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Oct 21, 2023

Infección por Escherichia coli uropatógena

microbiología de la naturaleza volumen 8,

Nature Microbiology volumen 8, páginas 875–888 (2023)Citar este artículo

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Las infecciones previas del tracto urinario (ITU) pueden predisponer a infecciones futuras; sin embargo, los mecanismos subyacentes que afectan la recurrencia son poco conocidos. Anteriormente descubrimos que las infecciones urinarias en ratones causan una remodelación diferencial del epitelio de la vejiga (urotelial), según el resultado de la enfermedad, que afecta la susceptibilidad a las infecciones urinarias recurrentes. Aquí comparamos líneas de células madre uroteliales (USC) aisladas de ratones con antecedentes de infección por Escherichia coli uropatógena crónica (UPEC) resuelta o crónica, aclarando la evidencia de la impronta molecular que involucró cambios epigenéticos, incluidas las diferencias en la accesibilidad de la cromatina, la metilación del ADN y la modificación de histonas. . Las marcas epigenéticas en USC de ratones crónicamente infectados mejoraron la muerte celular mediada por caspasa-1 tras la infección por UPEC, promoviendo la eliminación bacteriana. También se produjo un aumento de la expresión de Ptgs2os2, lo que podría contribuir a la expresión sostenida de la ciclooxigenasa-2, la inflamación de la vejiga y las heridas en la mucosa, respuestas asociadas con la cistitis recurrente grave. Por lo tanto, la infección por UPEC actúa como un epimutágeno que reprograma el epigenoma urotelial, lo que conduce a la remodelación intrínseca del urotelio y al entrenamiento de la respuesta innata a la infección posterior.

Las infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones bacterianas más comunes en todo el mundo y son una causa importante de morbilidad en mujeres sanas1,2. La alta tasa de recurrencia en individuos susceptibles hace que el tratamiento sea un desafío3, siendo uno de los factores de riesgo más fuertes para desarrollar una ITU una ITU previa2. La base biológica de la UTI recurrente (rUTI) es poco conocida.

Sin tratamiento con antibióticos, las infecciones urinarias agudas en humanos se resuelven solas o se convierten en infecciones crónicas de larga duración4. La infección de ratones C3H/HeN con Escherichia coli uropatógena (UPEC) recapitula estos dos resultados. La cistitis crónica en estos ratones se define como bacteriuria persistente de alto título (bacterias en la orina) acompañada de inflamación crónica (ratones sensibilizados), mientras que la resolución de la infección define a los ratones resueltos5. El análisis de vejigas de ratones resueltos y sensibilizados revela que la infección conduce a una remodelación diferencial de la vejiga que afecta la susceptibilidad a la rUTI. Los ratones resueltos son resistentes a la rUTI, en parte porque tienen una respuesta acelerada y transitoria de TNFα/ciclooxigenasa-2 (Cox-2) de la vejiga, que promueve la eliminación rápida de la infección y la cicatrización de la mucosa6,7,8. Los ratones sensibilizados son muy susceptibles a las rUTI tras el desafío, con una fuerte expresión sostenida de TNFα y Cox-2 en la vejiga que causa la transmigración de neutrófilos a través del epitelio de la vejiga (urotelio) y heridas en la mucosa que promueven infecciones bacterianas recurrentes graves6,7,8. Por lo tanto, dependiendo de la historia de la enfermedad, el tejido de la vejiga se remodela de manera diferencial de una manera que aumenta o disminuye la susceptibilidad a la rUTI.

Estos fenotipos llevaron a nuestra hipótesis de que la remodelación de la mucosa de la vejiga está mediada en parte por cambios epigenéticos en las células madre uroteliales (USC) que afectan la defensa de la mucosa de la vejiga contra infecciones posteriores6,7. Por lo tanto, aislamos células epiteliales de las vejigas de ratones con diferentes antecedentes de enfermedades, establecimos líneas primarias de USC, las propagamos en cultivo celular y formamos urotelio polarizado y completamente diferenciado in vitro, que mostró fenotipos morfológicos que se asemejaban a los fenotipos de remodelación urotelial observados in vivo6 . Identificamos diferencias en la accesibilidad de la cromatina, la metilación del ADN y las modificaciones de histonas en las líneas USC, que se correspondían con diferencias en las respuestas transcripcionales que afectan la muerte celular programada y las respuestas inflamatorias reguladas por la ciclooxigenasa-2 (Cox-2) que afectan la susceptibilidad a la rUTI. En general, nuestro estudio proporciona evidencia epigenética de inmunidad entrenada epitelial-intrínseca causada por una infección bacteriana de la mucosa, que altera la respuesta de la mucosa de la vejiga a infecciones posteriores, según el resultado original de la enfermedad. Este hallazgo puede explicar la alta prevalencia de rUTI y tener importantes implicaciones terapéuticas para las infecciones bacterianas crónicas/recurrentes en general.

Para estudiar los cambios intrínsecos del urotelio que resultan de una infección previa, adaptamos un método para la propagación in vitro de células madre epiteliales intestinales primarias en cultivo tridimensional (3D)9,10 para cultivar USC primarias que se aislaron de células madre ingenuas de 8 semanas de edad. Ratones C3H/HeN (Fig. 1a y datos extendidos Fig. 1a). La expresión génica de p63, que codifica la proteína 63 relacionada con la transformación (p63), se midió porque es esencial para la capacidad proliferativa de las células madre11, mientras que la expresión de Axin2, que es un gen diana de Wnt10, se midió para evaluar Wnt actividad de señalización en la cultura 3D. Juntos, podemos evaluar el estado de pluripotencia de las células madre al monitorear la expresión de estos genes con RT-qPCR (Datos extendidos Fig. 1b, c). La expresión de los genes p63 y Axin2 se mantuvo alta durante los primeros 3 días de cultivo 3D en un 50 % de medios acondicionados (CM), que es necesario para mantener la pluripotencia. La expresión de p63 y Axin2 luego disminuyó a los 5 a 7 días posteriores a la infección, independientemente de si las células se incubaron en CM al 50 % o al 5 % en el día 3 posterior a la infección, lo que demuestra que el cultivo extendido o el porcentaje de CM más bajo pueden reducir la señalización de Wnt . Sin embargo, la uroplaquina 3a (Upk3a), una proteína de superficie expresada por células uroteliales diferenciadas, solo aumentó significativamente en células cultivadas en CM al 5 % pero no en CM al 50 %, según se determinó a los 7 días posteriores a la infección (Datos ampliados, Fig. 1d) . Después de la propagación de las USC en CM al 50 % durante varios pases y cultivo adicional en CM al 50 % durante 5 días, todas las células se tiñeron de forma positiva para el marcador de células epiteliales E-cadherina y el marcador de células uroteliales basales queratina 5 (K5), pero carecían de expresión de Upk3a ( Datos ampliados Fig. 1e). Por el contrario, el cultivo en 0% CM en cultivo 3D durante 5 días después de la propagación inicial dio como resultado el desarrollo de polaridad epitelial con la formación de una cavidad central (Datos extendidos Fig. 1e). Dentro de los quistes resultantes, las células que miran hacia la cavidad se diferenciaron en células similares a facetas superficiales (Upk3a+, K5-), mientras que las células del perímetro en contacto con la matriz de matrigel eran similares a células basales (Upk3a-, K5+).

a, las USC aisladas de ratones C3H/HeN de 8 semanas de edad se expandieron mediante cultivo esferoidal en matrigel con medio condicionado (CM) con 50 % de L-WRN, incluido Y-27632, un inhibidor de ROCK, y SB431542, un inhibidor de TGF β tipo 1 . Después de 3 días de cultivo de esferoides, las células se disociaron en una suspensión de una sola célula y se sembraron de 3 a 4 × 105 células en membranas Transwell. Las células se cultivaron en CM al 50% durante 3 a 5 días, luego se cultivaron en CM al 5% durante 2 a 3 semanas hasta la diferenciación completa. b, Luego se analizaron cultivos celulares con un valor TER >4000 ohm × cm2 (5 transpocillos cultivados a partir de una línea celular juvenil C3H/HeN). Por consistencia, TER se midió 1 día después del cambio de medio. c, d, los urotelios diferenciados en los transwells se fijaron y se tomaron imágenes mediante (c) microscopía confocal y (d) SEM para mostrar una vista de arriba hacia abajo del urotelio con un aumento de 500x (panel superior) y 10,000x (panel inferior). En c, las muestras se tiñeron para F-actina, el marcador de diferenciación terminal K20 y núcleos (DAPI). e–h, Los urotelios también se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) (e) y se inmunotiñeron para K20, Ecad y DAPI (f), Upk3a, p63 y DAPI (g) o K5, K14 y DAPI (h). Se muestran imágenes representativas. Los datos provienen de 2 o 3 experimentos independientes que utilizan USC de 5 ratones juveniles C3H/HeN diferentes.

Datos fuente

A continuación, establecimos un sistema de cultivo transwell para diferenciar las USC de ratones juveniles C3H / HeN en barreras uroteliales polarizadas y estratificadas (Fig. 1a). La línea celular de carcinoma de vejiga humana 5637 (ATCC HTB-9), que se ha utilizado ampliamente para el estudio in vitro de las interacciones UPEC con las células de la vejiga y se origina a partir de células basales de cáncer de vejiga12, se utilizó como control. Como tanto las células 5637 como nuestras USC primarias son de origen celular basal, las sembramos y cultivamos en transwells durante 2 a 3 semanas para comparar los fenotipos de diferenciación celular. La formación de urotelio diferenciado intacto, denominado en el presente documento urotelio diferenciado (o urotelio), por parte de las USC primarias se confirmó mediante una resistencia eléctrica transepitelial robusta (TER) (Fig. 1b), tinción confocal fuerte de células facetadas superficiales hexagonales grandes para la diferenciación terminal marcador K20 (Fig. 1c), y la presencia de uniones celulares y placas de uroplaquina en la superficie del tejido (Fig. 1d), similar a cómo aparecen las células facetarias superficiales en la superficie de los tejidos vesicales intactos6. El análisis microscópico de secciones uroteliales diferenciadas reveló una capa de tejido epitelial polarizado multicapa (Ecad+) (Fig. 1e-h), con expresión de p63, K5 y K14 en las células de la capa basal por encima de la membrana de matrigel (principalmente K5+/K14+, algunas K5+/ K14−), p63 y expresión débil de Upk3a en algunas células de la capa intermedia, indicativo de células intermedias, y tinción fuerte de K20 y Upk3a en la superficie de las células de la capa apical, lo que indica células facetarias superficiales diferenciadas terminalmente. En conjunto, la distribución de estas características de diferenciación en las capas uroteliales basales, intermedias y superficiales es consistente con la observada en el tejido vesical humano y de ratón13. Por el contrario, ninguna de estas características se observó en cultivos transwell de células 5637, en los que las células estaban empaquetadas de forma suelta en capas de 4 a 6 células de profundidad, pero carecían de evidencia de polarización o formación de uniones celulares (Datos extendidos Fig. 2a-d). Por lo tanto, las USC primarias brindan ventajas importantes sobre una línea de células tumorales para estudiar el urotelio.

