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Oct 22, 2023

Efectos diferenciales del microbioma periodontal sobre la inducción del factor reumatoide durante la patogénesis de la artritis reumatoide

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19636 (2022) Citar este artículo

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La asociación entre la exposición a bacterias periodontales y el desarrollo de autoanticuerpos relacionados con la artritis reumatoide (AR) ha sido ampliamente aceptada; sin embargo, la relación causal directa entre las bacterias periodontales y el factor reumatoide (FR) actualmente no se comprende por completo. Investigamos si las bacterias periodontales podrían afectar el estado de RF. Los pacientes con AR preclínica, de inicio reciente o crónica se sometieron a un examen periodontal y a una investigación del microbioma subgingival a través de la secuenciación del ARNr 16S. Se examinó el grado de artritis y la inducción de RF en ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) que fueron inoculados por vía oral con diferentes especies de bacterias periodontales. Posteriormente, se realizó un análisis de secuenciación de ARN de una sola célula de las células de bazo de ratón. Los pacientes con AR preclínica mostraron una mayor abundancia de la familia Porphyromonadacae en el microbioma subgingival en comparación con aquellos con AR crónica o de inicio reciente, a pesar de que la severidad de la periodontitis era comparable entre ellos. En particular, se encontró una comunidad microbiana subgingival distinta entre los pacientes con RF positivo alto y aquellos con RF positivo bajo o negativo (p = 0,022). Las infecciones orales con los patógenos periodontales P. gingivalis y Treponema denticola en ratones CIA mejoraron de manera similar la puntuación de artritis, pero dieron como resultado diferentes niveles de inducción de RF. Los genes relacionados con la señalización del receptor de células B, la proliferación, activación y diferenciación de células B, y la coestimulación de células T CD4+ y la producción de citoquinas estuvieron involucrados en la inducción diferencial de RF en ratones expuestos a diferentes bacterias. En resumen, el microbioma periodontal podría dar forma al estado de RF al afectar la respuesta inmune humoral durante la patogénesis de la AR.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune compleja, que resulta de las interacciones entre los antecedentes genéticos de los pacientes y los desencadenantes ambientales. La periodontitis se considera un desencadenante ambiental de la AR, y P. gingivalis, un importante patógeno periodontal, puede impulsar respuestas autoinmunes y el desarrollo de artritis1. La infección oral por P. gingivalis indujo periodontitis y artritis autoinmune en modelos animales de experimentación2,3. Las ratas Lewis expuestas a P. gingivalis, no las expuestas al gel de control, desarrollaron inflamación y destrucción articular2. Un estudio previo de nuestro grupo encontró que los ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) infectados con P. gingivalis mostraron una artritis más severa que los ratones con CIA no infectados, combinada con una mayor citrulinación de proteínas en las articulaciones3. Nuestro grupo también encontró en un estudio posterior que la interrupción de la infección oral por P. gingivalis mediante anticuerpos anti-fimbriae recuperó el aumento de la artritis autoinmune por infección por P. gingivalis4. Estos resultados indican que la periodontitis y P. gingivalis tienen papeles importantes en la patogenia de la AR.

La periodontitis es prevalente en pacientes con AR establecida; sin embargo, ya está presente en pacientes con AR temprana o preclínica, mostrando una patogenia más frecuente y más avanzada que los controles5,6,7,8. Scher y sus colegas encontraron que la microbiota subgingival de los pacientes con AR temprana es distinta de la de los controles, aunque las desviaciones de la microbiota dependían de la presencia y la gravedad de la periodontitis9. Por el contrario, se encontró una microbiota subgingival distinta en pacientes periodontalmente sanos con AR en comparación con los controles, lo que indica que los cambios son específicos de la AR10. Un estudio reciente demostró la alteración de la microbiota subgingival con una mayor abundancia de P. gingivalis en sitios periodontalmente sanos y enfermos de individuos con anticuerpos anti-proteína citrulinada (ACPA) positivos en riesgo de AR11. Tomados en conjunto, estos sugieren que los cambios en la microbiota periodontal preceden al inicio de la AR, independientemente de la gravedad de la periodontitis.

Los autoanticuerpos relacionados con la AR, como el factor reumatoideo (FR) y el ACPA, aparecen en el organismo antes de la aparición de la AR12,13,14. Se ha informado que los títulos de RF y ACPA aumentan notablemente durante la fase preclínica13,14. Además, los anticuerpos séricos contra P. gingivalis aumentaron durante la fase preclínica de la artritis y se estabilizaron después del diagnóstico de AR15. Por lo tanto, se puede sugerir una asociación entre la exposición a las bacterias periodontales y el desarrollo de autoanticuerpos de la AR. Sin embargo, en comparación con mecanismos bien estudiados, como en el caso de la asociación entre patógenos periodontales y ACPA1,10,16,17, el papel de los patógenos periodontales en el estado de FR no se comprende completamente en la AR. Algunos estudios han demostrado una relación positiva entre las bacterias periodontales y la RF, mientras que otros no18,19. Estos resultados contradictorios pueden deberse a las limitaciones de estos estudios, ya sea por investigar solo pequeñas muestras de bacterias o por no utilizar técnicas de secuenciación de alto rendimiento para medir la carga bacteriana.

