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Mar 08, 2023

Retrotransposición somática generalizada de L1 en el epitelio colorrectal normal

Naturaleza volumen 617, páginas

Nature, volumen 617, páginas 540–547 (2023)Citar este artículo

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A lo largo de la vida de un individuo, las alteraciones genómicas se acumulan en las células somáticas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, el panorama mutacional inducido por la retrotransposición del elemento nuclear-1 (L1) intercalado durante mucho tiempo, un elemento móvil generalizado en el genoma humano12,13,14, es poco conocido en las células normales. Aquí exploramos las secuencias del genoma completo de 899 clones de una sola célula establecidos a partir de tres tipos de células diferentes recolectados de 28 individuos. Identificamos 1.708 eventos de retrotransposición L1 somática que se enriquecieron en el epitelio colorrectal y mostraron una relación positiva con la edad. Las huellas dactilares de los elementos fuente mostraron 34 L1 competentes en retrotransposición. El análisis multidimensional demostró que (1) las retrotransposiciones somáticas de L1 ocurren desde la embriogénesis temprana a una tasa sustancial, (2) la activación/desactivación epigenética de un elemento fuente se determina preferentemente en la etapa temprana de organogénesis, (3) las L1 competentes en retrotransposición con una población más baja la frecuencia alélica tiene una mayor actividad de retrotransposición y (4) solo una pequeña fracción de las transcripciones de L1 en el citoplasma finalmente se retrotransponen en las células somáticas. El análisis de los cánceres emparejados sugirió además que la tasa de retrotransposición de L1 somática aumenta sustancialmente durante la tumorigénesis colorrectal. En resumen, este estudio ilustra el mosaicismo somático inducido por la retrotransposición L1 en células normales y proporciona información sobre la regulación genómica y epigenómica de los elementos transponibles durante la vida humana.

Las mutaciones somáticas se acumulan espontáneamente en las células normales a lo largo de la vida de un individuo, desde la primera división celular2,3,4,5. Los estudios previos sobre el mosaicismo somático se han centrado principalmente en las variantes de nucleótidos6,7,8,9,10,11. Los eventos estructurales más complejos permanecen menos explorados debido, en parte, a su relativa escasez y desafíos técnicos en la detección, particularmente en la resolución de una sola celda.

Los retrotransposones del elemento nuclear 1 (L1) intercalados largos son elementos transponibles generalizados que representan aproximadamente el 17 % del genoma humano12,13,14. Evolutivamente, los retrotransposones L1 son una unidad parasitaria notablemente exitosa en la línea germinal al 'copiarse y pegarse' a sí mismos en nuevos sitios genómicos15. Sin embargo, la mayoría de las aproximadamente 500 000 L1 en el genoma de referencia humano no pueden transponerse más porque están truncadas y han perdido su potencial funcional. Hasta la fecha, se han descubierto 264 fuentes L1 competentes en retrotransposición (rc-L1) en genomas de cáncer16,17 u otros estudios experimentales12,13,18,19,20,21. Ocasionalmente, se han encontrado retrotransposiciones L1 en análisis genéticos de tejidos en varias enfermedades22,23, lo que implica su papel en el desarrollo de enfermedades humanas y requiere una caracterización más sistemática.

Los eventos de retrotransposición L1 somática (soL1R) se han explorado sistemáticamente en tejidos cancerosos16,17,24. Los tipos de cáncer específicos, incluidos los adenocarcinomas de esófago y colorrectal, mostraron una mayor carga de soL1R, lo que a menudo conduce a la alteración de los genes del cáncer17. En tejidos normales policlonales, soL1R aún no se ha estudiado claramente porque es un desafío detectar instancias limitadas a una pequeña fracción de células. Aunque anteriormente se han empleado varias técnicas para mostrar soL1R en neuronas normales, se han informado tasas de soL1R inconsistentes en todos los estudios, que van desde 0,04 a 13,7 soL1R por neurona25,26,27,28,29,30.

Para explorar sistemáticamente el mosaicismo inducido por soL1R en células normales, investigamos secuencias de genoma completo de colonias expandidas a partir de células individuales (en adelante, clones)2,4. Nuestros enfoques permitieron además la creación de perfiles multiómicos simultáneos a partir de clones idénticos31 y la detección precisa de eventos embriogénicos tempranos compartidos por múltiples clones2,4,5.

En total, exploramos 899 secuencias de genoma completo de clones (Fig. 1a) establecidos a partir de epitelio colorrectal (406 clones de 19 donantes), fibroblastos recolectados de varios lugares (341 clones de siete donantes)4, células madre y progenitoras hematopoyéticas (140 clones de un donante)9 y pólipos adenomatosos asociados a MUTYH en el colon (12 clones de cuatro pólipos de un donante). Además, investigamos 19 tejidos de cáncer colorrectal compatibles de donantes de clones colorrectales normales (Tabla complementaria 1). A partir de estas secuencias, evaluamos mutaciones adquiridas somáticamente, incluidas variantes de un solo nucleótido (SNV), indels, variaciones estructurales y soL1R (Tabla complementaria 1). Estas mutaciones confirmaron que la gran mayoría de los clones se establecieron a partir de una única célula fundadora no neoplásica sin artefactos frecuentes asociados al cultivo (Datos ampliados Figs. 1a,b).

a, Diseño experimental del estudio. HSC, células madre y progenitoras hematopoyéticas. b, Proporción de clones con varios números de soL1R en diferentes tipos de células (el número de clones se muestra entre paréntesis). c, Proporción de clones colorrectales normales con varios números de soL1R en 19 individuos (el número de clones se muestra entre paréntesis). d, Regresión lineal del número promedio de soL1R por clon según la edad en 19 individuos con clones colorrectales normales. La línea vertical que cruza cada punto indica el rango de carga de soL1R por clon en cada individuo. La línea azul representa la línea de regresión y las áreas sombreadas indican su intervalo de confianza del 95 %. Dos individuos atípicos (HC15 y HC06) están resaltados en rojo. e, f, Filogenias clonales tempranas de HC14 (e) y HC19 (f) reconstruidas por mutación puntual somática. Las longitudes de las ramas son proporcionales al número de mutaciones somáticas, que se muestran con números al lado de las ramas. Las ramas embrionarias tempranas están coloreadas por la fracción alélica variante (VAF) de las mutaciones embrionarias tempranas (EEM) en la sangre. El número de soL1R detectados se muestra en los círculos rellenos en las puntas de las ramas. Los gráficos circulares indican la proporción de células sanguíneas que albergan EEM o soL1R. Segmento RT, segmento retrotranspuesto. g, tasas de soL1R normalizadas en varias etapas y tipos de células.

Entre los 887 clones normales y los 12 adenomatosos asociados con MUTYH, identificamos 1250 y 458 soL1R, respectivamente, mediante un análisis combinado utilizando cuatro herramientas bioinformáticas diferentes (Datos extendidos Fig. 1c y Tablas complementarias 1 y 2). Es de destacar que los eventos soL1R se distinguieron claramente de otros reordenamientos genómicos debido a las dos características canónicas de la retrotransposición: la cola poli-A y la duplicación del sitio objetivo (TSD; Datos extendidos Fig. 1d, e). Múltiples pruebas indicaron que la mayoría de los soL1R en los clones eran verdaderos eventos somáticos en lugar de eventos inducidos por el cultivo (Discusión complementaria 1 y Figura complementaria 1). Además, encontramos además 572 soL1R de los 19 cánceres coincidentes, el 97,2 % de los cuales (n = 556) fueron eventos clonales compartidos por todas las células cancerosas en el tejido. Para los otros tipos de retrotransposones, también detectamos nueve inserciones Alu somáticas en clones normales (Tabla complementaria 2).

De los 1250 soL1R en los 887 clones sanos, el 98,9 % (n = 1236) se detectaron en el epitelio colorrectal, lo que muestra una especificidad de tipo celular extrema (P = 9,0 × 10−173, prueba exacta de Fisher bilateral). La mayoría de los clones colorrectales normales (n = 359, 88 %) albergaban al menos un soL1R, en promedio tres eventos por clon (Fig. 1b). Sorprendentemente, los soL1R fueron más abundantes que otros tipos clásicos de variación estructural somática en clones (Datos extendidos, Fig. 1f).

En el epitelio colorrectal encontramos variaciones sustanciales en la carga de soL1R entre clones e individuos. La carga de soL1R en los clones colorrectales estuvo entre cero y 18 por clon (Fig. 1c). Cuando se promediaron, las cargas de soL1R mostraron una relación amplia pero positiva con la edad de los individuos (0.028 soL1R por clon por año; Fig. 1d), similar a la propiedad similar a un reloj de los SNV e indeles somáticos endógenos (Datos extendidos Fig. 2a)32 . Esto implica que los soL1R se adquieren a una tasa de fondo más o menos constante a lo largo de la vida en el epitelio colorrectal. Dos individuos atípicos sugieren además una predisposición genética y/o exposiciones ambientales que estimulan las actividades de L1 (Fig. 1d).

Las cargas de soL1R no se asociaron fuertemente con otras características, como el sexo y la ubicación anatómica de los clones en el colon (Datos extendidos Fig. 2b,c). A nivel de clon individual, la carga de soL1R no mostró una asociación marcada con otras características genómicas, como la carga de mutaciones puntuales, la longitud de los telómeros, la actividad de los procesos SNV endógenos a las células33 (SBS1 y SBS5/40; firmas estándar en la base de datos COSMIC), la exposición a especies reactivas de oxígeno (SBS18) o colibactina de pks+ Escherichia coli34 (SBS88) (Datos extendidos Fig. 2d–i).

Los SoL1R en células normales no se limitan al epitelio colorrectal, porque detectamos 37 adicionales en 259 parches microdiseccionados por captura con láser (LCM) de 13 órganos5,11 (Datos extendidos Fig. 2j y Tabla complementaria 3). Sin embargo, estas cargas no deben compararse directamente con las de los clones colorrectales porque la sensibilidad de detección de soL1R se ve comprometida en la secuenciación del genoma completo basada en LCM (WGS; Discusión complementaria 2 y Figuras complementarias 2 y 3).