Usando nuestro modelo murino de rUTI5,6, hemos demostrado que un evento de ITU inicial da como resultado una remodelación de la vejiga de larga duración, incluidos cambios estructurales y proteómicos en el urotelio, que afectan la susceptibilidad a rUTI14. Para investigar el papel de las USC en la remodelación de la vejiga, aislamos USC de vejiga de ratones convalecientes (4 semanas después del inicio de los antibióticos), tanto de aquellos con infección autorresuelta (resuelta) como de aquellos que desarrollaron infección crónica (sensibilizados), así como a partir de ratones ingenuos de la misma edad como controles y líneas USC establecidas (n = 4 por historial de infección) (Fig. 2a, b). Propagamos cada una de estas líneas de USC entre 15 y 30 pases, luego las diferenciamos en transwells y caracterizamos cada línea celular por microscopía después de 2 a 3 semanas de cultivo. Sorprendentemente, descubrimos que el urotelio derivado de USC sensibilizadas recapituló muchas de las diferencias morfológicas observadas previamente in vivo6 incluso después de muchos pases, incluidas células de superficie más pequeñas y una expresión disminuida de los marcadores de diferenciación terminal Upk3a y K20 en comparación con urotelio diferenciado derivado de ingenuo y USC resueltos (Fig. 2c-e). La medición automatizada del tamaño de las células de la superficie mostró que las células apicales del urotelio diferenciado sensibilizado son significativamente más pequeñas que las del urotelio diferenciado ingenuo, mientras que el urotelio resuelto tiene un fenotipo intermedio, de acuerdo con los datos in vivo (Fig. 2f-g)6. En conjunto, estos datos indican que el cultivo transwell de USC puede recapitular los fenotipos morfológicos de remodelación epitelial de la vejiga observados in vivo.

a, Evolución temporal de la infección inicial con 108 ufc UTI89 KanR y período de convalecencia en ratones C3H/HeN. b, curso temporal representativo del título bacteriano en orina durante 4 wpi. La línea horizontal representa el límite para bacteriuria notable: 104 ufc ml−1. Los ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados se denominaron N1-4, R1-4 y S1-4. c, d, las USC aisladas de estos ratones se cultivaron en urotelios diferenciados en transwells, se fijaron y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal (c) y SEM (d). En c, los urotelios se tiñeron para K20, F-actina (faloidina) y núcleos (DAPI). e, Transwells se incluyeron en parafina, se seccionaron y se inmunoteñeron para Upk3a, E-cadherina y núcleos. Las flechas blancas muestran uniones de celdas que indican el tamaño de las celdas de la superficie. f, g, Los portaobjetos fijos procesados ​​a partir de 44 transpocillos de ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados (n = 16, 12 y 16 transpocillos de n = 4, 3, 4 ratones, respectivamente) se tiñeron para K20, E-cadherina y núcleos, etiquetados e imagen de una manera doble ciego. Luego, los tamaños de celdas superficiales se midieron automáticamente usando el programa de macros Fiji ImageJ y se trazaron para el tamaño de celda promedio por transwell (f) y el tamaño de celda individual (g), representado como una mediana con un IC del 95 %. Se usó la prueba t de Student de dos colas para determinar la significación y los valores de P se indican cuando son significativos.

Datos fuente

Nuestros datos indican que una infección anterior da como resultado cambios intrínsecos de USC que son hereditarios durante muchas generaciones de cultivo celular. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que estos cambios están mediados por modificaciones epigenéticas diferenciales en los USC que se asocian con: (1) antecedentes de enfermedad y (2) diferencias en la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. La accesibilidad a la cromatina se midió mediante Omni-ATAC-seq, una técnica para secuenciar regiones de cromatina nuclear que son accesibles a una transposasa mediante secuenciación15. Identificamos un total de 59 801, 63 195 y 82 030 regiones de cromatina accesibles altamente reproducibles en dos réplicas biológicas de cada una de las líneas USC ingenuas, resueltas y sensibilizadas, respectivamente. El análisis de componentes principales (PCA) de estas líneas de USC separa las USC sensibilizadas de otros grupos (Fig. 3a). Entre las 2880 regiones accesibles diferencialmente (DAR) de cromatina identificadas entre USC sensibilizadas y resueltas, 925 regiones son DAR sensibilizadas accesibles (más accesibles en sensibilizadas que resueltas) y 1955 regiones son DAR resueltas accesibles (más accesibles en resueltas que sensibilizadas) (Figura 3b).

Omni-ATAC-seq se realizó utilizando USC de ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados (líneas celulares N1, N3, R1, R4, S1 y S2, cada una de un ratón individual). a, gráfico PCA de DAR a lo largo de las líneas de USC. b, Mapa de calor de picos significativamente diferenciales (FDR < 0,05) que comparan USC sensibilizados frente a resueltos. De los 2880 DAR, 925 regiones son DAR accesibles sensibilizados y 1955 regiones son DAR accesibles resueltos. c, Los 15 principales términos GO enriquecidos para DAR sensibilizados accesibles (n = 747, cambio de pliegue > 1,5, FDR < 0,05) se analizaron utilizando GREAT. La significación se determinó mediante la prueba binomial. d,e, las diferencias en la accesibilidad de la cromatina, la metilación del ADN y las modificaciones de histonas activas, H3K27Ac y H3K4Me3, en diferentes USC se evaluaron mediante ATAC-seq, secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) y CUT&RUN. d, las DMR específicas sensibilizadas (n = 189) entre las USC ingenuas, resueltas y sensibilizadas se visualizan como una serie de mapas de calor que muestran el paisaje epigenético que se superpone a cada DMR para la metilación del ADN, ATAC y modificaciones activas de histonas H3K27Ac y H3K4Me3. e, Se visualizan señales promedio 5 kb aguas arriba y 5 kb aguas abajo de hipo-DMR sensibilizados específicos (n = 183) para WGBS, ATAC, H3K27Ac y H3K4Me3 para cada línea celular. La longitud promedio de los DMR es de 362 pares de bases. Los DMR se escalan según el tamaño con 'inicio' y 'final' de DMR, que se indican como barras grises. f, los hipo-DMR específicos sensibilizados se anotaron de acuerdo con sus ubicaciones predichas en el genoma (n = 183). g, un gráfico PCA de todas las comparaciones de DMR que muestra la agrupación de las diferentes líneas celulares. h, Los 15 principales términos GO enriquecidos para hipo-DMR sensibilizados se analizaron usando GREAT (n = 183).

Datos fuente

El análisis de la vía Gene Ontology (GO) en los DAR utilizando GREAT16 reveló que los genes asociados con los DAR sensibilizados y accesibles están fuertemente enriquecidos para muchos procesos biológicos, incluidos los que involucran la muerte celular programada (PCD), el estrés oxidativo y la respuesta inmune (Fig. 3c). Muchos de estos DAR estaban cerca de los genes asociados a la ruta de PCD, incluidos Casp1 y Gsdmc2/3 (Tabla complementaria 1), que previamente se encontró que estaban enriquecidos tanto en el RNA-seq de la vejiga completa como en las comparaciones proteómicas uroteliales ex vivo de sensibilizados frente a resueltos. ratones6,8. Al realizar un análisis de descubrimiento de motivos con HOMER17, encontramos que los DAR accesibles resueltos están altamente enriquecidos para los motivos de unión del factor de transcripción (TF) de los miembros de la familia AP-1, que son mediadores conocidos de las respuestas al estrés, a menudo aguas abajo de la señalización de citocinas (Datos extendidos Fig. 3a). Por el contrario, los DAR accesibles sensibilizados están enriquecidos no solo por motivos de unión a TF de la familia AP-1, sino también por aquellos que regulan el destino de las células madre y la diferenciación y el desarrollo de tejidos, incluidos los miembros de la familia SOX EHF, Klf5 y RUNX2 (Fig. 3b).

La remodelación de la cromatina se logra a través de dos mecanismos principales: la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas. Realizamos perfiles de todo el genoma de la metilación del ADN y la modificación de histonas en nuestras líneas USC utilizando WGBS18 y CUT&RUN19, respectivamente. Para CUT&RUN, seleccionamos anticuerpos contra marcas de modificación de histonas: trimetilación de lisina 4 H3 (H3K4Me3), acetilación de lisina 27 H3 (H3K27Ac) y trimetilación de lisina 27 H3 (H3K27Me3), que se asocian con promotores activos, promotor/potenciador activo y represión polycomb, respectivamente20. La mayoría de las regiones diferencialmente metiladas (DMR) se identificaron en las comparaciones de USC sensibilizadas con (1) USC ingenuas o (2) resueltas. No observamos ninguna diferencia global en la metilación del ADN entre los grupos ingenuos, resueltos y sensibilizados (Datos extendidos Fig. 4a, b). Las DMR específicas sensibilizadas se muestran como un mapa de calor junto con los picos de ATAC-seq y CUT&RUN para visualizar el panorama epigenético a través de estas DMR (Fig. 3d). Descubrimos que los DMR específicos sensibilizados tienden a estar hipometilados (hipo-DMR) en comparación con los USC ingenuos y resueltos (Fig. 3d). La metilación del ADN puede reducir la expresión génica al inhibir la unión del factor de transcripción y afectar potencialmente la ocupación del nucleosoma, lo que da como resultado una cromatina menos accesible21. En concordancia, encontramos que los hipo-DMR en USC sensibilizados tienen señales ATAC-seq, H3K4Me3 y H3K27Ac aumentadas correspondientes (Fig. 3d), lo que sugiere que estas regiones están enriquecidas en marcas para promotores y potenciadores activos. Al observar las señales promedio en las regiones genómicas (+/- 5 kb) que rodean las hipo-DMR específicas sensibilizadas, observamos patrones similares de hipometilación, mayor accesibilidad a la cromatina y mayores marcas de histonas activas en comparación con las USC ingenuas y resueltas (Fig. 3e). Sin embargo, la modificación represiva de histonas, H3K27Me3, no se correlacionó con las DMR específicas sensibilizadas (datos extendidos, Fig. 5a, b). Los hipo-DMR específicos sensibilizados están más asociados con características génicas como promotores, exones e intrones (Fig. 3f). Un gráfico PCA de todos los DMR separó las USC sensibilizadas de las USC ingenuas y resueltas (Fig. 3g). El análisis de la vía GO de hipo-DMR específicos sensibilizados mostró un enriquecimiento en la respuesta inmune y las vías relacionadas con la adhesión celular (Fig. 3h). Por lo tanto, las USC mantienen memorias epigenéticas de una infección previa por UPEC que difieren según el resultado de la infección inicial y están mediadas por la metilación diferencial del ADN y las modificaciones activas de las histonas.