En este estudio, investigamos el microbioma subgingival en grupos de pacientes con AR preclínica (pre-AR), AR de inicio reciente (NORA) y AR crónica según la secuenciación metagenómica (junto con su estado de periodontitis). Luego comparamos el microbioma subgingival según cada estado de RF para explorar la asociación entre las bacterias periodontales y RF. Además, se realizaron experimentos con modelos murinos y análisis de secuenciación de ARN de una sola célula para confirmar el posible vínculo causal entre la infección bacteriana periodontal y la inducción de RF.

El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital St. Mary de Seúl, Universidad Católica de Corea (Número de aprobación: KC15RISI0612) y toda la investigación se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes. Los sujetos del estudio se inscribieron en el Centro de Reumatología del Hospital St. Mary's de Seúl. Los pacientes con AR previa, NORA y AR crónica se inscribieron de forma consecutiva después de obtener el consentimiento informado por escrito de cada uno de los sujetos. Se definió pre-AR si los sujetos tenían RF y/o ACPA positivos, pero el examen físico y la ecografía musculoesquelética no mostraron evidencia de sinovitis definitiva. Los pacientes con NORA y AR crónica eran aquellos que cumplían los criterios de clasificación de AR del American College of Rheumatology y la European League Against Rheumatism en el momento del diagnóstico20: los pacientes con NORA tenían una duración de la enfermedad de menos de 6 meses, mientras que los pacientes con AR crónica tenían la condición por más de 6 meses. Los criterios de exclusión incluyeron el uso de antibióticos dentro de los 3 meses, así como cualquier condición médica que requiriera el uso de antibióticos. Se realizó análisis de microbioma en los pacientes que aceptaron la toma de muestra de placa subgingival. Las características de la población de estudio que se sometió al examen periodontal y al análisis del microbioma subgingival se describen en las tablas complementarias S1 y S2, respectivamente.

La profundidad de sondaje periodontal (PPD) se midió en los participantes de este estudio insertando la sonda periodontal en el espacio entre la superficie del diente y la encía. La distancia desde el margen gingival libre hasta la base del surco gingival se definió como PPD. Se recolectaron muestras de placa subgingival de los sitios interproximales más profundos utilizando una cureta periodontal. Las muestras se colocaron en un microtubo y se congelaron y almacenaron a –80 ℃ hasta su posterior análisis.

El ADN genómico bacteriano se extrajo de muestras de placa. La secuenciación apuntó a la región V3-V4 del gen 16S rRNA del ADN extraído. El gen 16S se amplificó utilizando el cebador directo 341F (5′-TCGTCGGCAGCGTC-AGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; la secuencia subrayada indica el cebador de la región objetivo) y el cebador inverso 805R (5′-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′). Luego, la amplificación secundaria para adjuntar el código de barras de Illumina NexTera se realizó con un cebador directo i5 (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTC-3'; X indica la región del código de barras) y un cebador inverso i7 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX-GTCTCGTGGGCTCGG- 3'). El producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se confirmó y visualizó utilizando un sistema Gel Doc (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) en una electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Los productos amplificados se purificaron mediante CleanPCR (CleanNA, Waddinxveen, Países Bajos). Se agruparon concentraciones iguales de productos purificados y los fragmentos cortos (productos no objetivo) se eliminaron con CleanPCR (CleanNA). La calidad y el tamaño del producto se evaluaron en un Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.) usando un chip DNA 7500. Se agruparon los amplicones mixtos y la secuenciación se llevó a cabo en ChunLab, Inc. (Seúl, Corea), utilizando el método de extremo emparejado (250 pb x2) con un sistema de secuenciación Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) según a las instrucciones del fabricante.

El procesamiento de secuencias del gen 16S rRNA sin procesar comienza con la filtración de las secuencias de baja calidad utilizando Trimmomatic 0.32. Después del filtrado de calidad, se fusionaron dos secuencias que representaban cada extremo del mismo amplicón de PCR utilizando PANDAseq. Los cebadores se recortaron utilizando el programa interno de ChunLab. Las secuencias se eliminaron con DUDE-Seq y las secuencias idénticas se desreplicaron en este paso para reducir el tiempo computacional. A continuación, las secuencias sin ruido y desreplicadas se sometieron a asignación taxonómica. Usamos el programa USEARCH (8.1.1861_i86linux32) para buscar y calcular similitudes de secuencia de las lecturas de secuenciación de próxima generación (NGS) de la consulta en la base de datos EzBioCloud 16S. Se utilizó una similitud de 16S del 97 % como límite para la identificación a nivel de especie. Las lecturas restantes se verificaron en busca de quimeras utilizando el programa UCHIME y la base de datos de ARNr 16S no quimérico de EzBioCloud. Luego, los datos de la secuencia se agruparon utilizando CD-HIT y UCLUST.