De los 1250 soL1R en clones normales, 30 fueron compartidos por dos o más clones en un individuo (diez eventos cuando colapsaron), lo que implica que estos eventos estaban presentes en las células ancestrales comunes más recientes de los clones. Las filogenias de desarrollo de los clones, reconstruidas usando mutaciones poscigóticas como se informó anteriormente4,5 (Fig. 1e,f y Datos extendidos Figs. 3 y 4), demostraron claramente que estos soL1R eran eventos embrionarios. Por ejemplo, un evento soL1R en HC14, compartido por seis clones colorrectales (seis de 19 clones, 32 % de frecuencia clonal), se adquirió en una célula ancestral en el nodo de segunda generación en la filogenia (Fig. 1e). Además de la posición del nodo, el número de mutaciones puntuales poscigóticas (n = 5) en el nodo ancestral apoyó la idea de que el evento ocurrió en el embrión en etapa de cuatro células, dado que las dos primeras generaciones de células en el desarrollo humano generan de 2,4 a 3,8 mutaciones por célula por división celular (ppcd) y las generaciones posteriores de células generan de 0,7 a 1,2 mutaciones pcpcd4,5. Como se esperaba para un evento previo a la gastrulación, se observó soL1R en una secuencia de genoma completo de aproximadamente 200x de sangre periférica (origen mesodérmico) con una frecuencia celular de alrededor del 34 % más allá del epitelio colorrectal (origen endodérmico; Fig. 1e). De manera similar, una inserción Alu somática, encontrada en HC04, probablemente también se obtuvo en la etapa previa a la gastrulación (Datos extendidos Fig. 4).

Los otros nueve soL1R compartidos probablemente fueron eventos embrionarios posteriores a la gastrulación, dadas las posiciones aguas abajo y el tiempo molecular de sus nodos ancestrales en la filogenia (16-56 mutaciones puntuales de tiempo molecular, equivalentes a las generaciones celulares 11-78 asumiendo la tasa de mutación de punto fijo antes mencionada en la embriogénesis)4,5 y la ausencia de soL1R en alrededor de 200 × secuencias de sangre del genoma completo (Fig. 1f y datos extendidos, Figs. 3 y 4).

Para la comparación de varios estadios y tipos de células, calculamos las tasas de soL1R contando el número de eventos de soL1R por número de mutaciones puntuales endógenas32,33 (EPM; definidas como SBS1 y SBS5/40 SNV e ID1 e ID2 indels). La tasa de soL1R en las ramas colorrectales terminales (epitelio colorrectal posterior al desarrollo) fue de 1,2 por 1000 EPM (Fig. 1g). Esta tasa fue unas cuatro veces mayor en las ramas embrionarias posteriores a la gastrulación que se diferenciaron en epitelio colorrectal (4,52 por 1000 EPM, P = 8,4 × 10−4, prueba exacta de Poisson bilateral), equivalente a entre 1,1 × 10−3 y 9,0 × 10− 3 soL1R pcpcd (suponiendo una tasa de mutación puntual endógena temprana fija4,5). La estimación puntual de la tasa de soL1R en las ramas previas a la gastrulación fue de 1,06 por 1000 EPM, aunque encontramos uno de esos casos en 28 individuos (Fig. 1e). Por el contrario, las tasas fueron cercanas a cero por 1000 EPM para linajes de sangre y fibroblastos, independientemente de las etapas embrionarias y posteriores al desarrollo (Fig. 1g).

Los segmentos retrotranspuestos en soL1R de clones colorrectales normales eran principalmente la fracción 3' de secuencias L1 repetitivas (n = 1063, 89%; conocido como solo-L1; Fig. 2a)16. Ocasionalmente, las secuencias descendentes únicas de las fuentes L1 se retrotranspusieron con o sin secuencias L1 (conocidas como transducciones asociadas (n = 11, 1 %) y huérfanas (n = 124, 10 %), respectivamente; Fig. 2a)16. En eventos de transducción, la toma de huellas dactilares de sus elementos de origen es posible utilizando las secuencias únicas como un código de barras de fuentes L116.

a, Diagrama esquemático de tres clases de retrotransposición L1: solo-L1, transducción asociada y transducción huérfana. b, El paisaje de eventos de transducción con las características de 34 rc-L1. TD, transducción; AFR, africanos; EUR, europeos; EAS, asiáticos orientales; SAS, Sudasiáticos; AMR, estadounidenses. c, Relación entre la frecuencia alélica de la población de rc-L1 y su actividad de retrotransposición normalizada. Los puntos verdes indican fuentes privadas encontradas en un solo individuo; los puntos rojos indican fuentes predominantemente activas; los puntos negros y grises indican fuentes comunes que contribuyen con eventos de transducción y sin eventos en nuestro estudio, respectivamente. La línea azul representa la línea de regresión de fuentes activas, pero no predominantes, y las áreas sombreadas indican su intervalo de confianza del 95 %. TPAM, número de transducciones por alelo L1 por 1 millón de mutaciones puntuales endógenas de tiempo molecular. d, Proporción de la subfamilia L1 y prevalencia de mutaciones truncadas de fuentes rc-L1 en su PAF. Los grupos con PAF < 25, 25 < PAF < 75 y PAF > 75 tienen diez, 34 y 90 fuentes L1, respectivamente.

Combinando clones colorrectales y tejidos cancerosos, encontramos 217 eventos de transducción con 34 fuentes L1 que los abarcan, lo que confirma su competencia de retrotransposición (Fig. 2b y Tabla complementaria 4). De estos, 12 (35%) eran nuevos rc-L1 porque no se superponían con 264 fuentes activas previamente conocidas12,13,16,17,18,19,20,21. Las nuevas fuentes rc-L1 incluyen tres tipos: (1) una fuente de línea germinal referenciada (presente tanto en el genoma de referencia humano como en la línea germinal del individuo), (2) siete fuentes de línea germinal no referenciadas (ausentes en el genoma de referencia pero presente en la línea germinal) y (3) cuatro fuentes adquiridas poscigóticamente ausentes tanto en el genoma de referencia como en la línea germinal (Datos ampliados Fig. 5). Es de destacar que cuatro nuevas fuentes de línea germinal no referenciadas (17q25.3, 1q23.3-1, 1p22.1 y 2q21.1-2; Fig. 2b y Tabla complementaria 4) eran privadas de un individuo y no se observaron en nuestro panel de línea germinal que abarca 2.860 individuos de cinco ascendencias. Esto indica que la adquisición de nuevas fuentes de rc-L1 está en curso en el conjunto del genoma humano, como sugieren los estudios del genoma basados ​​en la población12,21,35.

Cada una de las 34 fuentes de rc-L1 contribuyó a un número diferente de transducciones en clones colorrectales (Fig. 2b). Por ejemplo, cuatro fuentes L1 (22q12.1-2, 1p12, Xp22.2-1 y 12p13.32) afectaron a una gran fracción (al menos el 50 %) de las personas, lo que provocó aproximadamente el 50 % de los eventos de transducción somática en nuestro estudio. . Estos cuatro rc-L1 prevalecieron en la población, mostrando alrededor del 100% de la frecuencia alélica de la población (PAF) en el conjunto del genoma humano (Fig. 2b).

Excepto por estos cuatro rc-L1 'prevalentemente activos', los rc-L1 de PAF altos mostraron una actividad baja de soL1R en el epitelio colorrectal. La mayoría de los 90 rc-L1 con PAF superior al 75 % contribuyeron con ninguno (81, 90 %) o con un evento soL1R (4, 4 %) en los 406 clones colorrectales. Por el contrario, los elementos fuente raros a menudo se retrotranspusieron en múltiples clones de un individuo que tenía la fuente en la línea germinal. Por ejemplo, la fuente privada 17q25.3 contribuyó con seis eventos en 22 clones colorrectales de HC13 (Fig. 2b).

Para comparar las actividades de retrotransposición en diferentes elementos fuente, se contaron las transducciones de cada rc-L1 por alelo L1 por 1 millón de EPM de tiempo molecular (denominado TPAM) en linajes colorrectales normales en individuos que albergan la fuente. Curiosamente, las tasas de TPAM generalmente mostraron una correlación negativa con el PAF de rc-L1s (Fig. 2c). Las fuentes raras mostraron actividades de retrotransposición más altas que las fuentes predominantes, a excepción de los cuatro rc-L1 activos predominantes. Estas características están en línea con la relación inversa entre la prevalencia y la penetrancia de las variantes genómicas humanas36. Debido a que las rc-L1 pueden causar mutagénesis por inserción, que es potencialmente dañina, su actividad debe ser reprimida a través de mecanismos genéticos y/o epigenéticos. Las fuentes ultra raras probablemente preceden a una selección negativa suficiente porque surgieron en la población humana hace relativamente poco tiempo12.

Para comprender la base genética de las actividades diferenciales a través de rc-L1, exploramos los polimorfismos de secuencia de los elementos fuente utilizando WGS de lectura larga de dos clones colorrectales. Los elementos fuente predominantes en la población se encontraban predominantemente en las subfamilias L1 más antiguas (como pre-Ta y PA2), como se sugirió anteriormente12, y albergaban mutaciones que alteran el marco de lectura abierta con más frecuencia que los elementos fuente raros (Fig. 2d y Tabla complementaria 4).