Luego realizamos RNA-seq de USC ingenuos, resueltos y sensibilizados para investigar si sus epigenomas alterados dan como resultado una expresión génica diferencial. Incluimos USC ingenuos juveniles (Fig. 1) como comparadores para las diferencias de edad. Nuevamente, el PCA de todos los DEG separa los USC sensibilizados de otros grupos a lo largo del componente principal (PC) 1 (Fig. 4a). Los USC sensibilizados tenían 108 y 73 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en comparación con los USC ingenuos y resueltos, respectivamente (Datos extendidos Fig. 6a, b), de los cuales 40 genes eran comunes a ambas comparaciones (Fig. 4b). Los 15 DEG principales incluyeron los genes de glutatión transferasa Mgst1 y Mgst3 (Fig. 4b). Las vías enriquecidas en USC sensibilizadas en comparación con ingenuas y resueltas incluyen aquellas relacionadas con la protección contra especies oxidativas reactivas (ROS), la señalización del receptor nuclear y la pluripotencia de células madre (Datos extendidos Fig. 6c, d). Por el contrario, no se expresaron genes diferencialmente entre USC resueltos e ingenuos. Los USC ingenuos juveniles se separaron de los USC ingenuos adultos principalmente a lo largo de PC2 (Fig. 4a), pero esta comparación solo reveló 8 DEG significativos (Datos extendidos Fig. 7a). Un biplot de PCA muestra que los genes que incluyen Znfx1 y Ly6e influyeron fuertemente en PC1, mientras que los genes que incluyen Kank1 y Krt1 influyeron fuertemente en PC2 (Datos extendidos Fig. 7b).

Los ARN se aislaron de ( a, b ) USC indiferenciados juveniles ingenuos, adultos ingenuos, resueltos y sensibilizados (líneas celulares de n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 de 14 ratones), o (c – f) urotelios diferenciados de células ingenuas, resueltas y sensibilizadas (diferentes cultivos de N3, R3 y S3) con o sin infección por UPEC, luego analizados por RNA-seq y por análisis diferencial. a, un PCA de USC RNA-seq por genes expresados ​​de manera significativamente diferencial muestra que las muestras están agrupadas por líneas celulares (resultado de infección anterior). b, Cuarenta genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se superponían entre USC sensibilizados frente a ingenuos y sensibilizados frente a resueltos. Los 15 DEG principales superpuestos se enumeran en la tabla. c, A PCA de RNA-seq urotelial diferenciado muestra agrupamiento por líneas celulares (resultado de infección previa) y condición de infección secundaria. d, Un diagrama de volcán que compara la urotelia diferenciada sensibilizada con infección simulada frente a la resuelta. Los DEG con FC >0,5, Padj <0,05 se indican como puntos rojos. e, Se utilizó el análisis de rutas para evaluar las rutas biológicas enriquecidas en genes expresados ​​diferencialmente en urotelios sensibilizados con infección simulada en relación con urotelios diferenciados resueltos. La significancia se determinó utilizando una prueba exacta de Fisher de cola derecha, con Padj < 0,05 considerándose vías significativamente enriquecidas. Se muestran las vías seleccionadas con puntuación z > 2 y -log (valor P) > 4,2 de las vías enriquecidas específicas por IPA. Se subrayan las vías que se superponen entre la urotelia diferenciada infectada con simulación y la infectada con UPEC (datos extendidos, Fig. 8d). f, Un mapa de calor que muestra los genes asociados a la muerte celular programada que se expresan diferencialmente en urotelios diferenciados sensibilizados, resueltos y sin infección simulada. La importancia de los DEG se determinó mediante la prueba de Wald, seguida de una corrección de prueba múltiple utilizando Benjamini-Hochberg FDR para el valor de P ajustado.

Datos fuente

A pesar de la gran cantidad de cambios epigenéticos encontrados en las USC sensibilizadas, solo se observaron unos pocos DEG cuando las USC se cultivaron en condiciones de promoción de células madre, lo que sugiere que los cambios epigenéticos que encontramos pueden tener un mayor impacto en la expresión génica en la diferenciación celular. Por lo tanto, realizamos RNA-seq de urotelios diferenciados con o sin infección por UPEC. PCA de todos los DEG mostró que los perfiles transcripcionales de urotelio diferenciado con infección simulada segregados por historial de infección (Fig. 4c), lo que indica diferencias intrínsecas en el urotelio diferenciado debido al historial de infección anterior. La infección causó en gran medida un cambio uniforme en la gráfica de PCA para cada línea celular (Fig. 4c), lo que probablemente refleja una respuesta transcripcional conservada a la infección por UPEC en cada estado de convalecencia (Datos extendidos, Fig. 8a). En particular, la expresión del gen codificante de Cox-2, Ptgs2, se indujo más en la infección de urotelios sensibilizados y resueltos en comparación con los ingenuos (Datos ampliados, Fig. 8b), de acuerdo con un estudio in vivo reciente7. La expresión génica diferencial entre urotelios diferenciados sensibilizados y resueltos con infección simulada se visualizó en un gráfico de volcán (Fig. 4d), y se realizó un análisis de vía de DEG (Fig. 4e). La urotelia diferenciada sensibilizada mostró activación de la señalización de PTEN, PPARɑ/RXRɑ y vías de desintoxicación mediadas por glutatión en relación con la urotelia diferenciada resuelta, independientemente de la infección por UPEC (Fig. 4e y Datos extendidos Fig. 8c, d). Varios de los DEG eran genes TF, incluidos Klf4 y Klf5 (datos extendidos, figura 9), lo que sugiere que estos pueden desempeñar un papel en la conducción y el mantenimiento de cambios epigenéticos únicos en las células uroteliales sensibilizadas en comparación con los otros tipos de células.

Con base en los datos de nuestro análisis de la vía GO que implican las vías de PCD en los DAR sensibilizados accesibles (Fig. 3c) y nuestras observaciones in vivo de que el urotelio sensibilizado remodelado se caracteriza por una exfoliación severa y heridas en la mucosa dependientes de la inflamación Cox-2 durante la infección por UPEC6, específicamente DEG interrogados involucrados con las vías de PCD. Un mapa de calor de la expresión génica muestra que muchos genes asociados con las vías de PCD se expresaron diferencialmente en urotelios diferenciados sensibilizados y resueltos entre sí y con urotelios diferenciados ingenuos adultos (Fig. 4f). Mientras que Casp1 (que fue el gen más altamente regulado al comparar la urotelia sensibilizada con infección simulada con la resuelta (Tabla complementaria 2)) y otros genes relacionados con la piroptosis (incluidos Aim2, Gsdmc2 y Gsdmc3) estaban regulados al alza en la urotelia diferenciada sensibilizada, otros genes relacionados con la piroptosis Los genes (como los Naips), así como los genes relacionados con la apoptosis y la necroptosis, aumentaron en la urotelia diferenciada resuelta, lo que sugiere que las células resueltas y sensibilizadas están predispuestas a diferentes mecanismos de PCD durante la infección por UPEC.

A continuación, examinamos si las diferencias de metilación del ADN en las USC se correlacionaban con los cambios de pliegue de RNA-seq en la urotelia diferenciada entre las USC sensibilizadas y resueltas, centrándonos en las DMR en los sitios promotores (Fig. 5a). La mayoría de los genes, incluidos Casp1 y Ptgs2os2 (un regulador positivo de la expresión de Cox-2 en cis y un regulador de la respuesta proinflamatoria en trans), mostraron una correlación negativa entre la expresión génica relativa y el nivel de metilación del ADN en el sitio promotor de ese gen (Fig. 5a). Usando el navegador de epigenoma WashU, se visualizaron la accesibilidad de la cromatina, la metilación del ADN y las marcas de modificación de histonas en los loci Casp1 y Ptgs2os2 (Fig. 5b, c). Los loci de los promotores Casp1 y Ptgs2os2 de las USC sensibilizadas están relativamente hipometilados y al mismo tiempo están enriquecidos en las marcas de histonas activas, H3K4Me3 y H3K27Ac, ​​en relación con las USC ingenuas y resueltas (Fig. 5b, c y datos extendidos, Fig. 10a). Varios TF que se enriquecieron en DAR sensibilizados accesibles (datos extendidos Fig. 3a), como los miembros de las familias Sox y AP-1 (Klf5, ETS y RUNX2), tienen sitios de unión predichos cerca del promotor Casp1 como se indica en el epigenoma Mapa del navegador (Datos extendidos Fig. 10b). La expresión de Casp1 por RT-qPCR fue aproximadamente 1,000 veces mayor en urotelios diferenciados sensibilizados en comparación con USC resueltos o ingenuos, independientemente de la infección por UPEC (Fig. 5d). En concordancia, la tinción de inmunotransferencia mostró caspasa-1 detectable solo en urotelio diferenciado sensibilizado (Fig. 5e), de acuerdo con nuestra proteómica ex vivo anterior de urotelio de ratón sensibilizado convaleciente8.

a, Para aquellos DMR que se encuentran dentro de 1 kb de las regiones promotoras, los cambios de pliegue de ARN-seq que comparan la urotelia diferenciada sensibilizada frente a la resuelta, ya sea con (eje y, puntos morados oscuros) o sin infección (eje y, puntos grises) se trazaron contra la metilación del ADN diferencias (eje x) entre USC sensibilizados y resueltos. b, c, las diferencias en la accesibilidad de la cromatina (ATAC-seq), la metilación del ADN (WGBS) y las modificaciones de histonas activas (H3K4me3 y H3K27ac) en los loci Casp1 (b) y Ptgs2os2 (c) en diferentes líneas de USC se visualizaron como pistas combinadas usando el mapa del navegador del epigenoma de WashU. En los datos de WGBS, se indica el % de metilación promedio en los sitios promotores Casp1 y Ptgs2os2 (recuadro rojo); las barras de color representan el % de metilación, los fondos grises representan CpG y las líneas negras indican la profundidad de secuenciación. Los CpG dentro de las regiones promotoras Casp1 y Ptgs2os2 tienen una cobertura de lectura de 8–25x y 18–23x, respectivamente. d, la expresión génica de Casp1 en urotelio diferenciado se midió mediante RT-qPCR (datos de n = 4, 4, 4, 5, 4, 4 muestras generadas a partir de urotelio diferenciado sin tratar, resuelto y sensibilizado de adultos que luego se infectan con PBS o UTI89, respectivamente, se representan como media ± sd). e, la expresión de proteína de caspasa-1 utilizando dos líneas celulares diferentes (N2, R2, S2 y N3, R3, S3) se evaluó mediante transferencia Western, y N3, R3 y S3 están representados. f, La muerte celular de urotelios diferenciados 4 h después de la infección con UTI89 se midió mediante el ensayo de LDH. Los datos son la media ± desviación estándar, obtenidos de n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6 muestras generadas a partir de urotelios diferenciados, resueltos y sensibilizados sin tratar en adultos, 2–3 líneas celulares biológicamente independientes, por condición, que luego se infectado con PBS o UTI89, respectivamente; la significancia se determinó con un análisis de varianza de una vía (ANOVA). Los ratones g,h, ingenuos, resueltos y sensibilizados se expusieron a 107 ufc de WT UTI89 (HlyA+) o UTI89ΔhlyA. Los datos se combinan de 2 a 3 experimentos independientes. g, cargas bacterianas en la vejiga a las 6 hpi (n = 10, 7, 19, 8, 14, 11 ratones adultos ingenuos, resueltos y sensibilizados desafiados con 107 ufc de UTI89 o UTI89ΔhlyA, respectivamente) examinadas en 2–3 experimentos independientes. Las barras indican los valores medianos y se usó la prueba U de Mann-Whitney de dos colas para determinar la importancia. h, Incidencia de cistitis crónica a 28 dpi. Prueba exacta de Fisher bilateral; Los valores de p se indican cuando son significativos.