Se compraron ratones machos DBA/1J de 5 semanas de edad de OrientBio (Seongnam, Corea). Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en la Universidad Católica de Corea. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la Ley de Bienestar de Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y las Directrices y Políticas para Experimentos con Roedores proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Católica de Corea (Aprobación número: 2020-0011-01).

Para inducir la artritis autoinmune, se inmunizaron ratones DBA/1J con colágeno tipo II (Chondrex, Redmond, WA, EE. UU.) emulsionado en adyuvante completo de Freund (Chondrex). Veintiún días después de la primera inmunización, se inyectó por vía intradérmica a los ratones un refuerzo de colágeno de tipo II (Chondrex), emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (Chondrex). El desarrollo de artritis se evaluó dos o tres veces por semana. La puntuación de artritis de cada pata se calificó entre 0 y 4 según el grado de inflamación: 0 = sin evidencia de eritema e hinchazón; 1 = hinchazón leve limitada a los tarsos o la articulación del tobillo; 2 = hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta los tarsianos; 3 = hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsianas; 4 = tumefacción grave que abarca el tobillo, el pie y los dedos, o anquilosis de la extremidad21. La puntuación de artritis total fue la suma de cada puntuación de artritis de las cuatro patas.

La cepa de Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection (ATCC) 33277 y la cepa de T. denticola ATCC 35405 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). Las bacterias se cultivaron en un ambiente anaeróbico de 37 ℃ (BD GasPak TM 150 System; BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

Los ratones se inocularon con 1 × 109 unidades formadoras de colonias de P. gingivalis o T. denticola suspendidas en 30 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2% de carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) o, para el control, 30 μL de PBS con 2% de carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich) sola3. Luego, los geles que contenían bacterias o los geles de control se inocularon directamente en la cavidad oral de los ratones 3 veces por semana durante 3 semanas, comenzando 14 días antes de la primera inmunización. Esto se hizo durante el establecimiento del modelo CIA. Nuestro grupo confirmó previamente la inducción de periodontitis después de la inoculación oral con bacterias periodontales en el mismo entorno4.

Las concentraciones de factor reumatoide (RF) y anticuerpos anti-proteína citrulinada (ACPA) se midieron en los sueros de ratones utilizando un kit ELISA RF-IgM de ratón (MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.) y un kit ELISA ACPA de ratón (MyBioSource) , respectivamente.

Se sacrificaron ratones para obtener esplenocitos. Se recogieron bazos de ratón y se aislaron los esplenocitos filtrando el bazo machacado a través de un colador de células de 40 µm en medio RPMI enfriado con hielo. Los glóbulos rojos se lisaron mediante la adición de tampón de lisis Gibco™ ACK durante 10 minutos. Las células restantes se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. Los esplenocitos se lavaron una vez más y se resuspendieron a una concentración de 1 × 107 células/mL para realizar un análisis unicelular.

Siguiendo las recomendaciones del fabricante, la captura de células individuales y la síntesis de ADNc se realizaron utilizando el sistema de análisis de células individuales DB Rhapsody. Las bibliotecas se ejecutaron varias veces en un Illumina Next-Seq para la secuenciación. Utilizamos R para realizar un agrupamiento no supervisado de células con los datos del paquete Seurat de secuenciación SC versión 3.2.322. Se filtraron los genes con expresión en menos de tres células. Procesamos células con > 200 o < 2500 genes expresados, < 25 % de genes mitocondriales y < 20 000 de UMI por célula23. Luego, se calculó el coeficiente de variación de los genes mediante la aritmética de Seurat. Identificamos 2000 genes altamente variables de cada muestra utilizando el método 'vst' en Seurat, lo que nos permitió alinear las células que se originaron en diferentes muestras. Para la reducción de la dimensionalidad de todos los datos, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en los primeros 2000 genes alterables más altos. Se construyó un gráfico de k-vecino más cercano utilizando distancias euclidianas en el espacio de los primeros 10 componentes principales significativos. Las celdas se agruparon en una imagen utilizando el algoritmo de optimización de modularidad de Louvain. Luego, los resultados finales de la agrupación no supervisada se visualizaron a través del análisis de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (tSNE).

Seleccionamos genes regulados al alza y a la baja en cada grupo. Estos estaban en relación con los otros grupos sobre la base de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon en la implementación de Seurat, con un cambio de > 0,25 logaritmo en comparación con los otros grupos y p < 0,05 (eTabla 1 en el apéndice). Los genes altamente expresados ​​diferencialmente (DEG) en cada grupo se calcularon para que pudieran anotarse manualmente con sus respectivas identidades celulares. Las identidades se confirmaron mediante scCATCH para la anotación automatizada basada en referencias24.

