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Oct 22, 2023

La secuencia de ADN y los modificadores de cromatina cooperan para conferir biestabilidad epigenética en las regiones de control de impresión

Genética de la naturaleza volumen 54,

Nature Genetics volumen 54, páginas 1702–1710 (2022)Citar este artículo

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La impronta genómica está regulada por la metilación del ADN específico de los padres de las regiones de control de impronta (ICR). A pesar de una secuencia de ADN idéntica, los ICR pueden existir en dos estados epigenéticos distintos que se memorizan a lo largo de divisiones celulares ilimitadas y se restablecen durante la formación de la línea germinal. Aquí, estudiamos sistemáticamente los determinantes genéticos y epigenéticos de esta biestabilidad epigenética. Mediante la integración iterativa de ICR y secuencias de ADN relacionadas en una ubicación ectópica en el genoma del ratón, primero identificamos las características de la secuencia de ADN requeridas para el mantenimiento de los estados epigenéticos en las células madre embrionarias. Las propiedades reguladoras autónomas de los ICR nos permitieron además crear indicadores sensibles a la metilación del ADN y detectar componentes clave implicados en la regulación de su memoria epigenética. Además de DNMT1, UHRF1 y ZFP57, identificamos factores que evitan el cambio de estados metilados a no metilados y mostramos que dos de estos candidatos, ATF7IP y ZMYM2, son importantes para la estabilidad del ADN y la metilación de H3K9 en ICR en células madre embrionarias.

La regulación epigenética de la actividad génica depende de múltiples capas de modificaciones de la cromatina que se mantienen durante la replicación del ADN1,2. Por definición, estos mecanismos epigenéticos actúan independientemente de la secuencia de ADN en los sitios genómicos que ocupan. Sin embargo, varios estudios han destacado una contribución de la secuencia de ADN a la regulación y mantenimiento de las modificaciones de la cromatina, impidiendo una distinción clara entre el control epigenético y genético de la actividad génica3,4,5,6,7,8. La impronta genómica es un fenómeno epigenético, donde las marcas de metilación del ADN en los ICR maternos o paternos dictan la actividad específica de los padres de las transcripciones en cis9,10,11. Los ICR heredan marcas de metilación del ADN específicas de los padres del ovocito o del espermatozoide, que luego se propagan en todos los tejidos somáticos de la siguiente generación9. La herencia de estados epigenéticos diferenciales en los cromosomas parentales, a pesar de la secuencia de ADN idéntica, la ubicación cromosómica idéntica y la exposición a los mismos factores reguladores en el núcleo, hacen de los ICR un gran modelo para estudiar la contribución individual de la secuencia de ADN y las modificaciones de la cromatina a la memoria epigenética.

Se han identificado varios factores y mecanismos que regulan el mantenimiento de la metilación del ADN en las ICR. Una vez que se han depositado las marcas de metilación en la línea germinal12, la metiltransferasa de mantenimiento DNMT1 y su proteína accesoria UHRF1 son responsables del mantenimiento de la metilación durante la replicación del ADN13. Además, se han identificado varios factores para regular H3K9me3 en los ICR metilados con ADN, incluidos SETDB1, KAP1 y G9A14,15,16. En tono rimbombante. el factor de dedo de zinc KRAB ZFP57 se une a la secuencia de ADN de hexanucleótido metilado TGCmCGC y recluta KAP1 y otros factores asociados para establecer una retroalimentación entre la metilación del ADN y H3K9me3 en ICR16,17. De hecho, la unión de ZFP57 y el reclutamiento de KAP1 son pasos cruciales en la regulación de las improntas, ya que la desactivación (KO) de Zfp57 en ratones da como resultado la pérdida de casi todas las improntas y la letalidad embrionaria18,19,20, y ZFP57 es necesario para el mantenimiento de la metilación del ADN y H3K9me3 en ICR en sistemas celulares16,18,21.