Datos fuente

En nuestros estudios anteriores, encontramos que la toxina bacteriana formadora de poros secretada α-hemolisina (HlyA), comúnmente producida por UPEC, induce piroptosis dependiente de caspasa-1 y caspasa-11 (caspasa-4 en humanos) en humanos y ratones uroteliales células: una respuesta protectora que conduce a la exfoliación de las células infectadas22. Presumimos que la expresión mejorada de caspasa-1 en el urotelio diferenciado sensibilizado conduciría a una respuesta de muerte celular piroptótica más robusta tras la infección por UPEC de tipo salvaje (WT) (HlyA+) in vitro. Un ensayo de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa (LDH) demostró que la infección por UPEC indujo la muerte celular en urotelios diferenciados ingenuos, resueltos y sensibilizados (Fig. 5f), pero la muerte celular fue significativamente mayor en urotelios diferenciados sensibilizados. En infecciones de desafío con cepas WT UTI89 y UTI89ΔhlyA en ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados, observamos que la infección por ΔhlyA, que no activa la muerte celular piroptótica mediada por caspasa-1, mostró cargas bacterianas significativamente mayores en ratones sensibilizados en comparación con ratones WT, mientras que no se observaron diferencias en ratones ingenuos y resueltos (Fig. 5g). Además, la incidencia de cistitis crónica recurrente a los 28 días posteriores a la infección aumentó significativamente en ratones sensibilizados cuando se infectaron con ΔhlyA en comparación con WT (Fig. 5h), lo que indica que la sobreexpresión de caspasa-1 en células uroteliales sensibilizadas es una respuesta protectora que ayuda a resolver desafío UPEC infección.

Estudios previos han demostrado que la remodelación duradera del tejido de la vejiga se produce en respuesta a la infección por UPEC, y esta remodelación se acompaña de cambios en la susceptibilidad a la infección posterior, según los resultados de la infección previa5,6,7. Presumimos que esta susceptibilidad alterada está mediada, al menos en parte, por el desarrollo de inmunidad entrenada en la mucosa epitelial de la vejiga. A diferencia de la inmunidad adaptativa, que abarca las respuestas específicas de antígeno de los linfocitos T y B, la "inmunidad entrenada" se caracteriza por la adaptación tisular no específica de antígeno a la inflamación aguda y crónica, a veces en respuesta a una infección, y se ha estudiado predominantemente en profesionales. células inmunitarias innatas como macrófagos, monocitos, células dendríticas y células asesinas naturales23,24,25. Aquí usamos un sistema de cultivo de células epiteliales primarias10 para dilucidar la contribución intrínseca del urotelio a la remodelación de la mucosa de la vejiga como consecuencia de una infección previa, descubriendo evidencia de reprogramación epigenética de las células madre uroteliales como un mecanismo de inmunidad entrenada para la infección posterior del tracto urinario.

Se sabe que el urotelio de la vejiga de ratones previamente infectados es resistente a la colonización intracelular en relación con los ratones ingenuos de la misma edad6,7. Sin embargo, el mecanismo de esta resistencia a la colonización intracelular difiere entre ratones resueltos y sensibilizados. En ratones resueltos, la UPEC inicialmente forma comunidades bacterianas intracelulares en las células facetarias superficiales, similar a la de los ratones adultos sin tratamiento previo, pero se eliminan rápidamente dentro de las primeras 6 h de infección a través de una inflamación mediada por TNFα mejorada7. Por el contrario, las comunidades bacterianas intracelulares no se forman en absoluto en el urotelio sensibilizado in vivo, probablemente debido al pequeño tamaño de las células y la activación de actina de las células superficiales diferenciadas de forma incompleta6,26. En este trabajo, hemos aclarado otra faceta de la resistencia a la colonización de la vejiga en el urotelio sensibilizado, donde la muerte y la exfoliación de las células uroteliales mediadas por HlyA reducen aún más la colonización temprana de la vejiga. Este efecto es probablemente una consecuencia del aumento de la expresión inicial de caspasa-1 y quizás de otros factores asociados con el inflamasoma, como Gasdermins C2 y C3 que pueden actuar como efectores terminales de la lisis de células inflamatorias27, que se observaron aquí in vitro y se describieron anteriormente. en estudios proteómicos ex vivo de urotelios de ratón8. Aim2, que codifica un sensor inmunitario innato citosólico que puede activar el inflamasoma caspasa-1, también se expresó más en urotelios diferenciados sensibilizados. En la piel de ratones, el imiquimod y la inflamación resultante permiten que la piel tenga una respuesta mediada por Aim2 más rápida a un insulto inflamatorio secundario28, lo que sugiere que la reprogramación epigenética de los componentes del inflamasoma puede ser un mecanismo común para preparar los sensores de inflamación para prepararse para la exposición secundaria en sitios de tejido de barrera. Además, en ratones, la interleucina-6 (IL-6) materna producida en respuesta a la infección puede inducir cambios epigenéticos en las células madre epiteliales intestinales fetales en el útero29. En contraste con estos estudios previos, nuestro trabajo demuestra un papel directo de una infección bacteriana de la mucosa en la obtención de cambios epigenéticos específicos en las células madre epiteliales de la mucosa que alteran el resultado de infecciones posteriores.

La inmunidad entrenada protectora mediada por caspasa-1 en la vejiga sensibilizada a menudo se ve superada por la inflamación dependiente de Cox-2 que se produce en respuesta a las altas cargas bacterianas durante las primeras 24 h de rUTI6,8. La expresión de Cox-2 ocurre principalmente a nivel de las células uroteliales basales, pero su actividad puede provocar heridas en la mucosa a través del reclutamiento excesivo de neutrófilos, transformando así el panorama de colonización a favor de la colonización extracelular y el crecimiento de la bacteria. Por lo tanto, los ratones sensibilizados tienen respuestas protectoras y sensibilizantes contrapuestas a la infección de desafío, que normalmente se manifiestan como una distribución bimodal extrema de las cargas de infección a las 24 h posteriores a la infección5. Aunque tanto las vejigas resueltas como las sensibilizadas han mejorado las respuestas tempranas de Cox-2 in vivo, 24 h después de la infección, la respuesta inflamatoria de la vejiga solo se mantiene en ratones sensibilizados7 y la inhibición de Cox-2 protege a los ratones sensibilizados contra la cistitis recurrente grave6,8. De manera similar, la expresión del gen Ptgs2 inducido por infección (que codifica Cox-2) se mejoró tanto en urotelios diferenciados sensibilizados como resueltos en relación con los ingenuos. Sin embargo, la expresión del gen Ptgs2os2, que codifica LincRNA-Cox-2, un regulador positivo de la expresión de Ptgs2 y de la inflamación general30, difirió entre estas líneas celulares, incrementándose en la urotelia diferenciada sensibilizada en relación con la resuelta. En concordancia, encontramos marcas epigenómicas diferenciales que se asociaron con una mayor accesibilidad del locus Ptgs2os2 en los USC sensibilizados, lo que sugiere que la expresión de Ptgs2os2 en urotelios diferenciados se ve alterada por cambios epigenéticos en los USC. Por lo tanto, los cambios epigenéticos en el locus Ptgs2os2 pueden desempeñar un papel en la promoción de las respuestas proinflamatorias sostenidas de la vejiga sensibilizada, superando así la función protectora del aumento de la expresión de Casp1.

Los cambios en la expresión de las metiltransferasas de ADN, que metilan los sitios CpG del ADN, se han implicado como un mecanismo para la remodelación del epigenoma en respuesta a la infección aguda por UPEC31, lo que podría explicar cómo una infección previa, ya sea crónica o de resolución espontánea, podría alterar el epigenoma de la USC. . Sin embargo, la inflamación crónica en sí misma también es un potente inductor de la memoria epigenética que podría explicar las diferencias en el marcado epigenético entre las USC resueltas y sensibilizadas. Un modelo para esta reescritura del epigenoma es la presencia de los llamados 'dominios de memoria' donde el TF 'pionero' se une a los nucleosomas en respuesta a los estímulos abre la cromatina en loci sensibles al estrés y permite a los escritores epigenéticos remodelar la cromatina para permitirla. permanecer abierta después de que se eliminen los estímulos32. Klf4, que estaba regulado al alza en la urotelia diferenciada sensibilizada en comparación con la urotelia resuelta, es un TF33 pionero conocido. Además, nuestros análisis de descubrimiento de motivos respaldan la hipótesis de que la remodelación epigenética en las USC ocurre principalmente en las DAR asociadas con AP-1 en respuesta a una infección aguda autolimitada (DAR accesibles resueltas), pero que la infección aguda grave conduce a una infección crónica y la inflamación (DAR accesibles sensibilizados) induce la remodelación epigenética no solo en los DAR asociados con AP-1, sino también en DAR adicionales asociados con TF, como aquellos con sitios de motivos de la familia Klf y Sox.

Nuestro descubrimiento de la reprogramación epigenética de células madre epiteliales tras la infección por UPEC tiene implicaciones para comprender el mecanismo de la inmunidad entrenada intrínsecamente epitelial no solo contra las infecciones urinarias, sino también contra otros tipos de infecciones o enfermedades inflamatorias. Estudios mecanicistas adicionales pueden conducir a nuevas terapias para una variedad de infecciones recurrentes y enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, el uso terapéutico de un inhibidor de la histona desmetilasa LSD1, que se sobreexpresa en el cáncer epitelial de la piel, provoca aumentos notables en la metilación de H3K4 en las células, lo que conduce tanto a la diferenciación epidérmica prematura como a la represión del carcinoma de células escamosas34. Por lo tanto, una mayor investigación para identificar qué factores epigenéticos, TF o mediadores inflamatorios son directamente responsables de establecer y mantener estos recuerdos epigenéticos específicos in vivo proporcionaría conocimientos más profundos sobre el mecanismo y arrojaría luz sobre posibles objetivos terapéuticos para prevenir las rUTI y/o revertir la impronta epigenética que conduce a una mayor susceptibilidad a la enfermedad recurrente.

Toda la experimentación con animales se realizó de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el alojamiento y cuidado de animales de laboratorio. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas institucionales después de la revisión y aprobación del Comité de Estudios con Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en St Louis, Missouri.