Para explorar la base epigenética de las actividades diferenciales de rc-L1 en células normales, combinamos la metilación del ADN del genoma completo (en 139 clones) y los perfiles de expresión de ARN (en 116 clones) en un subconjunto de clones establecidos (Figs. 1a y 3a). Como se informó para los tejidos a granel16,37, estos clones representaron una fuerte correlación negativa entre la metilación y la transcripción del promotor L1 específico del locus (Datos ampliados Fig. 6), lo que sugiere que la desmetilación del promotor L1 es un interruptor principal para la transcripción L1.

a, Diagrama esquemático del análisis multidimensional. b, Panorama del estado de metilación del ADN de 30 rc-L1 con filogenias de desarrollo para 132 clones colorrectales normales y siete clones de fibroblastos de nueve individuos. Incluye 14 rc-L1 que contribuyen a cualquier evento de transducción en estos clones y 16 rc-L1 adicionales que muestran promotores desmetilados en al menos cinco clones. El número de mutaciones puntuales específicas de rama se muestra en las filogenias. c, d, estado de metilación del ADN y nivel de transcripción de lectura completa de rc-L1 en 22q12.1-2 (c) y 12p13.32 (d). e, Proporción de no truncamiento y desmetilación del promotor de 90 rc-L1 prevalentes en la población. Puntos rojos, fuentes predominantemente activas; puntos negros y grises, fuentes comunes que muestran cualquier y ningún evento de transducción en nuestro estudio, respectivamente. f, Diferencias en la metilación del promotor rc-L1 en pares de clones según su tiempo de ramificación embrionaria. Se consideraron los 30 rc-L1 principales que mostraban una variación sustancial en la metilación del promotor. Se utilizó una tasa de mutación fija4 para convertir el tiempo de mutación en generación de células embrionarias. %P, punto porcentual; *P < 2,2 × 10−16 (prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras). g,h, perfil de metilación de regiones aguas arriba y aguas abajo de 100 kb de rc-L1 en 22q12.1-2 (g) y 1p12 (h). Los loci rc-L1 están resaltados por rectángulos amarillos. Arriba, coordenadas genómicas y orden de los sitios CpG. Medio, fracción de CpG metilada en clones colorrectales (oro) y fibroblastos (plata) (g), y en clones colorrectales con promotores abiertos (naranja) y cerrados (azul) (h). Abajo, diferencias en la fracción de CpG metilado representadas en el panel central. mCpG, CpG metilado.

La frecuencia de desmetilación del promotor (y la transcripción resultante) varió según los tipos de células y los elementos de origen (Fig. 3b, Datos extendidos Fig. 7, Discusión complementaria 3 y Figs. complementarias 4 y 5). Aunque predominantemente metilados en clones de fibroblastos, los promotores rc-L1 a menudo estaban marcadamente desmetilados en clones colorrectales. Por ejemplo, los promotores de fuentes predominantemente activas 22q12.1-2 y 12p13.32 mostraron desmetilación bialélica frecuente (y la transcripción de ARN resultante) en clones colorrectales (Fig. 3b-d). Ocasionalmente, la frecuencia clonal de una desmetilación del promotor rc-L1 fue más frecuente en individuos específicos, como se observó en las fuentes 5q14.1-1 y 14q12-3 (Fig. 3b). Los perfiles de metilación del ADN del genoma completo de varios tejidos a granel38 sugieren que el tejido del colon tiene una mayor frecuencia de desmetilación del promotor rc-L1 que cualquier otro tipo de célula (Datos ampliados, Fig. 8a).

Es de destacar que observamos que los rc-L1 predominantes en la población se reprimían con frecuencia a través de la metilación del promotor y/o el truncamiento genético. De los 90 rc-L1 predominantes en la población (PAF > 75 %), 68 (75,6 %) mostraron una metilación del promotor predominante en más del 75 % de los clones colorrectales (Fig. 3e). De los otros 22 rc-L1 no metilados preferentemente por el promotor (como 12q13.13), diez albergaban mutaciones de truncamiento del marco de lectura abierto en todos los alelos informativos de la secuenciación de lectura larga. Los 12 rc-L1 restantes, particularmente las cuatro fuentes predominantemente activas (22q12.1-2, Xp22.2-1, 1p12 y 12p13.32), escaparon de la represión tanto genética como epigenética, lo que puede indicar los roles funcionales del fuentes39.

El análisis multidimensional proporcionó además cuatro conocimientos sobre la regulación epigenética de los elementos fuente y la actividad posterior de soL1R. Primero, la desmetilación del promotor rc-L1 es una condición previa para los soL1R. Un elemento fuente que causa cualquier evento de transducción en un clon siempre fue promotor desmetilado en el clon correspondiente (Fig. 3b; 47 de 47, resaltado por rectángulos rojos; 37 desmetilaciones homocigotas y diez heterocigotas). Esto indica además que el promotor rc-L1 desmetilado es estable en los linajes somáticos a lo largo del tiempo, porque su metilación inversa interrumpiría tal asociación exclusiva.

En segundo lugar, el epigenotipo del promotor L1 se determina principalmente en la embriogénesis. La desmetilación del promotor autosómico rc-L1 fue predominantemente homocigota (Fig. 3b-d), lo que sugiere que se hereda directamente de la reprogramación epigenética previa a la gastrulación, que elimina globalmente las metilaciones del ADN en el genoma40,41,42. Un escenario alternativo, la pérdida estocástica de metilación en el proceso de envejecimiento, es menos probable porque preferentemente dará forma a la desmetilación en un alelo. Más bien, nuestros hallazgos sugieren que los promotores rc-L1 completamente desmetilados formados en la etapa embrionaria más temprana no se remetilan lo suficiente posteriormente en los linajes epiteliales colorrectales (Fig. 3b). La remetilación debería ser más completa en los linajes de fibroblastos porque los clones de fibroblastos mostraron una metilación del promotor rc-L1 casi completa (Fig. 3b). El tiempo molecular en las filogenias clonales también indica que el proceso de remetilación del promotor rc-L1 está operativo predominantemente en la etapa posterior a la gastrulación. Los clones colorrectales que tienen su célula ancestral común más reciente en las 17–65 mutaciones embrionarias del tiempo molecular (generaciones celulares 12–90, asumiendo la tasa de mutación temprana fija mencionada anteriormente4,5; cerca de la gastrulación a la organogénesis) exhibieron una mayor concordancia de epigenotipos promotores para una fuente rc-L1 (tasa de concordancia del 77%, 1446 de 1885 pares clon-L1) que los clones que divergieron antes (Fig. 3b-d, f).

En tercer lugar, el rango de remetilación insuficiente se localiza en el promotor de rc-L1 y es independiente de otras regiones genómicas. Por ejemplo, a pesar de la diferencia extrema en el nivel de metilación del promotor de la fuente 22q12.1-2 predominantemente activa entre clones de fibroblastos y colorrectales, sus regiones aguas arriba y aguas abajo de 100 kb mostraron perfiles de metilación de ADN muy similares (Fig. 3g). Del mismo modo, los niveles de metilación del ADN de las regiones vecinas y de todo el genoma fueron en gran medida concordantes entre los clones colorrectales, independientemente del epigenotipo del promotor L1 (Fig. 3h y Datos extendidos, Fig. 8b, c).

Por último, la mayoría de las transcripciones de L1 son improductivas con respecto a los soL1R en células normales. Un clon colorrectal tiene 17–42 alelos rc-L1 con desmetilación del promotor (Fig. 3b), y sus secuencias transcriptómicas sugieren que un linaje epitelial colorrectal está continuamente expuesto a varios transcritos rc-L1 a lo largo de la vida (promedio de 0,6 fragmentos por kilobase de transcrito). por millón de lecturas mapeadas (FPKM) cuando se agregan todos los rc-L1, Datos extendidos Fig. 7)43. Sin embargo, un clon adquiere alrededor de tres soL1R a lo largo de su vida, lo que implica la presencia de un mecanismo de defensa activo que protege la retrotransposición de las transcripciones de L1 en las células normales.

Los sitios objetivo de soL1R se distribuyeron ampliamente en todo el genoma tanto en células normales como cancerosas (Datos extendidos, Fig. 9a). Los SoL1R en clones normales se insertaron con mayor frecuencia en regiones de motivos del sitio diana de la endonucleasa L1 (190 veces; intervalo de confianza (IC) del 95 % 78,8–459) y regiones de replicación tardía (5,89 veces; IC del 95 % 4,48–7,74) como observado previamente en cánceres17, aunque los estados de cromatina y los niveles transcripcionales mostraron un efecto relativamente pequeño (Datos extendidos Fig. 9b).

Observamos un nivel sustancial de agotamiento de soL1R en las regiones funcionales del genoma como se observa en la línea germinal L1s44. Entre los 1250 soL1R en clones normales, encontramos solo un evento que involucraba un exón de un gen codificador de proteínas, que mostró una frecuencia 29 veces menor que la expectativa aleatoria (P = 1.9 × 10−11, prueba exacta de Poisson bilateral). De manera similar, los soL1R se observaron con mayor frecuencia en regiones con escasez de genes (Datos extendidos, Fig. 9c). Los reordenamientos genómicos combinados con SoL1R, que representaron el 1 % de los soL1R en tejidos cancerosos17, no se observaron en clones normales. Nuestros datos demostraron además que los eventos soL1R no indujeron mutaciones adicionales, cambios de empalme o expresión génica o alteraciones de la metilación del ADN en regiones cercanas de los sitios de retrotransposición (Datos extendidos, Fig. 9d-f). Especulamos que los clones con soL1R funcionalmente dañinos fueron seleccionados negativamente en células normales.