El agrupamiento de K-means se realizó en conteos de lectura estabilizados por varianza para construir un mapa de calor (conjunto de genes seleccionado con genes variables) en R. La opción de K-mean y la distancia de agrupamiento euclidiana de la fila y la columna se aplicaron juntas junto con la función pheatmap . Anotamos los genes asignados de los grupos resultantes usando análisis de ontología de genes usando el sistema de clasificación PANTHER (Análisis de proteínas a través de relaciones evolutivas) (http://geneontology.org)25.

La PPD y la abundancia relativa taxonómica se compararon entre diferentes grupos de pacientes mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon o la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron análisis de coordenadas principales (PCoA) de distancias UniFrac y la prueba PERMANOVA para comparar la comunidad microbiana en cada grupo (diversidad beta). Los taxones diferencialmente presentes se seleccionaron utilizando el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe). Las puntuaciones de artritis y los niveles de RF y ACPA en los grupos de ratones CIA se compararon utilizando la prueba t no pareada. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y el software basado en la web EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net).

Se realizaron mediciones de PPD en 18 pacientes con pre-AR, 18 pacientes con NORA y 49 pacientes con AR crónica. La PPD no difirió entre pacientes con AR pre-AR, NORA y AR crónica (mediana 5,5, 6 y 6 mm, respectivamente; p = 0,525, prueba de Kruskal-Wallis, Fig. 1A), mostrando todos ellos un grado similar. de periodontitis A continuación, examinamos la prevalencia de la periodontitis en pacientes con pre-AR en comparación con la de los controles. Los sujetos de control que no tenían AR se emparejaron por edad, sexo e índice de masa corporal; también se emparejaron según la presencia de diabetes o hipertensión y el tabaquismo. Estos datos se extrajeron de la base de datos de la Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición de Corea. En comparación con los 72 sujetos de control emparejados, los pacientes con pre-AR tenían más probabilidades de tener periodontitis: el 44,4 % y el 50 % de los pacientes con pre-AR tenían un PPD de 4–5 mm y un PPD de ≥6 mm, respectivamente. mientras que el 19,4% y el 4,2% de los sujetos de control tenían un PPD de 4–5 mm y un PPD de ≥6 mm, respectivamente (p <0,001, prueba exacta de Fisher, Fig. S1 complementaria). En resumen, los pacientes con pre-AR tenían periodontitis con mayor frecuencia que los controles; además, el grado de periodontitis en pacientes con pre-AR fue similar al de pacientes con AR establecida.

Periodontitis y el microbioma subgingival en pacientes con artritis reumatoide preclínica (pre-RA), AR de inicio reciente (NORA) y AR crónica. (A) Comparación de la profundidad de sondaje periodontal (PPD) entre pacientes con AR pre-AR, NORA y AR crónica (ns: no significativo, prueba de Kruskal-Wallis). (B) La diversidad beta del microbioma subgingival entre diferentes estados de AR se representa mediante un gráfico de análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizando la matriz de distancia UniFrac (p = 0,388, PERMANOVA). (C) Comparación de la composición microbiana subgingival a nivel de filo entre pacientes con AR pre-AR, NORA y AR crónica (prueba de Kruskal-Wallis). (D) El análisis del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) identifica taxones diferencialmente abundantes entre pacientes con pre-RA, NORA y AR crónica. Las barras rojas y una barra azul indican taxones abundantes en grupos de AR pre-AR y AR crónica, respectivamente.

El microbioma subgingival se investigó en cinco pacientes con pre-AR, dos pacientes con NORA y tres pacientes con AR crónica. Como se ve en la Tabla complementaria S2, todos eran no fumadores y tenían una alta positividad de ACPA; sin embargo, tenían grados variables de títulos de RF. Las comunidades microbianas subgingivales no difirieron significativamente entre los grupos de AR en PCoA de distancias UniFrac (p = 0.388, PERMANOVA, Fig. 1B). La abundancia relativa de taxones a nivel de filo no fue significativamente diferente entre los grupos de RA (todos p> 0.1, prueba de Kruskal-Wallis, Fig. 1C). Al incluir todos los niveles taxonómicos, se identificaron taxones diferencialmente abundantes entre pacientes con AR pre-AR, NORA y AR crónica mediante el análisis LEfSe (Fig. 1D). La familia de bacterias Porphyromonadaceae, así como la especie Saccharimonas, se enriquecieron en pacientes con pre-AR, mientras que Streptococcus anginosus solo se enriqueció en pacientes con AR crónica.