Las cepas UPEC utilizadas en este estudio fueron el aislado de cistitis humana UTI89 y su derivado: UTI89 attHK022::COM-GFP (UTI89-KanR)35, UTI89 pANT4 y UTI89 hlyA::KD13 (UTI89 ΔhlyA-KanR)22. Tanto para la infección en ratones como in vitro, las cepas UTI89 se cultivaron estáticamente en caldo de lisogenia (LB) a 37 °C durante la noche, se subcultivaron 1:1000 en medios frescos y se cultivaron estáticamente a 37 °C durante 18 h.

Los ratones hembra C3H/HeN (Envigo) tenían entre 7 y 8 semanas de edad ("juveniles") en el momento de la infección inicial. Se inoculó un total de 108 ufc de UTI89 en la vejiga de ratones C3H/HeN mediante cateterismo transuretral5,36. Los ratones C3H/HeN desarrollan cistitis crónica de una manera dependiente de la dosis de infección y este inóculo produce cistitis crónica en aproximadamente el 50 % de los ratones6. Para monitorear los resultados de la infección, se recolectó orina. La bacteriuria persistente (104 ufc ml−1) se define como un punto de corte específico y sensible para detectar cistitis crónica5. La cistitis crónica durante la infección inicial se definió como una bacteriuria alta persistente (>104 ufc ml−1 de orina) en cada momento en que se recolectó la orina (1, 3, 7, 10, 14, 21 y 28 días después de la infección), mientras que la resolución de la cistitis se definió como el título bacteriano en la orina que cae por debajo de este límite en al menos un punto de tiempo.

A las 4 semanas posteriores a la infección, todos los ratones fueron tratados con trimetoprima y sulfametoxazol en el agua de bebida durante 10 días (54 y 270 μg ml−1 de agua, respectivamente)6. La orina se recogió semanalmente para confirmar la eliminación de la bacteriuria. Cuatro semanas después del inicio de los antibióticos, se usaron ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados para aislar las USC primarias o para el ensayo de infección secundaria. Para la infección secundaria, los ratones fueron desafiados con 107 ufc de bacterias inoculadas en las vejigas, luego sacrificados humanamente a las 6 h después de la infección, y se determinaron las cargas bacterianas para evaluar los resultados agudos.

Se cultivaron células epiteliales de carcinoma de vejiga humano, denominadas células 5637 (ATCC HTB-9), en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 % a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %.

El tejido de la vejiga de ratones juveniles, convalecientes, ingenuos, resueltos y sensibilizados se aisló, se dividió en dos y se incubó en una solución de extracción a 4 °C durante la noche. Las células uroteliales se rasparon del tejido de la vejiga, se centrifugaron a 4 °C a 300 g durante 5 min, se resuspendieron en solución de colagenasa IV fresca y se incubaron con balanceo a 37 °C durante 20 min. Las células se disgregaron mediante pipeteo suave, se filtraron con un filtro de 100 μm y luego se lavaron con medios de lavado. Las células se cultivaron en matrigel (BD Biosciences) con L-WRN CM al 50 % que contenía Y-27632 10 mM y SB431542 10 mM (R&D System)9. Los medios se cambiaron cada 2 días y las células se pasaron cada 3 días (división 1:2-3). Las USC se usaron para experimentos después de 10 pases para eliminar cualquier célula urotelial no madre restante.

Las USC se lavaron en PBS con EDTA 0,5 mM, se tripsinizaron en tripsina al 0,05 % y EDTA 0,5 mM durante 1 min a 37 °C, se disociaron mediante pipeteo vigoroso, se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm y se resuspendieron en medios de lavado. Se recubrieron Transwells (Corning Costar, 3413) en PBS con Matrigel 1:40 durante 30 min a 37 °C. Luego se sembraron de 3 a 4 × 104 USC en el inserto transwell, y se agregaron 100 μl y 600 μl de CM al 50 % que contenía Y-27632 10 mM a los compartimentos apical y basolateral del transwell, respectivamente.

La resistencia de las multicapas uroteliales se evaluó mediante la medición de TER utilizando un voltímetro-ohmímetro epitelial (World Precision Instruments). El valor promedio de las mediciones por triplicado se multiplicó por el área de la membrana transwell (0,33 cm2) para obtener un valor final en ohm × cm2 (ref. 37).

Cuando el urotelio estuvo completamente diferenciado (valor TER >4000 ohm × cm2), los cultivos se lavaron 3 veces en medio DMEM/F12 tibio y se infectaron con cepas UPEC a una multiplicidad de infección de 10. Luego, los transpocillos se incubaron a 37 °C durante 30 min, se cambiaron a medios que contienen 100 μg ml−1 de gentamicina para eliminar las bacterias extracelulares y se cultivan durante un tiempo prolongado. Después de la infección, los medios apicales y basolaterales se centrifugaron a 2000 g a 4 °C durante 5 min y se usaron para el ensayo de LDH (TaKaRa, MK401). Los transpocillos se lavaron con PBS estéril y luego se usaron para varios análisis.

Los urotelios diferenciados en transwells se lavaron y fijaron en PBS con paraformaldehído al 4 % durante 15 min y se enjuagaron 3 veces con PBS. Posteriormente, se añadieron 100 μl de Triton X al 0,2 % durante 10 min, luego se volcaron y las células se incubaron en 100 μl de BSA al 2 % para el bloqueo durante 30 min. Las muestras se tiñeron con anticuerpo primario, anti-queratina monoclonal de ratón 20 (Abcam, ab854, 1:200) y anticuerpo secundario, IgG anti-ratón de burro Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A-31571, 1:1,000), luego se tiñeron más con faloidina Alexa Fluor 555 (ThermoFisher, A34055, 1:200) y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ThermoFisher, D1306, 1:1000). Para la microscopía confocal, se utilizó un microscopio de barrido láser ZEISS LSM880 con Airyscan. Fiji ImageJ y el programa macro se utilizaron para calcular automáticamente el área de superficie de las células uroteliales en imágenes confocales apiladas en z.

Las USC o urotelios diferenciados se fijaron durante la noche en formaldehído al 10 % a 4 °C. Después del lavado en PBS, las muestras fijadas se preincrustaron en agar al 2%, se cortaron verticalmente, se colocaron en los transpocillos boca arriba, se incrustaron nuevamente en bloques de parafina y se seccionaron. Los portaobjetos se tiñeron para H&E e inmunoteñidos para anticuerpos seleccionados. Para la tinción de inmunofluorescencia, los portaobjetos se desparafinaron, hidrataron, bloquearon con suero de caballo inactivado por calor (HIHS) al 10 % y Triton X-100 al 0,3 % en PBS, se incubaron con el anticuerpo primario en HIHS al 1 % y PBS durante la noche a 4 °C y el anticuerpo secundario. en PBS durante 30–60 min a temperatura ambiente6. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-queratina 20 monoclonal de ratón (Abcam, ab854, 1:200), anti-E-cadherina policlonal de cabra (R&D Systems, AF748, 1:500), anti-uroplaquina policlonal de cabra 3a (Santa Cruz, sc -15186, 1:500), anti-uroplaquina monoclonal de ratón 3a (Fitzgerald, 10R-U103a, 1:50), anti-p63 policlonal de conejo (GeneTex, GTX102425, 1:1000), anti-K5 monoclonal de conejo (Abcam, ab150074 , 1:100) y antiqueratina monoclonal de ratón 14 (Santa Cruz, sc-53253, 1:50). Se utilizaron anticuerpos secundarios Alexa Fluor y DAPI a una dilución de 1:1000. Se proporciona más información sobre anticuerpos en la Tabla complementaria 3. Las muestras se visualizaron en un microscopio de fluorescencia de campo amplio Zeiss Axio Imager M2 Plus.

Los urotelios diferenciados se lavaron 3 veces en PBS, se fijaron en fijador EM (paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 2,5 % en PBS 1x) durante 1 h en hielo y se lavaron 3 veces en PBS. Luego, las muestras se posfijaron en tetróxido de osmio al 1,0 %, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol y luego se deshidrataron a 31,1 °C y 1072 psi durante 16 min en un secador de punto crítico6. Las muestras se montaron en trozos recubiertos con cinta de carbón y se recubrieron con oro/paladio bajo argón6, luego se tomaron imágenes en un Zeiss Crossbeam 540 FIB-SEM.

Los ARN se extrajeron de USC o urotelios diferenciados utilizando el mini kit RNAeasy Plus (Qiagen) y se transcribieron inversamente con iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad). Utilizamos 1 μl de 12,5 ng μl−1 de ADN complementario con cebadores que abarcan intrones específicos para cada gen, y se utilizó iQ SYBR Green Supermix de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioRad). Las secuencias de los cebadores que usamos en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 4. Los valores de expresión se normalizaron a 18S, y la expresión relativa en comparación con el control se determinó mediante el método de umbral de ciclo (ΔΔCt)38. Cada muestra se analizó por triplicado y se calcularon los valores promedio de Ct.

Las bibliotecas de ADNc de Illumina se generaron utilizando una versión modificada del protocolo RNAtag-seq39. Brevemente, se fragmentó 1 µg de ARN total, se agotó el ADN genómico, se desfosforiló y se ligó a adaptadores de ADN que portaban códigos de barras 5'-AN8-3' de secuencia conocida con un grupo de bloqueo 5' fosfato y 3'. Los ARN con código de barras se agruparon y se depletó el ARN ribosómico usando el kit de agotamiento de ARNr Ribo-Zero (Illumina). Las bibliotecas de cDNA se generaron agregando un segundo adaptador mediante cambio de plantilla y amplificación por PCR con cebadores que portaban secuencias Illumina P5 o P7, luego las bibliotecas se secuenciaron en Illumina HiSeq 2500. secuencia de código de barras asociada mediante scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/split_merge_pl). Luego, las lecturas se recortaron con cutadapt v1.6 y las lecturas recortadas se alinearon con el genoma de Mus musculus mm10 usando tophat2 v2.0.11 y bowtie2 v2.2.2. Los recuentos de genes se realizaron mediante HTSeq v0.6.0 y los recuentos de lectura se asignaron a las transcripciones anotadas utilizando Salmon v0.8.27.

La normalización de lectura y la expresión diferencial se realizaron con DESeq2 v1.14.040. Se usaron transformaciones rlog de lecturas normalizadas con DESeq para gráficos de PCA. Fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM) La normalización de lecturas DEseq2 se utilizó para mapas de calor de puntuación z. La expresión de TF se determinó utilizando valores normalizados de FPKM de DESeq2 y una lista de TF de ratón (n = 453) de HOCOMOCO v1141, una base de datos de TF de motivos de TF validados. Se utilizó un valor de corte de P ajustado de 0,05 y la expresión del candidato TF se visualizó utilizando mapas de calor de puntuación z. Las diferencias estadísticamente significativas en la expresión génica se evaluaron mediante la prueba de Wald, seguida de una corrección de prueba múltiple utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg, considerándose significativa una P < 0,05 ajustada. Los análisis de ruta se realizaron con análisis de ruta de ingenio (IPA). La significación se determinó mediante una prueba exacta de Fisher de cola derecha, con Padj < 0,05 considerándose vías significativamente enriquecidas.