Investigamos más a fondo las secuencias de puntos de ruptura en los sitios objetivo de soL1R para inferir los procesos mecánicos de las inserciones L1. Además de las dos características canónicas (TSD y cola poli-A), que se adquieren mediante transcripción inversa cebada por destino (proceso A; Fig. 4a, b), una fracción sustancial de soL1R mostró variaciones de secuencia en la parte de la cabeza 5 ' de los segmentos retrotranspuestos, caracterizados por (1) inversión corta en el cuerpo intrarretrotranspuesto (intraRT) (n = 354; 29,5 %), (2) inversión de retroceso corta (duplicación invertida) en los 5 'aguas arriba del sitio de destino (n = 3; 0,3%) o (3) ambos (n = 1; 0,1%). Estas variaciones de secuencia pueden explicarse por el mecanismo de cebado gemelo (proceso B; Fig. 4b) 45 y la síntesis de ADN adicional (alrededor de 52–220 pares de bases (pb)) potencialmente por ADN polimerasas en la resolución final de la mutagénesis por inserción mediada por L1 ( proceso C, Fig. 4b), respectivamente. Se observó un evento ocasional adicional en un clon establecido a partir de un adenoma, en el que parte del ARNm precursor, transcrito en la vecindad del sitio de inserción, se transcribió inversamente y se co-insertó en el genoma, lo que sugiere un cambio de cadena de la transcriptasa inversa (Extended Datos Fig. 9g). Estas características ilustran colectivamente que los soL1R no se adquieren mediante procesos completamente ordenados y lineales, sino que varios eventos opcionales pueden participar estocásticamente46.

a,b, diagramas esquemáticos de estructuras genómicas de inserciones L1 canónicas y complejas (a) y mecanismos subyacentes (b). cuerpo RT, cuerpo retrotranspuesto; DSB, rotura de doble cadena. c, Filogenia de clones adenomatosos asociados a MUTYH con tasas de L1 normalizadas en grupos de linajes clasificados por mutaciones impulsoras. Las longitudes de las ramas son proporcionales al tiempo molecular, medido por el número de mutaciones puntuales somáticas. Se muestran los números de soL1R específicos de rama y mutaciones de controlador específicas de rama.

Curiosamente, encontramos dos clones, cada uno de los cuales tenía transducciones en diferentes sitios objetivo genómicos pero con exactamente la misma longitud de secuencias únicas (Datos extendidos Fig. 9h). Dado que la cola poli-A es un evento aleatorio en la transcripción de lectura completa, nuestros hallazgos sugieren que son posibles múltiples eventos soL1R de una sola transcripción L1.

La carga de soL1R en los 19 carcinomas colorrectales emparejados mostró una variación considerable, entre cuatro y 105 (Fig. 1b). En promedio, la carga de soL1R fue de 30 por cáncer, aproximadamente diez veces más frecuente que la observada en los clones colorrectales normales. La tasa de soL1R en carcinomas colorrectales fue de 3,47 por 1000 EPM, que es alrededor de tres veces mayor que en el epitelio colorrectal normal (Datos ampliados, Fig. 10a). Cualitativamente, los soL1R en tumores dieron forma a cambios más profundos, incluida una longitud de inserción más larga (1031 frente a 453 pb para solo-L1, P = 8,6 × 10−20, prueba t bilateral; 755 frente a 615 pb para transducciones asociadas, P = 0,59 , prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral y 530 frente a 242 pb para transducciones huérfanas, P = 0,004, prueba t bilateral; datos extendidos Fig. 10b) y una mayor frecuencia de variaciones de la secuencia de la cabeza (41,8 frente a 29,9 %, P = 9,6 × 10−7, prueba exacta de Fisher de dos caras, datos ampliados Fig. 10c). Nuestros hallazgos sugieren una condición permisiva para la retrotransposición de L1 en el desarrollo de tumores, no necesariamente equivalente a la clásica inestabilidad del genoma en los cánceres. Por ejemplo, las mutaciones que inactivan TP53 y la inestabilidad cromosómica y de microsatélites no mostraron una correlación sólida con las cargas de soL1R en los cánceres colorrectales (Datos ampliados Fig. 10d,e). Aunque la inestabilidad cromosómica fue significativa en los pancánceres que abarcan más de 2600 casos de cáncer17 (Datos ampliados, Fig. 10f,g), la asociación fue débil e inconsistente en cada tipo histológico de tumor (Datos ampliados, Fig. 11).

Se observó aceleración de la tasa de soL1R durante el desarrollo del tumor en clones adenomatosos asociados con MUTYH. En el árbol de desarrollo de los pólipos adenomatosos, la tasa de soL1R aumentó a medida que los linajes se acercaban más al carcinoma con una acumulación de más mutaciones conductoras. Por ejemplo, la tasa de soL1R en linajes con tres mutaciones impulsoras (mutaciones de pérdida de función en APC y ARID1A y una mutación de ganancia de función en KRAS) fue de tres a cinco veces mayor que en linajes sin impulsores marcados (Fig. 4c).

Nuestros hallazgos demuestran que los elementos L1 endógenos celulares conducen a la retrotransposición en linajes somáticos normales y que las células epiteliales del colon adquieren 0,028 eventos soL1R por año. La movilización comienza desde la embriogénesis humana temprana, incluso antes de la gastrulación, como se observó previamente13,47. El repertorio de rc-L1 se hereda de los padres, y su activación epigenética se determina predominantemente en la etapa embrionaria posterior a la gastrulación, que luego se transmite de manera robusta en el linaje somático durante el envejecimiento (Fig. 5). Dada la cantidad de criptas en el colon (10 millones)48, las personas de 60 años tendrían colectivamente 20 millones de eventos de retrotransposición en el epitelio colorrectal. Una pequeña fracción de estas inserciones de L1 puede conferir cambios fenotípicos en células mutantes y contribuir a enfermedades humanas como el cáncer17.

Diagrama esquemático que ilustra los factores que influyen en el paisaje soL1R. La composición genética de rc-L1s se hereda de los padres. El panorama de metilación de los promotores rc-L1 está determinado predominantemente por la desmetilación global del ADN, seguida de procesos de remetilación en las etapas de desarrollo. Luego, cuando se desmetila el promotor de un rc-L1 en un linaje celular específico, la fuente expresa transcritos de L1, lo que hace posible la inducción de soL1R.

Se pueden utilizar varios métodos complementarios, que incluyen la secuenciación profunda6, la amplificación del genoma completo8, la secuenciación dúplex de ADN49, LCM5,10,11 y las expansiones de células individuales in vitro2,4,7,9, para explorar cambios genómicos adquiridos somáticamente en células normales. Aunque las expansiones clonales requieren mucha mano de obra y solo se aplican a las células en división, tienen ventajas fundamentales31 que incluyen (1) la implementación de detección de mutaciones sensible y precisa a nivel absoluto de una sola célula, (2) la facilitación de perfiles multiómicos adicionales en la misma clones, y (3) permitir la exploración de las primeras relaciones de desarrollo de los clones.

Aunque nuestros análisis insinúan algunos mecanismos, aún quedan muchas cosas por descubrir en la dinámica de la retrotransposición de L1 en células normales. Debido a su naturaleza repetitiva, las secuencias de elementos fuente y soL1R son en gran parte inaccesibles para lecturas cortas. La base mecánica de la especificidad del locus y del tipo de célula en la desmetilación del promotor diferencial es desconcertante. Se justifican panoramas más completos sobre un número más significativo de células individuales de diversos tipos de células, desde varios puntos temporales en el envejecimiento y la progresión de la enfermedad y mediante técnicas de secuenciación más innovadoras50, para responder a estas preguntas.

Para el establecimiento in vitro de organoides clonales a partir de tejidos colorrectales, se obtuvieron tejidos mucosos sanos de muestras quirúrgicas de 19 pacientes sometidos a cirugía electiva de extirpación de tumores (Tabla complementaria 1). Se cortaron tejidos normales (aproximadamente 1 × 1 × 1 cm3 de tamaño) de una región a más de 5 cm del tumor primario. También se recogieron tejidos de tumores colorrectales y de sangre coincidentes de los mismos pacientes para WGS de tejido a granel.

Se obtuvieron biopsias recientes de un paciente con poliposis adenomatosa familiar asociada a MUTYH mediante colonoscopia. Se cortaron tejidos (aproximadamente 0,5 × 0,5 × 0,5 cm3 de tamaño) de cuatro pólipos. También se recogieron sangre coincidente y tejido de la mucosa bucal del mismo paciente.

Todos los tejidos se transportaron al laboratorio para experimentos de cultivo de organoides dentro de las 8 h posteriores al procedimiento de recolección. Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación n.º 1911-106-1080) y KAIST (aprobación n.º KH2022-058), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes del estudio. Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y sus modificaciones posteriores. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos se realizaron sin aleatorización y los investigadores no estaban cegados durante los procedimientos experimentales y el análisis de datos.

Incluimos secuencias de genoma completo disponibles públicamente de clones expandidos de una sola célula para alcanzar una imagen más completa de la retrotransposición de L1 en varios tejidos humanos. Incluimos 474 secuencias de genoma completo de dos conjuntos de datos anteriores, uno para células hematopoyéticas (140 clones de un individuo)9 y otro para fibroblastos mesenquimales de nuestro trabajo anterior (334 clones de siete individuos)4. Además, incluimos 259 secuencias de genoma completo producidas a partir de parches basados ​​en LCM disecados de 13 órganos investigados en un estudio anterior5,11. Además, exploramos 578 secuencias de genoma completo generadas a partir de parches de tejidos colorrectales basados ​​en LCM51 para investigar las diferencias en la sensibilidad para la detección de soL1R entre LCM y los métodos de expansión clonal.

Para comprender el PAF de rc-L1, recopilamos 2852 secuencias de genoma completo disponibles públicamente de tejidos normales con información étnica conocida. Estos datos fueron recogidos de varios estudios52,53,54,55,56,57.

Para comprender el impacto del nivel de inestabilidad del genoma en la frecuencia de los soL1R en los tumores, exploramos más a fondo las llamadas variantes del Consorcio ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole-Genome (PCAWG), que incluía 2677 casos de cáncer y emparejamientos normales completos. secuencias del genoma en alrededor de 40 tipos de tumores17,53. Los SoL1R de muestras de PCAWG se pueden encontrar en un artículo anterior17. Otras llamadas de mutaciones somáticas (incluidas mutaciones que inactivan TP53, variaciones estructurales y firmas mutacionales) generadas por el consorcio están disponibles para descargar en https://dcc.icgc.org/releases/PCAWG. Nuestra matriz utilizada en el análisis está disponible en la Tabla complementaria 5, que incluye mutaciones impulsoras de 19 cánceres colorrectales coincidentes identificados mediante CancerVision (Genome Insight).