Los pacientes con AR previa, NORA y AR crónica se dividieron en dos grupos en función de sus títulos de RF: un grupo de RF negativo o bajo y un grupo de RF alto. A pesar de que la severidad de la periodontitis y el PPD no difieren entre los pacientes con RF negativa o baja y aquellos con RF alta (Fig. 2A), la composición microbiana subgingival fue significativamente diferente entre estos grupos. PCoA de distancias UniFrac reveló la agrupación de comunidades microbianas según el estado de RF (p = 0,022, PERMANOVA, Fig. 2B). La comparación de la abundancia relativa taxonómica a nivel de filo mostró que Fusobacteria, Saccharibacteria (anteriormente TM7) y Spirochaetes eran significativamente abundantes en pacientes con RF alto en comparación con aquellos en pacientes con RF negativo o bajo (p = 0.047, p = 0.028 y p = 0,009, respectivamente, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, Fig. 2C). Los análisis LEfSe en todos los niveles taxonómicos mostraron 43 taxones diferencialmente abundantes entre pacientes con RF negativa o baja y pacientes con RF alta (Fig. 2D). Específicamente, phyla Fusobacteria, Saccharibacteria y Spirochaetes, familias Saccharimonas, Porphyromonadaceae y Spirochaetaceae se enriquecieron en el grupo de alta RF.

Periodontitis y microbioma subgingival según el estado del factor reumatoideo (FR). (A) Comparación de PPD entre pacientes con FR bajo o negativo y pacientes con FR alto (ns: no significativo, prueba de suma de rangos de Wilcoxon). (B) La diversidad beta del microbioma subgingival entre diferentes estados de RF se representa mediante un gráfico de PCoA utilizando la matriz de distancia UniFrac (p = 0,022, PERMANOVA). Los datos procedían de los mismos 10 pacientes que se sometieron a análisis de microbioma subgingival. (C) Comparación de la composición microbiana subgingival a nivel de filo entre pacientes con RF negativa o baja y pacientes con RF alta (*p <0,05, **p <0,01, prueba de suma de rangos de Wilcoxon). (D) El análisis LEfSe identifica taxones diferencialmente abundantes entre pacientes con RF negativa o baja (barras rojas) y pacientes con RF alta (barras verdes).

Para examinar si diferentes bacterias periodontales podían inducir diferentes niveles de RF, se inocularon por vía oral ratones DBA/1J con diferentes bacterias durante el establecimiento del modelo CIA. El programa esquemático de la inoculación bacteriana oral se ilustra en la Fig. 3A. Se desarrolló artritis en grupos de ratones CIA inoculados con geles de control y grupos inoculados con geles que contenían P. gingivalis o T. denticola (Fig. 3B). Cincuenta y cinco días después de la primera inmunización, la puntuación de la artritis fue mayor en los ratones CIA inoculados con P. gingivalis y T. denticola que en los ratones de control, lo que demuestra que se desarrolló una artritis más grave en los ratones CIA inoculados con bacterias periodontales. Aunque la gravedad de la artritis no pareció ser significativamente diferente entre los ratones inoculados con P. gingivalis y T. denticola, los títulos de RF fueron significativamente más altos en los ratones inoculados con P. gingivalis que en los inoculados con T. denticola (p = 0,008). , prueba t no pareada). Los títulos de ACPA no difirieron significativamente entre los ratones inoculados con P. gingivalis y T. denticola. Esto indica diferentes grados de inducción de RF según la especie de bacteria periodontal (Fig. 3C,D).

Diferentes grados de inducción de RF en modelos de ratón con artritis inducida por colágeno (CIA) inoculados con diferentes especies de bacterias periodontales. (A) Ilustración esquemática del desarrollo del modelo CIA e inoculación oral con o sin bacterias periodontales, Porphyromonas gingivalis y T. denticola. (B) Cambios en la puntuación de artritis de ratones de control normales (n = 5), ratones CIA inoculados con geles de control (n = 10), ratones CIA inoculados con geles que contienen P. gingivalis (n = 10) y ratones CIA inoculados con geles de control. Geles que contienen T. denticola (n = 10) desde la primera inmunización con colágeno tipo II. (C) Niveles de RF IgM en diferentes grupos de ratones 55 días después de la primera inmunización (n = 3 en cada grupo). (D) Niveles de anticuerpos anti-proteína citrulinada (ACPA) en diferentes grupos de ratones 55 días después de la primera inmunización (n = 3 en cada grupo). Los datos son representativos de dos experimentos independientes. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 mediante prueba t no pareada. NC, control normal; PG, P. gingivalis; TD, T. denticola.