Se usaron células individuales (1–2 × 105) de USC ingenuas, resueltas y sensibilizadas para la preparación de núcleos, y se contaron 50 000 núcleos y se transfirieron a 25 μl de tampón 2X TD. Se añadió la mezcla de reacción Omni-ATAC-seq (25 μl), incluida la enzima TDE1, a 25 μl de 50 000 núcleos en tampón 2x ​​TD, luego las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 min (golpes cada 10 min durante la incubación en un bloque de calor). Los fragmentos de ADN transpuestos se purificaron inmediatamente utilizando un kit de purificación PCR MinElute (Qiagen). Las bibliotecas de ATAC-seq se amplificaron mediante amplificación por PCR (10–12 ciclos) con una extensión inicial de 5 min a 72 °C y se purificaron con perlas AMPure XP (Beckman Coulter). Las bibliotecas purificadas se eluyeron con 20 μl de agua libre de nucleasas, se cuantificaron con el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (ThermoFisher) y se verificó su distribución de tamaños con una TapeStation 4200 (High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents). Las bibliotecas ATAC-seq de extremo emparejado se secuenciaron en un Illumina NextSeq 500 (~ 350 millones de lecturas).

El análisis ATAC-seq42 utilizó las siguientes herramientas y versiones: Fastqc v0.11.5, Cutadapt v1.11, Samtools v1.5, Bowtie2 v2.3.0, picard v2.10.0, Macs2 v2.1.1.20160309 y bedtools v2.26.0. Las lecturas de secuenciación se desmultiplexaron utilizando secuencias de índice específicas de la muestra, se verificó la calidad con fastqc, se recortaron con cutadapt y se alinearon con un genoma de ratón de referencia (mm10) con bowtie243. Luego se usó Picard para eliminar la alineación secundaria, multiplicar las lecturas mapeadas y las lecturas duplicadas de PCR, y la llamada máxima se realizó con MACS244. El análisis de la tasa de descubrimiento irreproducible (IDR) con dos réplicas se realizó siguiendo las pautas de ENCODE45, y los picos de ATAC con IDR < 0,05 se eligieron como regiones de cromatina accesibles altamente reproducibles para análisis posteriores. Las señales de ATAC-seq se visualizaron en WashU Epigenome Browser46 como cambio de pliegue (FC) sobre el fondo usando pistas de bedGraph generadas usando la función MACS2 bdgcmp.

Para identificar los DAR, se usó Diffbind v2.10.0 en IDR < 0,05 picos de ATAC, y se usó Benjamini-Hochberg FDR con un punto de corte < 0,05 para significación estadística. Se utilizaron DAR significativos (FDR < 0,05) para generar diagramas de volcanes y mapas de calor. GREAT16 (parámetro basal más extensión) se utilizó para el análisis de la vía GO. GREAT clasifica los resultados por valor P binomial utilizando una prueba binomial. Las DAR sensibilizadas (FC > 1,5) y específicas resueltas (FC < -1,5) se analizaron por separado y las 15 vías enriquecidas principales se muestran en la figura 3e-f.

Se trataron células individuales (1–2 × 105) de USC con DNasa I para eliminar la contaminación de trazas de ADN del Matrigel. El ADN genómico (ADNg) se preparó a partir de las células utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, 69504). Con 200 ng de gDNA y 0,4 ng de lambda, el ADN se trató con bisulfito con el kit EZ DNA Methylation-Direct (Zymo, D5020) y se procesó con el kit xGen Methyl-Seq Library Prep (IDT, 10009824) para generar bibliotecas WGBS compatibles con Illumina. Las bibliotecas fueron secuenciadas en un NovaSeq S4 300XP (~300 millones de lecturas) por el instituto MGI.

Los comandos de análisis de WGBS con parámetros específicos se detallan en la sección Disponibilidad de código. En resumen, se utilizó fastqQC v0.11.8 para evaluar la calidad de las lecturas sin procesar. Posteriormente, las lecturas de los extremos emparejados se recortaron para eliminar las secuencias del adaptador y las lecturas de baja calidad con Cutadapt v1.18 y se volvieron a evaluar con FastqQC. El genoma de referencia de ratón mm10 se convirtió primero con bisulfito utilizando Bismark v0.20.0. Las lecturas de extremos emparejados se alinearon con el genoma convertido con bisulfito mm10 y se deduplicaron usando 'deduplicate_bismark'. Los niveles de metilación del ADN se calcularon utilizando 'bismark_methylation_extractor' y se mostraron en un formato de metilC en el navegador de epigenoma WashU46. La conversión de bisulfito se estimó usando la tasa de conversión de citosina a timina en el genoma de referencia lambda.

Los DMR se identificaron con DSS v2.43.247 usando una comparación de dos grupos para réplicas biológicas y se llamaron usando 'DMLtest' y 'callDMR'. Se generó un gráfico PCA de la metilación de CpG dentro de DMR utilizando Deeptools v3.3.0. Las réplicas biológicas se combinaron mediante la fusión de archivos fastq entre las réplicas y el reprocesamiento siguiendo los pasos descritos anteriormente. La densidad de CpG se visualizó utilizando un límite de cobertura de 5x y ggplot2 v3.3.6.

Las DMR específicas sensibilizadas se definieron como las regiones superpuestas entre las DMR ingenuas frente a las sensibilizadas y resueltas frente a las sensibilizadas. El porcentaje de metilación para los DMR específicos sensibilizados se visualizó utilizando el paquete R 'ComplexHeatmap'. La metilación del ADN sobre las hipo-DMR específicas sensibilizadas se representó con Deeptools y se visualizó con ggplot2. Las regiones superpuestas entre DMR se identificaron y visualizaron utilizando Intervene48 'Venn' con parámetros predeterminados. El análisis GREAT16 en hipo-DMR sensibilizados se realizó como se describe en el análisis ATAC. Los hipo-DMR sensibilizados también se analizaron para la anotación genómica usando UCSC (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables) para descargar GENCODE M25 (https://www.gencodegenes.org/mouse/release_M25.html ). El promotor se definió como 1 kb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. La prioridad de anotación genómica se asignó en el siguiente orden: promotor, exón codificante, 5'UTR, 3'UTR, intrón e intergénico. Los DMR se asignaron a la anotación si el DMR se superponía al 20 % de la anotación utilizando BEDTools v2.27.1 intersect y se trazaron utilizando el cambio porcentual de metilación del ADN entre sensibilizado y resuelto frente al log2 (FC) de genes asociados entre sensibilizado y resuelto urotelio diferenciado con o sin infección.

Las células individuales (0,2 × 106) de USC se entrecruzaron ligeramente en formaldehído al 0,1 % y los sedimentos de células fijas se almacenaron a -80 °C antes de su uso. H3K4Me3, H3K27Ac y H3K27Me3 CUT&RUN se realizó utilizando el kit de ensayo CUT&RUN (Cell Signaling, 86652), con algunas modificaciones. Brevemente, las células se unieron a perlas de concanavalina A para cada experimento. Las células se permeabilizaron con digitonina en el tampón de unión de anticuerpos que contenía espermidina e inhibidores de la proteasa y luego se incubaron con anticuerpos primarios contra H3K4Me3 (Señalización celular, 9751, 1:50), H3K27Ac (Señalización celular, 8173, 1:100) o H3K27Me3 (Señalización celular). , 9733, 1:50) a 4 °C durante la noche en un rotador. La mezcla de perlas y células se lavó 3 veces con tampón de digitonina, se resuspendió en 50 µl de pAG-MNasa y se incubó a 4 °C durante 1 h en un rotador. Las muestras se digirieron en tubos PCR que contenían 150 µl de tampón de digitonina frío y 3 µl de CaCl2 a 4 °C durante 30 min en un termociclador. Luego, las perlas se transfirieron nuevamente a los tubos de microcentrífuga, se agregaron 150 µl de tampón 1X STOP y los tubos se incubaron a 37 °C durante 10 min. Colocando los tubos en una gradilla magnética, los sobrenadantes se recogieron en un tubo nuevo. Los entrecruzamientos se revirtieron agregando 3 µl de solución de SDS al 10 % y 2 µl de 20 mg ml−1 de proteinasa K, luego las muestras se incubaron a 65 °C durante 2 h. El ADN de las muestras de cromatina enriquecidas se purificó utilizando columnas giratorias de ADN (Zymo, D4013). La biblioteca de secuenciación se preparó con el kit Ultra II DNA Library Prep (NEB, E7645) siguiendo las instrucciones del fabricante, pero reduciendo el tiempo de hibridación y extensión a 10 s durante el enriquecimiento por PCR del ADN ligado con adaptador.

Puede encontrar una lista detallada de comandos y parámetros en Disponibilidad de código. Brevemente, se utilizó fastqQC v0.11.9 para evaluar la calidad de lectura. Posteriormente, las lecturas de extremos emparejados se recortaron con Cutadapt v1.9 y se volvieron a evaluar con fastqQC. Luego, las lecturas se alinearon usando bowtie2 v2.3.4.149. Las lecturas mitocondriales se eliminaron con samtools v1.9 y se deduplicaron con Picard v2.8.1 MarkDuplicates. Las lecturas mapeadas de forma única se extrajeron mediante la vista de samtools. Los picos se llamaron usando MACS2 v2.1.1.20160309 'callpeak': '-q 0.01' para picos estrechos H3K4Me3 y H3K27Ac, ​​y '-q 0.05 --broad' para H3K27Me3. Se eliminaron las regiones de la lista negra definidas por codificación. Para cada modificación de histonas, se utilizó una lista de picos de consenso para calcular la fracción de lecturas en picos (FRIP). Luego, las lecturas se convirtieron al formato bigWig usando Deeptools y se normalizaron usando la cobertura de lectura y la puntuación FRIP. Las réplicas biológicas normalizadas se combinaron usando ucsc-bigwigmerge v377 y se convirtieron de bedGraph a bigWigs usando kentUCS v334 y tamaños de cromosomas mm10 de UCSC (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes ). Para perfilar regiones DMR específicas sensibilizadas para otras modificaciones epigenéticas, las hipo-DMR sensibilizadas se superpusieron con picos estrechos de MASC2 para ATAC, H3K4Me3 y H3K27Ac, ​​y picos anchos para H3K27Me3. La puntuación máxima correspondiente se normalizó utilizando las puntuaciones FRIP y se representó gráficamente utilizando el paquete R 'ComplexHeatmap'. Usando las pistas de bigWig normalizadas, las señales ATAC, H3K4Me3, H3K27Ac y H3K27Me3 se trazaron sobre los hipo-DMR específicos sensibilizados usando Deeptools. Las señales bigWig normalizadas se utilizaron para el mapa de calor casp1.