Aunque los factores que controlan la metilación del ADN y las histonas en los ICR se han investigado ampliamente, las propiedades de la secuencia de ADN de los ICR no se han explorado en detalle. Además, tampoco se sabe si los jugadores clave adicionales contribuyen al mantenimiento epigenético en los ICR. Mediante la integración iterativa de secuencias de ADN de ICR en el mismo sitio genómico en células madre embrionarias de ratón (mESC), mostramos que las ICR son elementos genéticos autónomos que pueden recapitular los estados epigenéticos observados en las ubicaciones endógenas. Usando esta configuración, mostramos que al preestablecer la metilación del ADN, podemos establecer dos estados epigenéticos opuestos que se propagan fielmente por el ICR ectópico. Este cambio dependiente de la metilación del ADN es exclusivo de los ICR. Las integraciones sistemáticas de ICR variantes y sintéticas nos permitieron identificar los requisitos de secuencia que son necesarios y suficientes para este comportamiento similar al de un interruptor. Además, al utilizar los ICR ectópicos como indicadores sensibles a la metilación del ADN en las pantallas genéticas de pérdida de función, confirmamos que DNMT1, UHRF1 y ZFP57 son los reguladores epigenéticos centrales de la impresión genómica. Además, identificamos ATF7IP y ZMYM2 como factores involucrados en la regulación del mantenimiento de los estados epigenéticos en las ICR.

Presumimos que la secuencia de ADN de los ICR debería contener suficiente información para establecer y mantener los distintos estados epigenéticos observados en los alelos parentales (Datos extendidos Fig. 1a). Seleccionamos cuatro ICR de los grupos de impresión Airn, Kcnq1ot1, Zrsr1 y H19 y utilizamos el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE3) para integrarlos individualmente en el genoma de mESC (Fig. 1a). Para imitar los estados de metilación del ADN diferencial de los ICR, realizamos RMCE en paralelo para ICR no metilados e ICR que fueron premetilados por la metiltransferasa CpG bacteriana M.SssI (Fig. 1a y Datos extendidos Fig. 1b). Como secuencia de control, utilizamos Igf2r DMR (región diferencialmente metilada), un promotor que adquiere la metilación diferencial del ADN solo durante la diferenciación22. Además, incluimos un conjunto de promotores de genes inactivos (Hes3, Tcl1 y Syt1), que previamente se demostró que estaban protegidos de la metilación del ADN de novo cuando se integraron en el mismo sitio RMCE3 (Fig. 1b).

a, Resumen experimental de la generación de líneas celulares estables con plásmidos donantes metilados o no metilados utilizando RMCE. b, resumen tabular del análisis de metilación para todos los ICR integrados, control DMR y secuencias promotoras. La metilación endógena (Endog. meth.) describe el estado de metilación del locus endógeno en las mESC. Mat., metilación materna; Pat., metilación paterna; n/a, sin metilación. Se indican el tamaño, la densidad de CpG (en 100 pb) y el contenido de GC (%). Se muestran los porcentajes de metilación total de secuencias de ADN integradas a través de RMCE medidos por bsPCR para experimentos que utilizan plásmidos donantes no metilados (− M.SssI) y premetilados (+ M.SssI). n/d, no determinado. Los asteriscos indican mediciones obtenidas de Lienert et al.3. c, Análisis de metilación detallado para el Airn ICR ectópico. Las posiciones de CpG dentro de la secuencia Airn ICR se indican con líneas verticales negras. Se representan regiones amplificadas para bsPCR, y las mediciones de una sola molécula se muestran como círculos negros que corresponden a dinucleótidos CpG metilados y círculos blancos a dinucleótidos CpG no metilados. Las posiciones de CpG marcadas con 'x' corresponden a nucleótidos desalineados debido a errores de secuenciación. Los valores de metilación agregados se muestran como líneas verticales codificadas por colores en la posición CpG respectiva. d, mediciones de ChIP-qPCR en ICR ectópicos y endógenos en comparación con un sitio intergénico. H3K9me3, azul; H3K4me2, naranja. Los puntos de datos indican réplicas técnicas individuales.

Después de una integración exitosa, medimos la metilación del ADN en el sitio RMCE mediante PCR de conversión de bisulfito (bsPCR). Los cuatro ICR mantuvieron su estado de metilación del ADN preestablecido en el sitio ectópico, aunque en algunos casos se observó una metilación menor de novo en los ICR no metilados (Fig. 1b, c y Datos extendidos Fig. 1c-e). Por el contrario, no se observó el mantenimiento de la metilación del ADN preestablecida para Igf2r DMR y los elementos promotores de control (Fig. 1b y Extended Data Fig. 1f-i). Los estados diferenciales de metilación del ADN en el ICR ectópico de Airn se mantuvieron de manera estable después del cultivo prolongado de mESC durante más de 20 pases, o tras la integración en una posición diferente de RMCE en el genoma, y ​​también después de la diferenciación in vitro de mESC a progenitores neuronales (Datos extendidos). Figura 2a-c). Además, la metilación del ADN del ICR ectópico de Airn todavía se mantuvo en niveles altos después del cultivo de mESC en medio 2i durante 10 días, a pesar de la reducción global en 5-metilcitosina resultante de adquirir un estado de células madre vírgenes23,24,25,26 (Extended Datos Fig. 2a, d).