Realizamos la secuenciación de ARN de una sola célula de esplenocitos de ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola para comprender las diferencias transcriptómicas a nivel de una sola célula (Fig. 4A). Se obtuvieron tres bazos de ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola para el análisis, respectivamente. En total, se analizaron 962 y 851 esplenocitos después de la filtración, respectivamente. Primero, mapeamos un atlas unicelular y definimos la población celular de esplenocitos. Se presentaron atlas de células individuales de ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola, y las células se agruparon en nueve compartimentos (Fig. 4B). Se identificaron poblaciones celulares como neutrófilos, macrófagos, células B, células T y células dendríticas en ambos grupos (Fig. 4C). El patrón y la frecuencia de las poblaciones celulares fueron comparables entre los ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola (p = 0,783; prueba de chi-cuadrado). A continuación, se analizó la expresión génica de los esplenocitos a nivel de una sola célula. Se determinaron los 10 genes más significativos para cada tipo de célula y se examinaron sus niveles de expresión en todos los tipos de células (Fig. 4D). Los genes representativos de cada tipo de célula se regularon diferencialmente en un tipo de célula específico, pero no en otros, lo que indica su papel en la distinción de cada tipo de célula de otro. Este patrón se observó en ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola. Luego determinamos los niveles de expresión de los genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) a través del agrupamiento de K-means (Fig. 4E). En particular, se encontraron grupos de genes diferenciales en las células B y T de ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola. Los grupos de genes diferenciales de células B estaban regidos por genes que estaban relacionados con la vía de señalización del receptor de células B y la proliferación, activación y diferenciación de células B (Grupos 9 y 29). Los grupos de genes diferenciales de células T estaban regidos por genes asociados con la coestimulación de células T CD4+ y la producción de citoquinas Th1 (Grupos 8, 16, 17 y 30). Los resultados detallados del análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) se proporcionan en el apéndice. La expresión génica diferencial en células B y T de ratones inoculados con diferentes especies de bacterias periodontales podría explicar sus diferentes grados de inducción de RF.

Identificación de poblaciones celulares y patrones diferenciales de expresión génica en ratones CIA inoculados con diferentes especies de bacterias periodontales. (A) Ilustración esquemática de experimentos de transcriptoma de una sola célula, desde la recolección de esplenocitos hasta la visualización. (B) Gráficos de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (tSNE) de celdas individuales coloreadas por los principales linajes de celdas (panel izquierdo) y por el tipo de ratón, CIA-PG o CIA-TD (panel derecho). (C) Identificación y proporción de cada tipo de célula en los modelos CIA-PG y CIA-TD visualizados por tSNE y diagramas de barras. (D) Mapa de calor de los niveles de expresión génica de los 10 genes más significativos por grupos de tipos de células. (E) Mapa de calor de K-means agrupamiento de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y posterior análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO). Los DEG se agruparon en 30 grupos (K = 30, el número óptimo basado en el modelo; panel izquierdo). Las categorías de GO más diferencialmente enriquecidas según el proceso biológico, el componente celular y la función molecular se muestran para grupos seleccionados en poblaciones de células B y T (panel derecho). CIA-PG, ratones CIA expuestos a P. gingivalis; CIA-TD, ratones CIA expuestos a T. denticola; BP, proceso biológico; CC, componente celular; MF, función molecular.

El microbioma subgingival de pacientes con pre-AR mostró una mayor abundancia de la familia Porphyromonadaceae en comparación con los pacientes con NORA o AR crónica, a pesar de una prevalencia y gravedad similares de periodontitis. En particular, la estructura de la comunidad microbiana subgingival dependía del estado de RF en lugar del estado de RA. La infección oral con diferentes patógenos periodontales, P. gingivalis o T. denticola, en un modelo murino de AR resultó en una inducción de artritis mejorada de manera similar pero con diferentes grados de inducción de RF. En un análisis de secuencia de ARN de una sola célula de células de bazo de ratón, los ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola mostraron patrones de expresión muy variables de genes específicos en células B y T CD4+. Esto indica que las bacterias periodontales afectan diferencialmente la respuesta inmune humoral para inducir FR durante la evolución de la AR.

Demostramos que la periodontitis y los cambios en el microbioma periodontal ya existían en individuos ACPA positivos con riesgo de AR; cuyo grado y patrón fueron similares a los de los pacientes con AR de nueva aparición o crónica. El cambio único en el microbioma de las personas positivas para ACPA con riesgo de AR fue el aumento de la abundancia de la familia Porphyromonadaceae, lo que coincidía con estudios previos que mostraban un aumento de P. gingivalis en personas con riesgo de AR11,26. En un estudio de cohortes que consistió en individuos con mayor riesgo de desarrollar AR, las concentraciones séricas de anticuerpos contra P. gingivalis fueron significativamente más altas en el grupo con autoanticuerpos positivos relacionados con la AR que en el grupo con autoanticuerpos negativos, aunque la presencia de periodontitis fue similar entre estos grupos26 . Sin embargo, las concentraciones de anticuerpos contra otras bacterias periodontales no difirieron entre los grupos positivos y negativos de autoanticuerpos, lo que indica que la inmunidad a P. gingivalis se asoció con la producción de autoanticuerpos relacionada con la AR en individuos con riesgo de AR. Un estudio reciente confirmó, a través de la secuenciación metagenómica, la disbiosis y la abundancia enriquecida de P. gingivalis en el microbioma subgingival de individuos positivos para ACPA en riesgo de RA11. En conjunto, nuestros resultados junto con la literatura indican que los cambios en el microbioma oral preceden al inicio de la AR y que P. gingivalis juega un papel importante en esta fase preclínica.