Todos los procedimientos de establecimiento de organoides y composiciones de medios se adoptaron de la literatura, con ligeras modificaciones58. Los tejidos de la mucosa se cortaron en secciones de aproximadamente 5 mm y se lavaron con PBS. Los tejidos se transfirieron a EDTA 10 mM (Invitrogen) en tubos cónicos de 50 ml, seguido de incubación con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, los tubos se agitaron suavemente para separar las criptas de los tejidos conectivos. Se recogió el sobrenadante y se observaron 20 μl de suspensión bajo un microscopio estereoscópico para comprobar la presencia de criptas. La suspensión de la cripta se centrifugó a una fuerza centrífuga relativa de 300 durante 3 min y el sedimento se lavó una vez con PBS para reducir el tiempo de isquemia. Las criptas aisladas se incluyeron en Matrigel reducido en factor de crecimiento (Corning) y se sembraron en una placa de 12 pocillos (TPP). El recubrimiento de las criptas se realizó a una dilución limitada mediante la modificación del protocolo de un estudio previo59. En resumen, se transfirieron aproximadamente 2000 criptas a 900 μl de Matrigel y se sembraron 3 × 150 μl de gotitas en tres pocillos de una placa de 12 pocillos. A continuación, se añadieron 450 μl de Matrigel a la dilución restante y se repitió el cultivo en placas de tres gotitas en tres pocillos. Se realizó una dilución en serie al menos cuatro veces y la dilución restante final se sembró en seis pocillos. Las placas se transfirieron a una incubadora a 37 °C durante 5 a 10 min para solidificar el Matrigel. Cada pocillo se cubrió con 1 ml de medio de cultivo organoide, cuyas composiciones se describen en la Tabla complementaria 6.

El cultivo primario de criptas a granel y diluidas se mantuvo durante al menos 10 días para garantizar la masa inicial de organoide de origen de cripta única. Después del crecimiento de los organoides, se seleccionó manualmente un solo ejemplo usando una pipeta de 200 μl bajo un microscopio invertido. El organoide seleccionado se colocó en un tubo Eppendorf y se disoció usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G bajo TrypLE Express (Gibco). A continuación, el bloqueo de TrypLE por ADF+++ (DMEM/F12 avanzado con HEPES 10 mM, GlutaMAX 1x y penicilina-estreptomicina al 1%) fue seguido de centrifugación y lavado. El sedimento se colocó en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Las placas se transfirieron a una incubadora humidificada a 37 °C/CO2 al 5 % y el medio se cambió cada 2 o 3 días. Después del paso exitoso, los organoides clonales se transfirieron a una placa de 12 pocillos y se expandieron aún más. Se recogieron clones confluentes para la extracción de ácidos nucleicos y stock de organoides.

Los organoides derivados de una sola cripta cultivados se recolectaron y disociaron utilizando TrypLE Express. Después del bloqueo de TrypLE y el lavado, los organoides se resuspendieron usando ADF+++. Las suspensiones de organoides se filtraron a través de un filtro de 40 μm (Falcon), luego las células individuales se clasificaron en un tubo FACS mediante un clasificador de células (FACSMelody, BD Biosciences). Se seleccionaron células individuales en función de las características de dispersión frontal y lateral de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células clasificadas se sembraron escasamente con Matrigel reducido en factor de crecimiento (500 por pocillo) en placas de 12 pocillos. Los organoides individuales recolonizados cultivados se seleccionaron y expandieron manualmente mediante los métodos descritos anteriormente.

Obtuvimos siete clones de fibroblastos para análisis de metilación. Los fibroblastos de la piel dérmica se cultivaron mediante un método descrito previamente4. En resumen, las muestras de piel se lavaron con PBS (Gibco) y se extrajeron el tejido adiposo y los vasos sanguíneos. Los tejidos restantes se cortaron en trozos pequeños (1–2 mm2) y se trataron con 1 mg ml–1 de solución de colagenasa/dispasa (Roche) a 37 °C durante 1 h. Después del tratamiento, la capa epidérmica se separó de la capa dérmica y esta última se lavó con medio DMEM que contenía FBS al 20% (Gibco) para inhibir la actividad colagenasa/dispasa. A continuación, el tejido dérmico se picó en trozos pequeños y se cultivó en placas de 24 pocillos recubiertas con colágeno I (Corning) con 200 µl de medio en una incubadora humidificada a 37 °C con una concentración de CO2 del 5 %.

Para la secuenciación de Illumina, extrajimos materiales de ADN genómico de células expandidas clonalmente, sangre periférica coincidente y tejidos tumorales colorrectales utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) o el kit Allprep DNA/RNA (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las bibliotecas de ADN se generaron con los kits de preparación de bibliotecas libres de PCR de ADN Truseq (Illumina) y se secuenciaron en la plataforma Illumina HiSeq X Ten o en la plataforma NovaSeq 6000. Los clones colorrectales se secuenciaron del genoma completo con una profundidad de cobertura media de 17 veces. Se secuenciaron tejidos de sangre periférica y tumor colorrectal emparejados con una cobertura media de 181 y 35 veces, respectivamente. Para la secuenciación de PacBio, extrajimos ADN genómico de organoides de colon utilizando el kit Circulomics Nanobind Tissue Big DNA (Circulomics) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las bibliotecas de ADN se prepararon utilizando el kit de preparación de plantillas MRTbell Express 2.0 (PacBio) y se secuenciaron en una plataforma PacBio Sequel IIe.

El ARN total se extrajo de células expandidas clonalmente utilizando el kit Allprep DNA/RNA (Qiagen). La biblioteca de secuenciación de ARN total se construyó con el kit Truseq Stranded Total RNA Gold (Illumina) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El ADN genómico se extrajo de células expandidas clonalmente usando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) o el kit Allprep DNA/RNA (Qiagen). Las bibliotecas se prepararon a partir de 200 ng de ADN de entrada con ADN de control (pUC19 metilado con CpG y ADN lambda no metilado con CpG) usando el kit NEBNext Enzymatic Methylation-seq (NEB) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuenciación de extremos emparejados se realizó utilizando la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina).

Las lecturas secuenciadas se asignaron al genoma de referencia humano (GRCh37) utilizando el alineador de Burrows-Wheeler (BWA)-MEM algoritmo60. Las lecturas duplicadas fueron eliminadas por Picard (disponible en http://broadinstitute.github.io/picard) o SAMBLASTER61. Identificamos SNV e indeles cortos como se informó anteriormente4. Brevemente, las sustituciones de bases y las indeles cortas se llamaron utilizando Haplotypecaller2 (ref. 62) y VarScan2 (ref. 63). Para establecer conjuntos de variantes de alta confianza, eliminamos las variantes con las siguientes características: (1) 1 % o más de VAF en el panel normal, (2) alta proporción de indeles o recorte (más del 70 %), (3) tres o más bases no coincidentes en las lecturas variantes y (4) existencia frecuente de lecturas erróneas en otros clones.

Identificamos variaciones estructurales somáticas de manera similar a nuestro informe anterior4. Llamamos a las variaciones estructurales usando DELLY64 con muestras de sangre coincidentes y clones filogenéticamente distantes para retener tanto las mutaciones somáticas como las embrionarias tempranas. Luego descartamos variantes con las siguientes características: (1) la presencia en el panel de normales, (2) número insuficiente de pares de lectura compatibles (menos de diez pares de lectura sin etiqueta SA compatible o menos de tres pares de lectura discordantes con una etiqueta compatible). etiqueta SA) y (3) muchas lecturas discordantes en muestras de sangre coincidentes. Para eliminar los eventos falsos positivos restantes y rescatar los eventos falsos negativos ubicados cerca de los puntos de interrupción, inspeccionamos visualmente todos los reordenamientos que pasaron el proceso de filtrado utilizando Integrative Genomics Viewer65.

Llamamos retrotransposiciones L1 usando MELT20, TraFiC-mem16, DELLY64 y xTea66 con muestras de sangre coincidentes y clones filogenéticamente distantes para retener tanto las mutaciones somáticas como las embrionarias tempranas. Se eliminaron las posibles llamadas de la línea germinal, que se superponían con eventos encontrados en muestras de sangre no coincidentes. Para confirmar la confiabilidad de las llamadas y eliminar los eventos falsos positivos restantes, inspeccionamos visualmente todos los candidatos soL1R centrándonos en dos pruebas de apoyo: (1) colas poli-A y (2) duplicaciones del sitio de destino utilizando Integrative Genomics Viewer65. Además, excluimos variantes con un bajo número de lecturas de apoyo (menos del 10 % del total de lecturas) para excluir posibles artefactos. Obtuvimos los extremos 5 'y 3' del segmento insertado para calcular el tamaño de soL1R y determinar si se combinó la inversión L1 o la transducción mediada por L1. Cuando ambos extremos del inserto se mapearon en hebras opuestas, se consideró que la variante estaba invertida. Cuando el segmento insertado se asignó a secuencias genómicas únicas y no repetitivas, donde un elemento L1 de longitud completa se encuentra dentro de una región ascendente de 15 kb, determinamos que la inserción L1 se combinó con la transducción 3 'y se derivó del elemento L1 en la región aguas arriba de secuencias únicas. Para calcular el VAF de soL1R, dividimos el número de pares de lectura compatibles con L1 por el número total de pares de lectura informativos alrededor de los sitios de inserción. Un par de lectura se consideró informativo si la región que cubría su inicio y final abarcaba el punto de interrupción de inserción. Además, contamos dos veces la cantidad de pares de lectura que respaldan la referencia al calcular la cantidad total de pares de lectura informativos, porque la inserción es compatible con pares de lectura en ambos extremos de la inserción. Para identificar las inserciones clonales de L1 en muestras de cáncer, establecimos un límite basado en el valor de fracción celular mínima de soL1R compartidos en clones colorrectales normales, porque los soL1R compartidos se consideran variantes verdaderas. Usamos el mismo enfoque para otras inserciones de elementos móviles, incluidos Alu y SVA.