Además de la metilación del ADN, los ICR endógenos muestran además modificaciones diferenciales de histonas (Datos extendidos Fig. 1a), por lo que el ICR metilado está decorado por H3K9me3 y el ICR no metilado por H3K4me2 (refs. 14, 22, 27). Realizamos PCR cuantitativa (qPCR) de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para H3K9me3 y H3K4me2 y comparamos el enriquecimiento de estas marcas en las integraciones RMCE de los ICR Airn y Kcnq1ot1 con sus contrapartes endógenas (Fig. 1d). Los ICR no metilados en el sitio RMCE mostraron una falta de H3K9me3 y un aumento de H3K4me2, mientras que los ICR premetilados revelaron el patrón opuesto, con un aumento de H3K9me3 y ausencia de H3K4me2 (Fig. 1d). Estudios previos identificaron que la proteína ZFP57 de KRAB-Znf específica para la metilación del ADN es necesaria para el mantenimiento de la metilación del ADN y H3K9me3 en las ICR endógenas16,18,21. Esta regulación se recapitula en el ICR ectópico, ya que la eliminación CRISPR-Cas9 de Zfp57 en mESC da como resultado una pérdida rápida y completa de la metilación del ADN tanto en sitios ectópicos como endógenos (Datos extendidos Fig. 2e).

Nos propusimos probar si la secuencia de ADN ICR es necesaria para la memoria epigenética. Primero, nuestro objetivo era identificar si los fragmentos ICR más pequeños también memorizarían de manera eficiente los patrones de metilación del ADN preestablecidos y repetimos los mismos experimentos con cuatro fragmentos más pequeños del Airn ICR (Fig. 2a y Extended Data Fig. 2f). Ninguno de los fragmentos probados pudo recapitular fielmente el mantenimiento de la metilación diferencial. Lo mismo se observó para el H19 ICR paternalmente metilado (Datos extendidos Fig. 2g, h). Estudios previos centrados en regiones reguladoras no ICR (promotores, islas CpG o potenciadores) han revelado que la densidad de CpG, el contenido de GC y/o la secuencia de nucleótidos pueden influir en el establecimiento de patrones de metilación del ADN3,4,5,6. En función de su densidad de CpG y contenido de GC, los ICR probados aquí se encuentran en el rango de elementos genómicos que se superponen con promotores de islas CpG no metilados (Datos extendidos, Fig. 3a). Para investigar si la densidad de CpG y el contenido de GC de los ICR contribuyen al mantenimiento de los estados metilados y no metilados, seleccionamos cuatro regiones genómicas que son muy similares al ICR de Airn en tamaño, % de GC, número de CpG y distribución (Datos extendidos Fig. 3b–d). Estos elementos 'similares a Airn' no pudieron mantener la metilación diferencial y adoptaron un estado hipometilado como su contraparte endógena, lo que sugiere que la longitud de la secuencia de ADN, la densidad de CpG y el contenido de GC no son suficientes para establecer dos estados epigenéticos distintos (Datos extendidos Fig. 3e, F).

a, Resumen tabular del análisis de metilación para todos los fragmentos Airn-ICR indicados esquemáticamente a la izquierda. Además, se muestra la longitud del fragmento, las densidades de CpG y el contenido de GC para cada fragmento. Misma representación que en la Fig. 1b. b, Análisis de metilación para el Airn ICR barajado. Misma representación que en la Fig. 1c. Las posiciones de CpG marcadas con 'x' corresponden a nucleótidos desalineados debido a errores de secuenciación. c, mediciones de ChIP-qPCR en el Airn ICR barajado en el sitio ectópico en comparación con el Airn ICR endógeno. Los puntos de datos muestran réplicas técnicas individuales. H3K9me3, azul; H3K4me2, naranja. d, análisis de metilación para Airn ICR mezclado con sitios de unión ZFP57 reconstituidos. Misma representación que en el panel b. e, El análisis de metilación para el Airn ICR mezclado integrado en células de eritroleucemia murina (MEL) muestra el mantenimiento de la metilación del ADN.

