly-6B.2 conjugado con APC, anti-Ly6G conjugado con PE; mezcla 2: linfocitos: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD4 conjugado con FITC, anti-CD8 conjugado con PercpCy5, anti-CD3 conjugado con APC,

Bazo: mezcla 1: Mo: anti-CD11b conjugado con FITC, anti-Ly-6B.2 conjugado con APC, anti-Ly6G conjugado con PE; mezcla 2: linfocitos: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD4 conjugado con FITC, anti-CD8 conjugado con PercpCy5, anti-CD3 conjugado con APC,

Sangre: mezcla 1: Mo: anti-CD11b conjugado con FITC, anti-Ly-6B.2 conjugado con APC, anti-Ly6G conjugado con PE; mezcla 2: linfocitos: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD4 conjugado con FITC, anti-CD8 conjugado con PercpCy5, anti-CD3 conjugado con APC,

Músculo: mezcla 1: Mo: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD11b conjugado con FITC, anti-Ly-6B.2 conjugado con APC, anti-Ly6G conjugado con PE; mezcla 2: linfocitos: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD4 conjugado con FITC, anti-CD8 conjugado con PercpCy5, anti-CD3 conjugado con APC, mezcla 3: macrófagos: anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD4 conjugado con FITC CD11b, anti-Ly6G conjugado con PE, anti-CD64 conjugado con PB, anti-F4/80 conjugado con APC, anti-MHCII conjugado con PerCP5.5, anti-CD11c Mohi conjugado con PE-Cyanine7 (CD11b+Ly6G–7/ 4hi), Molo (CD11b+Ly6G–7/4lo), células similares a M1 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII+) y células similares a M2 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII-) , CC (CD11c+MHCII+), CD4 (CD3+CD4+) y CD8 (CD3+CD4+).

A continuación, se normalizó el número total de células al peso del músculo. Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (Canto II, BD Biosciences).

El ARN total se extrajo de muestras de músculo congelado con reactivo Trizol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Francia). Después de la cuantificación en un aparato NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Rockland, DE), se realizó la transcripción inversa utilizando QuantiTect Reverse Transription (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó con ABI PRISM 7900 usando Power SYBR PCR Master Mix (Bioline). Se usó Ct para GAPDH de ratón para normalizar la amplificación de las muestras. Los siguientes oligonucleótidos (Applied Biosystems) sirvieron como cebadores: GAPDH directo: 5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGTGAA-3′, inverso: 5′-GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3′; eNOS adelante: 5′-CGCCCACCCAGGAGAGATCCAC-3′, inverso 5′-GCATCGGCAGCCAAACACCAAAGT-3′; CCL-2 hacia delante: 5′-CCCCACTCACCTGCTGCTA-3′, hacia atrás 5′-TTACGGGTCAACTTCACATTCAAA-3′; CX3CL1 adelante: 5′-GTGGCTTTGCTCATCCGCTATCAG-3′, atrás: 5′-CACATTGTCCACCCGCTTCTCA-3′.

Se realizó la preparación de extractos proteicos. Brevemente, para preparar la proteína total, los músculos tibiales anteriores de las patas traseras irradiadas y no irradiadas se homogeneizaron en tampón RIPA (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato al 1 %, SDS con inhibidores de proteasa y fosfatasa). Las proteínas se resolvieron en electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente y se transfirieron a láminas de nitrocelulosa de 0,2 μm (Biorad, Marnes la Coquette, Francia). Se usaron anticuerpos contra eNOS (1:1000; BD Biosciences) para la inmunotransferencia. Como control de carga de proteínas, las membranas se despojaron y se incubaron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra GAPDH (1:10.000, Abcam) y se detectó una señal quimioluminiscente específica.

Para el experimento de transferencia adoptiva, se disociaron mecánicamente bazos de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad en un filtro de células de 40 mm. Los esplenocitos se tiñeron con anti-CD45 conjugado con AF700, anti-CD11b conjugado con FITC, anti-Ly-6B.2 conjugado con APC, anti-Ly6G conjugado con azul del Pacífico y anti-NK1.1 conjugado con PE. Luego se seleccionaron CD11b+Ly6G-NK1.1- 7/4hi y CD11b + Ly6G2NK1.1- 7/4lo usando un FACS BD InFlux. La pureza para ambos subconjuntos fue del 99%. Antes de la inyección, las células se contaron por exclusión con azul de tripano. En total, se inyectaron por vía intramuscular 105 monocitos Mohi o 105 monocitos Molo a los receptores C57BL/6 al día siguiente de la irradiación de las patas traseras.

Los resultados se expresaron como ± SEM. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para comparar cada parámetro. A continuación, se realizaron comparaciones post hoc de la prueba t de Bonferroni para identificar qué diferencias de grupo explican el ANOVA general significativo. Se consideró significativo un valor de P < 0,05.

La investigación de la asociación estadística entre la infiltración de células inflamatorias y subconjuntos de leucocitos en una mano con la neovascularización posisquémica en la otra mano es un desafío, ya que estas dos medidas se realizaron en diferentes cohortes de animales. Esto hace que los enfoques estadísticos clásicos sean ineficientes ya que las variables predictivas y de respuesta no se observan en el mismo sujeto. El modelo bayesiano de variables latentes60 ofrece la posibilidad de incluir antecedentes sobre la distribución de las células inflamatorias y los recuentos de subconjuntos de leucocitos para estimar su correlación con el crecimiento de los vasos. El ajuste del modelo se realizó utilizando el software JAGS a través de la cadena de Markov Monte Carlos. Todos los valores de P en las diferentes secciones de análisis estadístico se corrigieron para múltiples pruebas utilizando el procedimiento de Benjamini y Hochberg.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldaron los hallazgos de este estudio se incluyen en este documento y sus archivos de información complementaria y datos complementarios 1.

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La Dra. Celine Loinard cuenta con el apoyo del Instituto de Protección Radiológica y Seguridad Nuclear (IRSN), Fontenay-aux-Roses, Francia.

Instituto de Protección Radiológica y Seguridad Nuclear (IRSN), Fontenay-aux-Roses, Francia

Céline Loinard, Mohamed Amine Benadjaoud, Bruno Lhomme, Stéphane Flamant y Radia Tamarat

CEA, Fontenay-aux-Roses, Francia

Jan Baijer

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CL y RT concibieron el estudio, diseñaron los experimentos e interpretaron los datos. CL, MAB, BL, SF y JB realizaron los experimentos y analizaron los datos. CL y RT escribieron el manuscrito con la aprobación final de todos los coautores.

Correspondencia a Céline Loinard.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Jemond Dalli y Karli Montague-Cardoso. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Loinard, C., Benadjaoud, MA, Lhomme, B. et al. La dinámica de las células inflamatorias controla la neovascularización y la curación de tejidos después de una lesión inducida por radiación localizada en ratones. Commun Biol 6, 571 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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Recibido: 04 julio 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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