Luego investigamos el papel de los patógenos periodontales en el desarrollo de autoanticuerpos relacionados con la AR, centrándonos particularmente en el autoanticuerpo RF. RF es un marcador de diagnóstico de AR; sin embargo, también se encuentra en otras enfermedades autoinmunes e infecciosas. Un estudio previo identificó que RF estaba presente tanto en la placa subgingival como en muestras de suero de pacientes con periodontitis que no tenían artritis clínica, lo que sugiere la asociación entre la infección bacteriana y la inducción de RF27. Las bacterias que colonizan los sitios de la mucosa pueden ser un factor clave en la inducción de la activación de las células B y la producción de autoanticuerpos. Además, los niveles de inducción de autoanticuerpos diferían según el tipo de bacteria utilizada. Por ejemplo, la exposición oral con P. gingivalis indujo una artritis asociada a ACPA en ratas, mientras que la exposición oral con Prevotella intermedia no lo hizo2. Nuestro estudio agregó el hallazgo de que los ratones CIA expuestos a P. gingivalis indujeron mucho la RF en comparación con los ratones expuestos a T. denticola. Describimos los patrones de microbiota oral separados y distintos de los grupos de pacientes con RF alta y baja y también confirmamos el efecto causal de las bacterias periodontales en la inducción de RF en un modelo murino de AR. Por lo tanto, sugerimos que las bacterias periodontales pueden influir de manera diferencial en el estado de la RF durante la autoinmunidad de la AR.

RF es un autoanticuerpo que se dirige a determinantes antigénicos (epítopos) ubicados en la región Fc de la inmunoglobulina G (IgG). La RF es producida por linfocitos B positivos para RF (que expresan RF como un receptor de células B)28. En condiciones normales, las células B RF mantienen la tolerancia con los autoantígenos sin producir RF. Sin embargo, las células RF B pueden activarse en condiciones autoinmunes o durante infecciones microbianas. Los componentes microbianos, como los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) o el ADN, pueden mediar en la activación de las células B y la producción de RF mediante un mecanismo no específico. Por ejemplo, el LPS o el ADN bacteriano pueden estimular directamente la activación de las células B a través de la señalización del receptor tipo Toll (TLR)29. En un estudio anterior, se inyectó LPS en varias cepas de ratones para examinar su capacidad para inducir actividad RF30. RF se indujo en todas las cepas, excepto en ratones resistentes a LPS, y el aumento de RF fue paralelo a un aumento en otros anticuerpos IgM. Por lo tanto, el LPS se consideró un estimulante de la formación de anticuerpos policlonales por parte de las células B, induciendo así la producción de RF. Otro estudio reciente encontró una correlación positiva entre la proteína de unión a LPS y RF, lo que sugiere un papel importante de la exposición microbiana sistémica en el desarrollo de RF31.

Sin embargo, se requieren dos mecanismos específicos de antígeno adicionales para explicar la activación mejorada de células B y la inducción de RF después de la exposición microbiana, además de la activación de células B no específicas32. Primero, la sinergia entre los receptores de células B y los TLR. En segundo lugar, la ayuda de las células T. La interacción de los receptores de células B y los TLR en la superficie de las células B fue posible gracias a la formación y el entrecruzamiento de los complejos inmunitarios antígeno microbiano-IgG. Los complejos inmunes señalan tanto a los receptores de células B como a los TLR para activar las células B productoras de RF. La señalización del receptor de células B puede atrapar complejos inmunitarios y concentrar antígenos microbianos en la superficie de las células B, lo que mejora la señalización de TLR. La inhibición selectiva de la señalización del receptor de células B sin interferir con la señalización de TLR resultó en un bloqueo de la proliferación de células B RF inducida por complejos inmunes. A continuación, se requiere la ayuda de células T CD4+ específicas de antígeno microbiano para aumentar la producción de RF. Después de que los antígenos microbianos se internalicen y se procesen en péptidos antigénicos en células RF B y se presenten en la superficie de las células B, se activan las células T CD4+ específicas de antígeno. Luego, las células RF B reciben ayuda de las células T CD4+ a través de la señalización de CD40 o las citoquinas producidas por las células CD4 T+, diferenciándose así en células plasmáticas productoras de RF. En resumen, los antígenos microbianos, los receptores de células B, los TLR y las células T CD4+ cooperan para activar las células B productoras de RF después de una infección bacteriana, y tanto la señalización del receptor de células B como la ayuda de las células T CD4+ son fundamentales para mejorar la secreción de RF32. En nuestro estudio, las expresiones génicas diferenciales encontradas entre los ratones expuestos a P. gingivalis y T. denticola, que tenían diferentes niveles de RF, se relacionaron con las vías de señalización del receptor de células B, la proliferación, activación y diferenciación de células B, la coestimulación de células T CD4+ y producción de citoquinas Th1. Nuestros resultados, junto con el estudio mencionado anteriormente, respaldan que la inducción de diferentes RF por diferentes bacterias periodontales podría depender de si pueden afectar las vías de señalización del receptor de células B, la proliferación, activación y diferenciación de células B, y la coestimulación de células T CD4+ y la producción de citoquinas.