Las células se lisaron con tampón de lisis celular (Cell Signaling, 9803S) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó el kit Rapid Gold BCA Protein Assay para determinar las concentraciones de proteína en el lisado celular, y se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra caspasa-1 (AdipoGen, AG-20B-0042-C100, 1:5000) y β-actina (MA5-15739, Invitrogen, 1:10000). Se utilizaron anticuerpos secundarios ligados a HRP (Cell Signaling, 7076S, 1:3000) y reactivo ECL (Amersham, RPN2209) para visualizar las bandas de proteínas.

Para representar imágenes de tinción confocal, de inmunofluorescencia y SEM, se tiñeron y tomaron imágenes de 3 a 4 líneas celulares diferentes (entre J1-5, N1-4, R1-4 y S1-4). Para las imágenes de transferencia Western, se probaron dos líneas celulares diferentes. Las estadísticas de parcelas/gráficos se analizaron en GraphPad Prism v8.4.3. Los valores P exactos se indican cuando son significativos (P < 0,05) (GraphPad Prism no proporcionó un valor P exacto cuando P < 0,0001).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento, su Información complementaria o Datos de origen. Los datos de RNA-seq, ATAC-seq, WGBS y CUT&RUN se han depositado en NCBI con el número de ID de BioProject. PRJNA705407. El mapa del navegador del epigenoma de WashU que visualiza los datos de ATAC-seq, WGBS-seq y CUT&RUN, y RNA-seq (cadena directa: verde y cadena inversa: naranja) está disponible en los siguientes enlaces:

Repeticiones combinadas:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_combined.json

Repeticiones combinadas e individuales:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_all.jsonSe proporcionan datos de origen con este documento.

Tubería general ATAC-seq:

https://www.encodeproject.org/documents/c008d7bd-5d60-4a23-a833-67c5dfab006a/@@download/attachment/ATACSeqPipeline.pdf

Tubería general CUT&RUN:

https://github.com/Yonghao-Holden/tricks/blob/main/cuttag_pipe_v1.sh

Tubería general de WGBS:

https://github.com/hyungjoo-lee/wgbs

El código personalizado para ATAC-seq, GUT&RUN, WGBS y cifras:

https://github.com/jharrison0123/Uropathogenic-Escherichia-coli-infection-duced-trained-immunity-affects-urinary-tract-disease

El código para las parcelas de volcanes: https://github.com/bsolson/Volcano_plot

Código de EnhancedVolcano: https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano

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Descargar referencias

Agradecemos al Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI), que cuenta con el apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, el Instituto de Descubrimiento Infantil de la Universidad de Washington y el Hospital Infantil St Louis (CDI-CORE-2015-505), y la Fundación para Barnes -Hospital Judío (3770), para preparación e imagen de muestras de microscopía electrónica de barrido. Agradecemos a M. Shih por desarrollar el código macro Fiji ImageJ para la medición automática del tamaño de celda de imágenes confocales y K. Dodson por su asistencia editorial. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (U01 AI095542 a SJH y MC; U19AI110818 a JL); un Premio al Investigador Joven del consorcio del Equipo de Estudios de Inmunología de las Mucosas de los Institutos Nacionales de la Salud (U01 AI095776 a TJH); el Centro basado en recursos de investigación de enfermedades reumáticas de la Universidad de Washington (P30 AR073752, EDOR); una beca de la Academia Internacional de Becarios McDonnell en la Universidad de Washington en St Louis (para SKR); y una beca de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias (#DGE –114395 para VPO). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Departamento de Microbiología Molecular y Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas de la Mujer, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.

Seongmi K. Russell, Benjamin S. Olson, Valerie P. O'Brien, Lu Yu, Rajdeep Bomjan, Thomas J. Hannan y Scott J. Hultgren

Departamento de Genética, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Elisha DO Roberson, Changxu Fan, Marina Sha y Ting Wang

Edison Family Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine, St Louis, MO, EE. UU.

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Changxu Fan, Marina Sha y Ting Wang

Fred Hutchinson Cancer Center, División de Biología Humana, Seattle, WA, EE. UU.

Valerie P. O'Brien

Programa de Enfermedades Infecciosas y Microbioma, The Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

jonathan livni

Departamento de Medicina, División de Reumatología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.

Eliseo DO Roberson

Departamento de Infección Microbiana e Inmunidad, Instituto de Enfermedades Infecciosas, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Shady Estfanous y Amal O. Amer

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia de la Universidad de Helwan, El Cairo, Egipto

Shady Estfanous

Departamento de Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St Louis, MO, EE. UU.

Marco Colonna y Thomas J. Hannan

Departamento de Inflamación e Inmunidad, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland, Cleveland, OH, EE. UU.

Thaddeus S. Stappenbeck

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SKR, MC, TJH y SJH conceptualizaron el proyecto. SKR, TSS, TW, TJH y SJH desarrollaron la metodología. SKR,. HJL, VPO, XX, JL, RB y TJH realizaron las investigaciones. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, LY, EDOR y MS realizaron un análisis formal. SKR escribió el borrador original. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, RB, SE, AOA, TW, TJH y SJH revisaron y editaron el manuscrito. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO y CF realizaron visualización. TW, TJH, MC y SJH obtuvieron financiación. TW, TJH y SJH supervisaron el proyecto.

Correspondencia a Ting Wang, Thomas J. Hannan o Scott J. Hultgren.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.̈

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(A) Para la expansión celular, los agregados de células disociadas se incrustaron en matrigel fresco y luego se desarrollaron en nuevos esferoides. Los esferoides uroteliales se pueden pasar cada 3 días usando diluciones de 1:2 a 1:3 dependiendo de la densidad celular. (BD) Las USC primarias originadas a partir de ratones C3H/HeN de 8 semanas de edad se cultivaron en matrigel con CM al 50 %. Después de 3 días de cultivo en CM al 50 %, los medios se cambiaron a CM al 50 % o CM al 5 % frescos a los 3, 5 y 7 días, luego se aislaron los ARN en 1, 2, 3 (amarillo), 5 (verde), y 7 días (naranja) (cultivo USC n = 12, 9, 13, 12, 12, 11, 11 respectivamente). (B) La expresión génica de p63, (C) Axin2, un marcador de señalización de Wnt y (D) Upk3a, un marcador de diferenciación de células uroteliales, se midió mediante qRT-PCR y los datos se representan como media ± SD. La significación se determinó mediante una prueba t no pareada (dos colas). (E) Para cultivar organoides de vejiga en matrigel, las USC se precultivaron en CM al 50 % durante 3 días, se disociaron suavemente y luego se pasaron a matrigel fresco para su cultivo en CM al 50 % o al 0 % durante 5 días, mientras que los medios se cambiaron cada 2 días. Después de 5 días de cultivo, los esferoides USC se fijaron con formaldehído tamponado neutro (NBF) al 10 % y se prepararon para su inclusión en parafina. El portaobjetos con secciones de parafina se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) y se inmunotiñó para Upk3a (rojo), E-cadherina (amarillo) y DAPI (azul) o K20 (rojo), K5 (amarillo) y DAPI (azul) .

Datos fuente

(A) Se cultivaron células uroteliales C3H/HeN primarias y células 5637 en Transwells durante 2 a 3 semanas y se midió la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de Transwells cada 2 días antes del cambio de medio. Datos recopilados de cada línea celular (n = 3 para cada uno) representados como media ± SD. (B) El urotelio de montaje completo de ambos tipos de células se fijó y se tiñó para el análisis de microscopía confocal; F-actina (verde) y DAPI (azul). (C) El tamaño de las células superficiales de las células uroteliales C3H/HeN primarias y las células 5637 se midió utilizando imágenes confocales (n = 10 cada una). Los datos se representan como media ± SD y la significación se determinó mediante una prueba t no pareada (dos colas) (valor p <0,001). (D) Los cultivos Transwell de células C3H/HeN y 5637 se fijaron, se cortaron en rodajas y luego se procesaron para inclusión en parafina. Las secciones histológicas se cortaron y se tiñeron con H&E o se inmunoteñeron para Upk3a, K20, Ecad, K5, p63 y DAPI.

Datos fuente

(AB) El análisis de motivos HOMER utilizando datos USC ATAC-seq (Fig. 4a) generó listas de motivos de unión TF enriquecidos en DAR accesibles sensibilizados (A) y DAR accesibles resueltos (B) con sus valores p. HOMER escaneó las secuencias de DAR en busca de motivos conocidos y calculó el valor p de la puntuación de enriquecimiento mediante la prueba binomial. HOMER también descubrió motivos de novo con sus mejores coincidencias con un motivo conocido en DAR. Cada uno de los 10 principales motivos conocidos y de novo enriquecidos en USC sensibilizados (A) y resueltos (B) se muestran con su logotipo de secuencia y valor p.

(A) Diagrama de Venn de todas las comparaciones de DMR con los números de cada una de las comparaciones. Las DMR específicas sensibilizadas se muestran en la superposición entre las comparaciones de DMR ingenuas frente a sensibilizadas y sensibilizadas frente a resueltas. (B) La densidad de la metilación de CpG muestra una distribución bimodal sin diferencias globales en la metilación del ADN entre los tres grupos (USC ingenuos, resueltos y sensibilizados), donde la metilación de CpG representa la fracción del total de lecturas que están metiladas por sitio de CpG.

Datos fuente

(A) Los DMR específicos sensibilizados entre los USC ingenuos, resueltos y sensibilizados se visualizan como una serie de mapas de calor que muestran la metilación del ADN, ATAC y modificaciones de histonas: H3K27Ac (promotor/potenciador activo), HeK4Me3 (promotor) y H3K27Me3 (represión polycomb ). (B) Se visualizan señales promedio 5 kb aguas arriba y 5 kb aguas abajo de hipo-DMR específicas sensibilizadas para H3K27Me3 (represión de Polycomb) para cada línea celular.

Los ARN se aislaron de USC ingenuos, resueltos y sensibilizados, luego se analizaron mediante RNA-seq y se realizó un análisis diferencial. La significación se determinó mediante la prueba de Wald seguida de una corrección de prueba múltiple usando Benjamini-Hochberg FDR para el valor de p ajustado. 0,05). Aquí se enumeran las vías enriquecidas en los USC sensibilizados en comparación con (C) Naïve y (D) USC resueltos. Las vías superpuestas en ambos análisis están subrayadas. El IPA determina la importancia utilizando una prueba exacta de Fisher de cola derecha, con P-ajustado <0,05 considerados vías significativamente enriquecidas.

Datos fuente

El ARN se aisló de USC juveniles ingenuos, adultos ingenuos, resueltos y sensibilizados (líneas celulares de n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 de 14 ratones). Luego, se realizó un análisis de RNA-seq como se describe en la Fig. 4a. La significancia se determinó mediante la prueba de Wald seguida de una corrección de prueba múltiple utilizando Benjamini-Hochberg FDR para el valor de p ajustado. (A) Un gráfico volcánico de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) que compara los USC juveniles ingenuos con los adultos ingenuos identifica 8 DEG significativos (límite de FDR 0,1). (B) El biplot de PCA para el PCA que se muestra en la Fig. 4a indica la fuerza con la que cada gen influye en los componentes principales (PC). Los genes que incluyen Znfx1 y Ly6e influyen fuertemente en PC1 (Dim1), mientras que los genes que incluyen Kank1 y Krt1 influyen fuertemente en PC2 (Dim2).