Para extraer firmas mutacionales en nuestras muestras, utilizamos tres herramientas diferentes (secuencia de comandos interna, SigProfiler67 y procesos jerárquicos de dirichlet68) para lograr un conjunto de firmas mutacionales de consenso para cada tipo de muestra de colon, incluidas las células epiteliales normales, el adenoma y el carcinoma. En resumen, nuestro script interno se basa en la factorización de matriz no negativa con o sin varias restricciones matemáticas, y toma prestados métodos básicos del predecesor de SigProfiler69, como el uso de una medida de estabilidad y error de reconstrucción para la selección del modelo; sin embargo, proporciona una mayor flexibilidad para examinar un conjunto más amplio de posibles soluciones, incluidas aquellas que SigProfiler puede pasar por alto, y permite un enfoque deliberado para determinar la cantidad de supuestos procesos mutacionales. Como resultado, seleccionamos un subconjunto de firmas que mejor explican el espectro mutacional dado: SBS1, SBS5, SBS18, SBS40, SBS88, SBS89, ID1, ID2, ID5, ID9, ID18 e IDB para células epiteliales colorrectales normales; SBS1, SBS5, SBS18, SBS36, SBS40, ID1, ID2, ID5 e ID9 para adenoma asociado a MUTYH; y SBS1, SBS2, SBS5, SBS13, SBS15, SBS17a, SBS17b, SBS18, SBS21, SBS36, SBS40, SBS44, SBS88, ID1, ID2, ID5, ID9, ID12, ID14 e ID18 para cánceres colorrectales. Todas las firmas se atribuyen a firmas mutacionales conocidas disponibles en la versión 3.2 de la firma mutacional COSMIC (disponible en https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures) y IDB, que es una firma recientemente encontrada de investigaciones previas sobre células epiteliales colorrectales normales51 pero aún no catalogadas en la firma mutacional COSMIC.

Reconstruimos el árbol filogenético de las colonias y el clon principal de tejido canceroso de un individuo generando una matriz n × m que representa el genotipo de n mutaciones de m muestras, como se realizó anteriormente4. Brevemente, los SNV y los indeles cortos de todas las muestras de un individuo se fusionaron y solo se incluyeron variantes con cinco o más lecturas mapeadas en todas las muestras para evitar una genotipificación incorrecta por baja cobertura. Además, se eliminaron las variantes con VAF < 0,25 en todas las muestras para excluir posibles artefactos de secuenciación. Si el VAF de la i-ésima mutación en la j-ésima muestra era superior a 0,1, a Mij se le asignaba 1; de lo contrario, 0. Las mutaciones compartidas en todas las muestras se consideraron variantes de la línea germinal y se descartaron. Agrupamos todas las mutaciones según los tipos de muestras en las que se encontraron y establecimos la relación jerárquica entre los grupos de mutaciones. En resumen, si las muestras del grupo de mutación A contienen todas las muestras del grupo de mutación B además de otras muestras, el grupo de mutación B está subordinado al grupo de mutación A. Luego reconstruimos el árbol filogenético que mejor explica la jerarquía de los grupos de mutación. El árbol filogenético final es un árbol enraizado en el que cada muestra (colonia) está unida a un nodo terminal del árbol, siendo el número de mutaciones en el grupo de mutación correspondiente la longitud de la rama. Para las muestras de cáncer, la longitud de las ramas representa mutaciones puntuales clonales con fracciones de células cancerosas superiores a 0,7. Para convertir el tiempo molecular (número de mutaciones tempranas) en generaciones de células físicas, utilizamos una tasa de mutación de 2,4 a 3,8 pcpcd para las dos primeras divisiones celulares y luego de 0,7 a 1,2 pcpcd, que se estimó a partir de un trabajo anterior4,5.

Al calcular las tasas de soL1R, clasificamos las mutaciones puntuales en los árboles filogenéticos en cuatro etapas diferentes: pregastrulación, posgastrulación, envejecimiento (posdesarrollo) y tumorigénesis. Las mutaciones compartidas por múltiples clones y detectadas en secuencias de genoma completo de sangre a granel (origen mesodérmico) se consideraron pregastrulacionales. Las mutaciones en las ramas tempranas4,51,70 pero que no se encontraron en las secuencias del genoma completo de la sangre a granel se consideraron posgastrulacionales. Se consideró que todas las demás mutaciones en los clones normales se habían acumulado durante el proceso de envejecimiento. Para las mutaciones en el envejecimiento y la tumorigénesis, contamos las atribuibles a procesos mutacionales endógenos (SBS1 y SBS5/40 para SNV, ID1 e ID2 para indels), para excluir mutaciones adicionales por exposición a carcinógenos externos. Para las mutaciones en tumores, contamos las mutaciones puntuales clonales (fracciones de células cancerosas superiores a 0,7) para excluir las mutaciones subclonales. Finalmente, calculamos las tasas de soL1R en cada etapa dividiendo el número de soL1R por el número total de mutaciones puntuales endógenas. El cálculo de la tasa de soL1R para la tumorigénesis incluyó solo tumores no hipermutados.

Para calcular el PAF de las fuentes de rc-L1, recolectamos 2852 secuencias de genoma completo disponibles públicamente y ocho internas (un total de 2860) de tejidos normales con información étnica conocida (714 africanos, 588 europeos, 538 del sur de Asia, 646 del este de Asia y 374 americanos)52,53,54,55,56,57. Inicialmente, determinamos si los individuos tenían rc-L1 en su genoma. Brevemente, calculamos la proporción de lecturas compatibles con L1 para la no referencia L1 y la proporción de lecturas con un tamaño de inserción pequeño que se oponen a la eliminación de L1 para la referencia L1, respectivamente. Solo se consideró que existían en el genoma rc-L1 con una proporción del 15% o más. Luego calculamos el PAF de un rc-L1 específico como la proporción de individuos con L1 en la población.

Las lecturas secuenciadas se asignaron al genoma de referencia humano (GRCh37) utilizando pbmm2 (https://github.com/PacificBiosciences/pbmm2), un envoltorio para minimap2 (ref. 71). Las secuencias para lecturas compatibles con L1 cerca de los elementos fuente se extrajeron y asignaron a las secuencias de consenso L1HS18 usando BWA60. A continuación, identificamos las variaciones de secuencia de los elementos fuente, incluidas las mutaciones truncadas, y asignamos cada elemento fuente a las subfamilias L1 correspondientes21.

Las lecturas secuenciadas se procesaron utilizando Cutadapt72 para eliminar las secuencias del adaptador. Las lecturas recortadas se mapearon utilizando Bismark73 en el genoma que combina el genoma de referencia humano (GRCh37) modificado mediante la incorporación de secuencias de consenso L1 en los sitios de origen de L1 que no son de referencia, pUC19 y secuencias de ADN lambda. Para un solo sitio CpG, la cantidad de lecturas que respaldan la metilación (C o G), la cantidad de lecturas que respaldan la desmetilación (A o T) y la proporción de lecturas anteriores entre las lecturas totales (fracción de metilación) se calcularon utilizando Bismark. La eficacia de la conversión se estimó con lecturas mapeadas en pUC19 metilado con CpG y ADN lambda no metilado con CpG. Para observar el estado general de metilación, examinamos la fracción de metilación en regiones que van desde 600 pb aguas arriba hasta 600 pb aguas abajo desde el sitio de inicio de la transcripción L1 para cada elemento fuente L1. Luego nos enfocamos en los sitios CpG ubicados entre el sitio de inicio de la transcripción L1 y la región aguas abajo de 250 pb (+1 a +250) y clasificamos cada sitio CpG en una de tres categorías según la fracción de metilación: desmetilación homocigótica (fracción de metilación por debajo del 25%) , heterocigotos (fracción de metilación de al menos el 25 % y fracción de metilación inferior al 75 %) y metilación homocigotos (fracción de metilación de al menos el 75 %). A continuación, las puntuaciones de metilación se asignaron a los sitios CpG (0 para desmetilación homocigótica, 5 para heterocigótica y 10 para metilación homocigótica) y se resumieron promediando la puntuación de todos los sitios CpG en la región +1 a +250 del elemento L1. Finalmente, comparamos la puntuación de metilación en cada muestra y cada elemento fuente conocido para determinar la relación entre el estado de metilación y la activación de la fuente.

Para el análisis del nivel de metilación del promotor L1 en tejidos a granel, descargamos datos de secuenciación de bisulfito de genoma completo de 16 tejidos diferentes de Roadmap Epigenomics74. Los códigos de hoja de ruta son E050 BLD.MOB.CD34.PC.F (Mobilized_CD34_Primary_Cells_Female), E058 SKIN.PEN.FRSK.KER.03 (Penis_Foreskin_Keratinocyte_Primary_Cells_skin03), E066 LIV.ADLT (Adult_Liver), E071 BRN.HIPP.MID (Brain_Hippocampus _Medio), E079 GI.ESO (esófago), E094 GI.STMC.GAST (gástrico), E095 HRT.VENT.L (ventrículo izquierdo), E096 LNG (pulmón), E097 OVRY (ovario), E098 PANC (páncreas), E100 MUS.PSOAS (Psoas_Muscle), E104 HRT.ATR.R (Right_Atrium), E105 HRT.VNT.R (Right_Ventrile) E106 GI.CLN.SIG (Sigmoid_Colon), E109 GI.S.INT (Small_Intestine) y E112 THYM (Thymus). Las fracciones de metilación de los sitios CpG en las fuentes L1 referenciadas se recopilaron y resumieron promediando la fracción de todos los sitios CpG en la región +1 a +250 del elemento L1, luego se comparó el nivel de metilación del promotor L1 promedio en diferentes tejidos.