Rifkin y sus colegas demostraron que los sueros de ratones autoinmunes, pero no los de ratones no autoinmunes, inducían la activación de células B productoras de RF in vitro33. Los factores estimulantes fueron los complejos inmunes IgG2a que estaban presentes en los sueros de ratones autoinmunes. Sin embargo, no todos los complejos inmunes activan las células B productoras de RF; un estudio posterior mostró que los inmunocomplejos IgG2a que contenían antígenos del nucleosoma activaron eficientemente las células B productoras de RF mediante la participación de los receptores de células B y los TLR, pero los inmunocomplejos IgG2a que contenían otros antígenos fallaron34. Estos hallazgos indican que la activación de las células B que expresan RF depende del tipo de antígenos presentes en los complejos inmunes.

Este estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, solo se incluyó un número relativamente pequeño de pacientes en los análisis de secuenciación del microbioma subgingival. Por lo tanto, nuestros resultados deben validarse en estudios adicionales dentro de una población de estudio más grande. Sin embargo, realizamos experimentos con modelos murinos y análisis de secuenciación de ARN de una sola célula para respaldar nuestros hallazgos en los análisis de secuenciación de microbiomas. En segundo lugar, no incluimos un grupo de control sano en este estudio. Sin embargo, las distintas composiciones microbianas subgingivales en pacientes con AR e individuos en riesgo en comparación con controles sanos se han confirmado en estudios previos9,10,11. En cambio, nuestro objetivo fue comparar las composiciones microbianas subgingivales entre pacientes con AR según su estado de RF o AR.

Revelamos el panorama diferencial del microbioma subgingival entre los diferentes estados de RF en pacientes con AR e individuos con riesgo de AR. La infección oral con diferentes especies de bacterias periodontales causó diferentes niveles de RF durante el desarrollo de la artritis en un modelo de ratón con AR. Sugerimos que las bacterias periodontales afectan el estado de RF por su participación diferencial en la señalización del receptor de células B, la proliferación, activación y diferenciación de células B, y la coestimulación de células T CD4+ y la producción de citoquinas.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio BioProject del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA765928 (conjuntos de datos de secuenciación de metagenoma) y https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA820883 (conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula).

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Este estudio fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el gobierno coreano (Ministerio de Ciencia y TIC) (No. 2019R1A2027588 y 2020R1A2C3004123 para JHJ ​​y No. 2019R1G1A1100421 para JWK). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

División de Reumatología, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad Católica de Daegu, Daegu, República de Corea

Ji Won Kim

División de Reumatología, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Hospital St. Mary de Seúl, Universidad Católica de Corea, 222 Banpo-daero, Seocho-gu, Seúl, 06591, República de Corea

Hyerin Jung, Yoojun Nam, Jaewoo Kang, Jennifer Lee, Seung-Ki Kwok, Wan-Uk Kim, Sung-Hwan Park & ​​Ji Hyeon Ju

YiPSCELL Inc., Seúl, República de Corea

In-Pyo Baek

División de Reumatología, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad Femenina Ewha, Seúl, República de Corea

Min Kyung Chung

Departamento de Periodoncia, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, República de Corea

Parque Jun Beom

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Conceptualización: JWK y JHJ; Curación de datos: JWK, HJ, IPB y JHJ; Análisis formal: JWK, HJ e IPB; Adquisición de fondos: JWK y JHJ; Investigación: JWK, HJ, IPB, YN, JK y JHJ; Recursos: JBP y JHJ; Supervisión: MKC, JL, SKK, WUK y SHP; Visualización: JWK, HJ e IPB; Redacción: preparación del borrador original: JWK, HJ, IPB y JHJ; Redacción: revisión y edición: JWK, HJ, IPB, YN, MKC, JBP, JL, SKK, WUK, SHP y JHJ

Correspondencia a Ji Hyeon Ju.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kim, JW., Jung, H., Baek, IP. et al. Efectos diferenciales del microbioma periodontal sobre la inducción del factor reumatoide durante la patogénesis de la artritis reumatoide. Informe científico 12, 19636 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21788-y

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Recibido: 20 de marzo de 2022

Aceptado: 04 de octubre de 2022

Publicado: 16 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21788-y

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