Datos fuente

Se utilizaron datos de ARN-seq de urotelios diferenciados infectados con UTI89 e infectados de forma simulada (Fig. 4c) para realizar un análisis diferencial. (A) Gráficos de volcán que comparan urotelios diferenciados infectados por UPEC frente a infectados de forma simulada Naïve, Resuelto y Sensibilizado (respuesta a la infección por UPEC). (B) La expresión génica diferencial de Ptgs2 entre urotelios diferenciados ingenuos, resueltos y sensibilizados con o sin infección UTI89 se visualiza como un mapa de calor. (C) Se realizó un gráfico de volcán que comparaba la urotelia diferenciada sensibilizada frente a la resuelta de UTI89 infectada. (D) Se utilizó el análisis de vías para evaluar las vías biológicas enriquecidas en genes expresados ​​diferencialmente en urotelios diferenciados sensibilizados infectados con UPEC en relación con urotelios diferenciados resueltos, y la significación se determinó mediante una prueba exacta de Fisher de cola derecha, con P ajustada <0,05 considerada significativamente caminos enriquecidos. Se muestran rutas seleccionadas con puntuación z > 2 y -log (valor p) > 2 de las rutas enriquecidas específicas por IPA.

Datos fuente

(AB) Se realizó un análisis del motivo HOMER de los datos de ATAC-seq en la Fig. 4 para mostrar el enriquecimiento diferencial del motivo de unión de TF en los DAR que se encuentran en los USC sensibilizados y resueltos. Usando una lista de cada uno de los 10 motivos principales conocidos y de novo de DAR accesibles sensibilizados (A) y DAR accesibles resueltos (B) (Datos extendidos Fig. 3a, b), expresiones génicas diferenciales de estos TF de unión de motivo en Naïve, Resuelto , y la urotelia diferenciada sensibilizada se visualizan como mapas de calor. Los genes que no se encuentran en los datos de RNA-seq se excluyen del mapa de calor. (C) Los 10 TF principales expresados ​​diferencialmente entre urotelios diferenciados sensibilizados frente a resueltos se visualizan como un mapa de calor con Log2 (FC) y P-adj indicados. La importancia de los DEG se determinó mediante la prueba de Wald seguida de corrección de prueba múltiple utilizando Benjamini-Hochberg FDR para el valor de p ajustado.

(A) Las diferencias en la accesibilidad de la cromatina, la metilación del ADN y las modificaciones de histonas, H3K4Me3 y H3K27Ac, ​​en diferentes USC se evaluaron mediante ATAC-seq, secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) y CUT&RUN. La metilación relativa del ADN, la accesibilidad de la cromatina y las modificaciones de histonas en el sitio del promotor Casp1 que comparan los USC ingenuos, resueltos y sensibilizados se muestran como un mapa de calor mostrando la señal normalizada usando la cobertura de lectura y la fracción de lecturas bajo los picos de consenso. (B) Los posibles sitios de unión a TF cerca del promotor Casp1 se visualizan en el mapa del navegador del epigenoma.

Tabla 1. Lista de 2880 regiones accesibles de forma significativamente diferencial (DAR) entre USC sensibilizadas y resueltas y sus nombres de genes proximales, que respaldan la Fig. 3a, b. Tabla 2. Principales genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de IPA que comparan la urotelia diferenciada sensibilizada con infección simulada frente a la resuelta. 'Exp log ratio' indica el cambio de expresión log2 veces. Tabla 3. Información de anticuerpos. Tabla 4. Lista de cebadores qRT-PCR.

Pestaña 1 (Fig. 1b). Medición de TER en los días indicados durante 21 días de cultivo/diferenciación de C3H/HeN juveniles independientes n.° 1–5 en transwells.

Pestaña 1 (Fig. 2b). Evolución temporal del título bacteriano en orina durante 4 wpi durante la infección inicial con 108 ufc UTI89 KanR en 8 semanas de ratones hembra C3H/HeN. Pestaña 2 (Fig. 2f). Tamaño celular promedio por transpocillo representado como mediana con un IC del 95 %. Pestaña 3 (Fig. 3g). Tamaño de celda individual representado como mediana con IC del 95%.

Pestaña 1 (Fig. 3c). DAR sensibilizados accesibles (comparación sensibilizada frente a resuelta, n = 747 DAR, cambio de pliegue > 1,5, FDR < 0,05) utilizados para el análisis de términos GREAT GO. Pestaña 2 (Fig. 3d–h). Lista de 189 regiones sensibilizadas específicas diferencialmente metiladas (DMR) de comparaciones ingenuas frente a sensibilizadas y resueltas frente a sensibilizadas.

Pestaña 1 (Fig. 4b-1). Comparación de DEG entre USC sensibilizados frente a resueltos, que también respalda a ED Fig. 6b. Pestaña 2 (Fig. 4b-2). Comparación de DEG entre USC sensibilizados frente a ingenuos, que también respalda a ED Fig. 6a. Pestaña 3 (Fig. 4d). Comparación de DEG entre urotelios diferenciados sensibilizados frente a infectados simulados utilizados para el gráfico de volcanes. Pestaña 4 (Fig. 4e). Análisis de la vía IPA de urotelia diferenciada sensibilizada frente a resuelta con infección simulada. Pestaña 5 (Fig. 4f). Una visualización de mapa de calor de la expresión génica diferencial en urotelios diferenciados ingenuos, resueltos y sensibilizados con o sin infección, que también admite datos extendidos Figs. 8b y 9.

Pestaña 1 (Fig. 5d). La expresión génica de Casp1 en urotelios diferenciados ingenuos, resueltos y sensibilizados con o sin infección UTI89 se midió mediante qRT-PCR (n = 4, 4, 4, 5, 4, 4). Pestaña 2 (Fig. 5f). Medición de LDH de urotelio diferenciado ingenuo, resuelto y sensibilizado tras infección UTI89 a las 4 hpi. Datos obtenidos de n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6. Pestaña 3 (Fig. 5g). Se desafió a ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados con 107 ufc de WT UTI89 (HlyA+) o UTI89ΔhlyA. Los datos se combinaron de dos a tres experimentos independientes. Las cargas bacterianas de la vejiga a las 6 hpi, medidas de n = 10, 7, 19, 8, 14, 11 ratones, respectivamente, se examinaron en 2 o 3 experimentos independientes. Pestaña 4 (Fig. 5h). Incidencia de cistitis crónica frente a resolución a 28 ppp para ratones ingenuos, resueltos y sensibilizados tras la infección de desafío.

Figura 5e. Imágenes de gel y transferencia sin recortar de urotelios diferenciados N3, R3 y S3. a, Gel completo cargado con dos conjuntos de 6 muestras (células uroteliales N3, R3 y S3 infectadas de forma simulada con PBS y células uroteliales N3, R3 y S3 infectadas con UTI89) con colorante de carga Tris-glicina al 4–20 %. Tanto las células uroteliales sensibilizadas no infectadas como las infectadas tenían tinción con caspasa-1. Solo se usaron datos de N3, R3 y S3 con infección simulada para el artículo, ya que las células sensibilizadas expresaron caspasa-1 independientemente de la condición de infección. b, imagen de la membrana (se usó un corte de 1 a 6 carriles para la tinción de β-actina y un corte de 7 a 14 carriles para la tinción de caspasa-1). c, El revelado de la película se realizó por separado ya que la tinción con β-actina y caspasa-1 necesitaba diferentes tiempos de exposición (1 min y 3 min, respectivamente). La expresión de β-actina (~48 kDa) fue similar entre todas las muestras, mientras que solo las células sensibilizadas tenían tinción en las ubicaciones P45 pro-caspasa-1 (~45 kDa) y P35 caspasa-1 (~35 kDa). Para la Fig. 5e en el manuscrito, (d) se usó una imagen de exposición de 20 s en lugar de una exposición de 1 min para la β-actina para una separación de bandas más limpia.

Pestaña 1 (ED Fig. 1b). Expresión de p63 medida por qRT-PCR de células primarias C3H/HeN cultivadas en la condición indicada en ED Fig. 1b-d. Cada condición en los puntos de tiempo de medición es n = 12, 9, 13, 12, 12, 11, 11, respectivamente. Pestaña 2 (ED Fig. 1c). Medición de la expresión de Axin2 utilizando el mismo conjunto de muestras. Pestaña 3 (ED Fig. 1d). Medición de la expresión Upk3a utilizando el mismo conjunto de muestras.

Pestaña 1 (ED Fig. 2a). Comparación de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) entre las USC C3H/HeN primarias y las células 5637 durante 2 a 3 semanas de cultivo en condiciones de diferenciación. Pestaña 2 (ED Fig. 2b). Comparación del tamaño de las células superficiales entre las células uroteliales C3H/HeN primarias y las células 5637 (n = 10 cada una).

Pestaña 1 (ED Fig. 4a-1). DMR ingenuos frente a sensibilizados. Pestaña 2 (ED Fig. 4a-2). DMR ingenuos frente a resueltos. Pestaña 3 (ED Fig. 4a-3). DMR resueltos vs sensibilizados.

Pestaña 1 (ED Fig. 6c). Análisis de la vía IPA de USC sensibilizados frente a ingenuos. Pestaña 2 (ED Fig. 6d). Análisis de la vía IPA de USC sensibilizados frente a resueltos.

Pestaña 1 (ED Fig. 7a). DEG que comparan los USC juveniles ingenuos con los adultos ingenuos utilizados para el gráfico de volcanes.

Pestaña 1 (ED Fig. 8a-1). Comparación de DEG entre urotelios diferenciados ingenuos infectados con UTI89 frente a infectados de forma simulada, utilizados para el gráfico de volcanes. Pestaña 2 (ED Fig. 8a-2). Comparación de DEG entre urotelios diferenciados resueltos infectados con UTI89 frente a infectados de forma simulada, utilizados para el gráfico de volcanes. Pestaña 3 (ED Fig. 8a-3). Comparación de DEG entre urotelios diferenciados sensibilizados infectados con UTI89 frente a infectados de forma simulada, utilizados para el gráfico de volcanes. Pestaña 4 (ED Fig. 8b). Comparación de DEG entre la urotelia diferenciada sensibilizada frente a la resuelta infectada con UTI89, utilizada para el gráfico del volcán. Pestaña 5 (ED Fig. 8c). Análisis de la vía IPA de urotelia diferenciada sensibilizada frente a resuelta infectada con UTI89.

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Reimpresiones y permisos

Russell, SK, Harrison, JK, Olson, BS y col. La inmunidad entrenada epitelial inducida por la infección por Escherichia coli uropatógena afecta el resultado de la enfermedad del tracto urinario. Nat Microbiol 8, 875–888 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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Recibido: 23 de diciembre de 2022

Aceptado: 20 febrero 2023

Publicado: 10 abril 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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