Las lecturas secuenciadas se procesaron utilizando Cutadapt72 para eliminar las secuencias del adaptador. Las lecturas recortadas se asignaron al genoma de referencia humano (GRCh37) utilizando el algoritmo BWA-MEM60. SAMBLASTER61 eliminó las lecturas duplicadas. Para identificar el nivel de expresión de cada elemento fuente L1, recopilamos lecturas asignadas en regiones de hasta 1 kb aguas abajo desde el extremo 3 'del elemento fuente y calculamos el valor FPKM. Solo se consideraron las lecturas en la misma dirección que el elemento fuente. Si el elemento fuente estaba ubicado en el gen y ambos estaban en la misma hebra, el valor de FPKM no se calculó porque el origen de las lecturas en la región descendente es ambiguo.

La tasa de inserción de L1 se calculó como el número total de soL1R por ventana deslizante de 10 Mb, con un incremento de 5 Mb. Para examinar la relación entre la tasa de inserción de L1 y otras características genómicas con una resolución de un solo nucleótido, utilizamos un enfoque estadístico descrito anteriormente17,75. En resumen, dividimos el genoma en cuatro contenedores (0–3) para cada una de las características genómicas, incluido el tiempo de replicación, la hipersensibilidad del ADN, la marca de histona (H3K9me3 y H3K36me3), la expresión del ARN y la cercanía al motivo de endonucleasa canónica L1 (definido aquí como TTTT|R (donde R es A o G) o Y|AAAA (donde Y es C o T)). Al comparar las secuencias de punto de ruptura con el motivo de la endonucleasa L1, asignamos regiones genómicas con más de cuatro (más diferentes), tres, dos y menos de uno (más similares) desajustes al motivo de la endonucleasa L1 en los contenedores 0, 1, 2 y 3 , respectivamente. La hipersensibilidad del ADN y los datos de marcas de histonas del Roadmap Epigenomics Consortium se resumieron promediando la señal de enriquecimiento en ocho tipos de células. Las regiones genómicas con una señal de enriquecimiento de veces inferior a 1 pertenecían al contenedor 0, y el resto se dividió en tres contenedores de igual tamaño: contenedor 1 (menos enriquecido), contenedor 2 (moderadamente enriquecido) y contenedor 3 (más enriquecido). Los datos de secuenciación de ARN también se obtuvieron de Roadmap y FPKM y se promediaron en ocho tipos de células. Las regiones sin expresión (FPKM = 0) pertenecen al contenedor 0 y el resto se dividió en tres contenedores de igual tamaño: contenedor 1 (menos expresado), contenedor 2 (moderadamente expresado) y contenedor 3 (más expresado). El tiempo de replicación se procesó promediando ocho tipos de células ENCODE, y las regiones genómicas se estratificaron en cuatro regiones de igual tamaño: el contenedor 0 contenía regiones con el tiempo de replicación más reciente y el contenedor 3 contenía regiones con el tiempo de replicación más temprano. Para cada característica, los puntajes de enriquecimiento se calcularon mediante la comparación de los intervalos 1 a 3 con el intervalo 0. Por lo tanto, el valor logarítmico del puntaje de enriquecimiento para el intervalo 0 debe ser igual a 0 y no se describe en las gráficas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos del genoma completo, la metilación del ADN y la secuenciación del transcriptoma están depositados en el Archivo Europeo del Genoma y el Fenómeno con el número de acceso. EGAS00001006213 y están disponibles para uso general de investigación. El genoma humano de referencia GRCh37 está disponible en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/GCF_000001405.13.

Los scripts internos para los análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/ju-lab/colon_LINE1).

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Agradecemos a S. Park, R. Kim, B.-K. Koo y GJ Faulkner por sus comentarios y debates. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el Gobierno de Corea (núms. NRF-2020R1A3B2078973 a YSJ y NRF-2021R1G1A1009606 a HWK); una subvención del MD-PhD/Programa de Capacitación de Científicos Médicos a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea, financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea; y por la Fundación Suh Kyungbae (no. SUHF-18010082 a YSJ).

Estos autores contribuyeron por igual: Chang Hyun Nam, Jeonghwan Youk

Escuela de Graduados en Ciencias Médicas e Ingeniería, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea, Daejeon, República de Corea

Chang Hyun Nam, Jeonghwan Youk, Joonoh Lim, Soo A Oh, Hyein Won, Yunah Lee, Jinju Han y Young Seok Ju

Genome Insight, Inc., Daejeon, República de Corea

Jeonghwan Youk, Jeong Yeon Kim, Joonoh Lim y Young Seok Ju

Departamento de Medicina Interna, Hospital Universitario Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Jeonghwan Youk y Hyun Jung Lee

Instituto Coreano de Información Científica y Tecnológica, Daejeon, República de Corea

Jung Woo Park y Junehawk Lee

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Ji Won Park, Seung-Yong Jeong y Min Jung Kim

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Seúl, Seúl, República de Corea

Dong Sung Lee

Departamento de Anatomía, Escuela de Medicina, Universidad Nacional Kyungpook, Daegu, República de Corea

Ji ganó oh

Departamento de Anatomía, Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei, Seúl, República de Corea

Ji ganó oh

Departamento de Medicina Nuclear, Facultad de Medicina de la Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Hyun Woo Kwon

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JY y YSJ concibieron el estudio. JY, HWK, JYK, HW e YL desarrollaron todo el protocolo de expansión clonal de células epiteliales colorrectales y realizaron experimentos. HJL, Ji.WP, S.-YJ y MJK recolectaron muestras colorrectales e historias clínicas de los pacientes. SAO llevó a cabo la secuenciación del genoma. CHN y JY realizaron la mayoría de los análisis genómicos y estadísticos, con contribuciones de J.Lim, HWK y YSJ Ju.WP y J.Lee contribuyeron a la gestión de datos genómicos a gran escala. D.-SL, JWO y JH participaron en la interpretación de datos. CHN, HWK y YSJ escribieron el manuscrito con contribuciones de todos los autores. YSJ supervisó el estudio general.

Correspondencia a Hyun Woo Kwon, Min Jung Kim o Young Seok Ju.

YSJ es cofundador y director ejecutivo de Genome Insight, Inc. Los autores restantes declaran no tener intereses en conflicto.

Nature agradece a Trevor Graham, José Tubio y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Un gráfico de dispersión que muestra la cobertura de secuenciación media de los clones y el VAF máximo de las mutaciones somáticas. La mayoría de los clones mostraron sus VAF máximos en torno a 0,5, lo que indica que se establecieron a partir de una única célula fundadora. b, Cambios en el número de copias a nivel cromosómico de los 887 clones normales. No se detectó aneuploidía significativa en todo el genoma, lo que respalda la estabilidad genómica durante la expansión clonal de células individuales normales. c, Un diagrama de Venn que muestra el número de soL1R detectados por cada herramienta bioinformática. d, Un gráfico esquemático que describe dos huellas genómicas de retrotransposición, la cola poli-A y la duplicación del sitio de destino. cuerpo RT, cuerpo retrotranspuesto; TSD, duplicación del sitio de destino. e, La distribución de las longitudes del sitio objetivo en los sitios de inserción. Las longitudes de sitio de destino positivas y negativas indican duplicación y eliminación del sitio de destino, respectivamente. soL1R, retrotransposición L1 somática. f, Número de variaciones estructurales en 406 clones de células epiteliales de colon normales. inversión TT, inversión de cola a cola; Inversión HH, inversión cabeza a cabeza.

a, Regresión lineal entre el número promedio de mutaciones puntuales endógenas en los clones colorrectales y la edad de muestreo en 19 individuos. La línea azul representa la línea de regresión (44,6 mutaciones puntuales por año) y las áreas sombreadas indican su intervalo de confianza del 95 %. La tasa es consistente con la tasa previamente estimada en el colon (43,6 mutaciones por año de Lee-Six et al., Ref. 51). b, c, Comparación del número promedio de soL1R por individuo en función del sexo (b) y la ubicación anatómica de las criptas colorrectales (c) en 19 individuos con clones colorrectales normales con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral. Los diagramas de caja ilustran los valores medianos con rangos intercuartílicos (IQR) con bigotes (1,5 x IQR). ns, no significativo. d–i, Relación entre el número de soL1R para cada clon colorrectal y el número de mutaciones puntuales somáticas (d), longitud de los telómeros (e), el número de SNV somáticos SBS1 (f, mutaciones en forma de reloj por desaminación de 5-metilcitosina ), el número de SNV somáticas SBS5+SBS40 (g, mutaciones similares a un reloj por un proceso desconocido), el número de SNV somáticas SBS18 (h, posiblemente daño por especies reactivas de oxígeno) y el número de SNV somáticas SBS88 (i, daño por colibactina de pks+ E. coli). No se encontró una asociación obvia. j, Número de parches basados ​​en LCM con varios números de soL1R en diferentes órganos. LCM, microdisección por captura láser.

Las primeras filogenias de los clones colorrectales y el tejido canceroso coincidente se muestran en siete individuos que han compartido soL1R entre clones. Las longitudes de las ramas son proporcionales al tiempo molecular medido por el número de mutaciones puntuales somáticas. Los números de mutaciones puntuales específicas de rama se muestran con números. Los círculos rellenos en los extremos de las ramas representan clones normales (círculos rellenos de negro) y clones cancerosos (círculos rellenos de rojo). Los números dentro de los círculos llenos muestran el número de soL1R detectados de los clones. Las áreas sombreadas indican linajes somáticos con soL1R compartidos. La ubicación genómica de las inserciones soL1R compartidas y la proporción de células sanguíneas que portan los soL1R se muestran mediante coordenadas genómicas y gráficos circulares. Las barras de colores en el lado derecho representan la proporción de firmas mutacionales atribuibles a las mutaciones puntuales somáticas. Los rombos naranjas muestran fuentes L1 (origen), que causaron eventos de transducción en los clones colorrectales.

Las primeras filogenias de los clones colorrectales y el tejido canceroso coincidente se muestran en 12 individuos que no tienen soL1R compartidos entre los clones. Las longitudes de las ramas son proporcionales al tiempo molecular medido por el número de mutaciones puntuales somáticas. Los números de mutaciones puntuales específicas de rama se muestran con números. Los círculos rellenos en los extremos de las ramas representan clones normales (círculos rellenos de negro) y clones cancerosos (círculos rellenos de rojo). Los números dentro de los círculos llenos muestran el número de soL1R detectados de los clones. El área sombreada indica linajes somáticos con inserción Alu compartida. La ubicación genómica de la inserción Alu compartida y la proporción de glóbulos que llevan la inserción Alu se muestran mediante coordenadas genómicas y un gráfico circular. Las barras de colores en el lado derecho representan la proporción de firmas mutacionales atribuibles a las mutaciones puntuales somáticas. Los rombos naranjas muestran fuentes L1 (origen), que causaron eventos de transducción en los clones colorrectales.

El tumor HC05 tiene un rc-L1 en 22q12.1 (centro) que no se encuentra en la línea germinal de HC05 (sangre; izquierda). El rc-L1 (22q12.1-1) provocó un evento de transducción en 5q31.1 (derecha) en el tumor, lo que sugiere una transducción secundaria del nuevo rc-L1 adquirido somáticamente. El orden de eventos propuesto se resume en el panel inferior izquierdo. SoL1R, retrotransposición L1 somática.

Se describe en cada individuo la relación entre el estado de metilación del ADN en la región promotora y el nivel de expresión de ARN de lectura completa de rc-L1, que tienen niveles variables de metilación y expresión. Solo incluye los casos en los que hay más de 10 clones con información de metilación y niveles de expresión de una rc-L1 específica en un individuo. Se describe el coeficiente de correlación y el valor P de la prueba de Pearson. La línea azul representa la línea de regresión y las áreas sombreadas indican su intervalo de confianza del 95%. FPKM, fragmentos por kilobase de transcrito por millón.

Se muestran el estado de metilación del ADN, los niveles de expresión de ARN de lectura completa y las filogenias del desarrollo de 48 rc-L1 en 132 clones colorrectales normales y 7 clones de fibroblastos de 9 pacientes. Incluye 27 rc-L1 que estaban activos en nuestra cohorte colorrectal y 21 rc-L1 que albergan promotores desmetilados en al menos cinco clones colorrectales. Las filogenias se muestran en el lado izquierdo con el número de mutaciones puntuales (tiempo molecular). PAF: frecuencia alélica poblacional; FPKM, fragmentos por kilobase de transcrito por millón; rc-L1, L1 competente en retrotransposición.

a, Nivel promedio de metilación del ADN del promotor L1 en diferentes tejidos de ENCODE. Entre los 30 rc-L1 descritos en la Fig. 3b, solo se seleccionaron 12 rc-L1 con suficientes lecturas en todos los tejidos. b, Perfiles de metilación de regiones aguas arriba y aguas abajo de 100 kb de 6 rc-L1 de referencia con niveles de metilación variables en clones colorrectales. La región para rc-L1 está resaltada con cuadros amarillos. Las coordenadas genómicas y el orden de los sitios CpG se representan en el panel superior. El panel central muestra la fracción de CpG metilada en clones colorrectales con promotores abiertos (naranja) y cerrados (azul). El panel inferior muestra las diferencias en la fracción de CpG metilado que se muestra en el panel central. mCpG, CpG metilado. c, Un diagrama de dispersión que muestra los niveles de metilación de todo el genoma de clones colorrectales normales en cada individuo.

a, Distribución en todo el genoma de los sitios diana de soL1R en clones colorrectales normales y 19 cánceres colorrectales compatibles. Las barras representan el número de inserciones L1 en una ventana deslizante de 10 Mb con un paso de 5 Mb. b, Asociación entre la tasa de inserción de L1 y varias características genómicas. Los puntos representan el valor logarítmico de las puntuaciones de enriquecimiento calculadas comparando los intervalos 1 a 3 con el intervalo 0 para cada función. motivo L1 EN, motivo diana de endonucleasa L1; DHS, sitio de hipersensibilidad a la ADNasa I. c, Distribución de distancias al gen más cercano desde los sitios de inserción L1 y desde sitios aleatorios. d–f, Distribución de distancias a las mutaciones puntuales más cercanas (d), nivel de expresión génica (e) y fracción de metilación de la región cercana (f) en clones colorrectales con y sin inserciones L1. TPM, transcripciones por millón. g, Un ejemplo de un soL1R co-insertado con un gen expresado en la vecindad del sitio de inserción. Un mecanismo sugerente se muestra en el panel inferior. SoL1R, retrotransposición L1 somática; TSD, duplicación del sitio de destino; Cuerpo RT, cuerpo retrotranspuesto. h, Un ejemplo de un clon con dos eventos de transducción en diferentes sitios genómicos objetivo pero con la misma longitud de las secuencias únicas. Un mecanismo sugerente se muestra en el panel inferior.

a, La tasa de soL1R se acelera durante la tumorigénesis en linajes colorrectales. EPM, mutación puntual endógena. b, Distribución del tamaño de inserción de L1 en 406 clones colorrectales normales y 19 cánceres colorrectales compatibles. c, Proporción de eventos soL1Rs con variaciones en la cabeza en 406 clones colorrectales normales y 19 cánceres colorrectales compatibles. d–g, el número de soL1R entre cánceres colorrectales con o sin mutaciones inactivadoras de TP53 (izquierda), inestabilidad de microsatélites (centro) e inestabilidad genómica (inestabilidad cromosómica; derecha). Los números de muestra se muestran entre paréntesis. Se mostraron los valores de p de la prueba t bilateral (izquierda, centro) y la regresión lineal (derecha). Los diagramas de caja ilustran los valores medianos con rangos intercuartílicos (IQR) con bigotes (1,5 x IQR). Las líneas azules representan las líneas de regresión y las áreas sombreadas indican sus intervalos de confianza del 95%. Los valores de p de la regresión multivariante bilateral se representaron en el espacio correcto. ns, no significativo. d. En 19 tejidos de cáncer colorrectal coincidentes. mi. En 19 tejidos de cáncer colorrectal compatibles y 52 tejidos de cáncer colorrectal PCAWG. F. En 19 tejidos de cáncer colorecal coincidentes y 4 tipos de cáncer (adenocarcinomas colorrectales, adenocarcinomas esofágicos, carcinomas de células escamosas de pulmón y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello) que muestran una mayor carga de soL1R entre 40 tipos histológicos en PCAWG. gramo. En 19 tejidos de cáncer colorrectal coincidentes con todas las muestras PCAWG de la lista blanca.

La relación entre la carga de soL1R y la inestabilidad del genoma clásico, como las mutaciones que inactivan TP53 y la inestabilidad cromosómica, se analizó en muestras de la lista blanca de PCAWG (n = 2677) y 19 cánceres colorrectales coincidentes en este estudio. No se consideraron los tipos de cáncer con menos de 10 casos. a, mutaciones somáticas que inactivan TP53 y el número de eventos soL1R. Los diagramas de caja ilustran los valores medianos con rangos intercuartílicos (IQR) con bigotes (1,5 x IQR). El número de casos en cada tipo de histología se mostró entre paréntesis. Se mostraron los valores de p de la prueba t de dos caras. NA, no disponible. b, Regresión lineal entre la inestabilidad cromosómica (reordenamientos genómicos) y el número de eventos soL1R en cada tipo de cáncer. Las líneas azules representan las líneas de regresión y las áreas sombreadas indican sus intervalos de confianza del 95%. Los valores R-cuadrado y P de la regresión lineal se representaron en cada panel.

Este archivo contiene el debate complementario 1 (eventos de retrotransposición de L1 asociados al cultivo potencial en los clones), el debate complementario 2 (técnicas genómicas para la detección sensible de soL1R), el debate complementario 3 (panorama de la metilación del promotor y la expresión de lectura completa de rc-L1), el debate complementario Referencias, figuras complementarias. 1–5 y leyendas para las tablas complementarias 1–6.

Características demográficas y mutacionales de las muestras. La tabla presenta información sobre cada muestra del estudio, incluida la edad y el sexo de los pacientes, la ubicación anatómica donde se obtuvieron las muestras y la carga mutacional y las firmas de cada muestra.

Anotación de retrotransposiciones somáticas identificadas en este estudio. La tabla presenta información detallada sobre cada evento de retrotransposición somática identificado en el estudio, incluidas las coordenadas genómicas, la orientación de la hebra, el tamaño y el tipo de inserción y el número de lecturas de apoyo para cada inserción.

Anotación de retrotransposiciones somáticas identificadas en parches basados ​​en LCM. La tabla presenta información detallada sobre cada evento de retrotransposición somática identificado en parches basados ​​en LCM, incluidas las coordenadas genómicas, la orientación de la hebra, el tamaño y el tipo de inserción y la cantidad de lecturas de apoyo para cada inserción.

Lista de elementos fuente con características. La tabla contiene información sobre 276 rc-L1 analizados en el estudio, incluidas las coordenadas genómicas, la citobanda, la orientación de la hebra, la frecuencia del alelo de la población, la información de la subfamilia L1 y una lista de mutaciones truncadas. Además, la tabla muestra el número de eventos de transducción de cada rc-L1 en cada muestra colorrectal examinada en el estudio.

Asociación de soL1R y características de inestabilidad del genoma en el cáncer. La tabla presenta información sobre las muestras de cáncer colorrectal analizadas en el estudio y los cánceres incluidos en la lista blanca del PCAWG, incluida la información histológica, el número de retrotransposición L1 somática y variaciones estructurales, si las muestras albergan mutaciones que inactivan TP53 o inestabilidad de microsatélites y una lista de mutaciones conductoras canónicas.

Composición de medios de cultivo organoide para células epiteliales colorrectales. La tabla presenta la composición del medio de cultivo organoide para células epiteliales colorrectales.

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Reimpresiones y permisos

Nam, CH, Youk, J., Kim, JY et al. Retrotransposición somática generalizada de L1 en el epitelio colorrectal normal. Naturaleza 617, 540–547 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06046-z

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Recibido: 18 mayo 2022

Aceptado: 04 abril 2023

Publicado: 10 mayo 2023

Fecha de emisión: 18 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06046-z

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