Para distinguir aún más el requisito directo de la secuencia de ADN del contenido de CpG y GC, generamos un elemento de ADN sintético basado en la secuencia Airn ICR, donde permutamos las secuencias de ADN inter-CpG hasta que se alcanzó un 78% de desajuste (Datos extendidos Fig. 4a, b). Es importante destacar que la permutación de la secuencia original retuvo el contenido de GC local y el número y la posición de los CpG originales. Este reemplazo eliminó toda la información de la secuencia de ADN entre CpG, lo que nos permitió distinguir la contribución de la secuencia de ADN de la frecuencia y distribución de CpG. Repetimos los experimentos de RMCE con este Airn ICR 'mezclado' y observamos que no logró mantener el estado epigenético preestablecido (Fig. 2b). En ambos casos, la metilación del ADN alcanzó un valor intermedio del 40,3 % para la inserción no metilada y del 23,5 % para la premetilada, con patrones de metilación desordenados (fig. 2b). Las alteraciones de la secuencia condujeron además a un establecimiento reducido de H3K9me3 y H3K4me2 en el sitio RMCE, independientemente del estado de metilación preestablecido (Fig. 2c).

La mezcla de la secuencia de ADN inter-CpG en Airn ICR interrumpió todos los motivos de unión de ZFP57, lo que podría explicar la falta de mantenimiento observada, de acuerdo con una evaluación in silico de la unión de ZFP57 a la secuencia de Airn ICR de tipo salvaje y mezclada utilizando BPNet28 ( Datos extendidos Fig. 4c, d). En consecuencia, queríamos investigar si los motivos ZFP57 son suficientes para el mantenimiento del estado epigenético. Por lo tanto, restauramos los motivos de unión de ZFP57 en el ICR barajado (Datos extendidos Fig. 4e) e introdujimos este elemento de ADN metilado y no metilado en el sitio RMCE en mESC. Aunque la versión no metilada no logró mantener el estado hipometilado, el ICR premetilado pudo mantener un estado completamente hipermetilado (Fig. 2d). Dadas estas observaciones, nos preguntamos si el requisito de los sitios de unión de ZFP57 depende del contexto celular, especialmente porque la expresión del gen Zfp57 es específica de tejido18,29. Por lo tanto, introdujimos el Airn ICR barajado en células de eritroleucemia de ratón (MEL) competentes para RMCE30 y realizamos una secuenciación de bisulfito dirigida. Tanto los ICR barajados metilados como los no metilados conservaron los patrones de metilación del ADN preestablecidos (Fig. 2e), lo que indica que en las células MEL, el contenido de CpG es suficiente para la memoria de los estados de metilación del ADN.

Los ICR endógenos son elementos reguladores de cis que dictan la expresión alélica de transcritos cercanos en función de su estado de metilación del ADN9. Primero queríamos probar si las secuencias ICR pueden silenciar tres construcciones de indicadores diferentes en presencia de metilación del ADN cuando se integran juntas en el sitio RMCE (Fig. 3a y Datos extendidos Fig. 5a). Seleccionamos tres promotores constitutivos de uso común (pCAGGS, hEF1alpha y hPGK) y demostramos que pueden mantener la expresión de un reportero GFP en el sitio de integración RMCE en ausencia de ICR (datos extendidos Fig. 5b). A continuación, medimos la capacidad de tres ICR metilados (Airn, Kcnq1ot1 y Peg10) para reprimir de manera estable estos promotores en el mismo sitio de integración de RMCE (Fig. 3b). Todas las secuencias ICR probadas mostraron una represión estable en combinación con los promotores Ef1alpha y hPGK. Por el contrario, los promotores metilados sin ICR, o en combinación con el promotor Dazl, que se sabe que está regulado de manera dependiente de la metilación del ADN31, no pudieron mantener un estado reprimido (Fig. 3b). El promotor pCAGGS sintético dio resultados variables, según el ICR utilizado, lo que sugiere que la fuerza de este promotor compuesto puede superar la represión epigenética inducida por algunos ICR (Fig. 3b). La represión dependiente de la metilación del ADN se mantuvo durante períodos más largos, según lo medido por la actividad de GFP en múltiples poblaciones derivadas clonalmente después de 16, 23 y 30 días (Datos extendidos, Fig. 5c). Se observó la misma represión dependiente de ICR metilada para la ICR H19 metilada paternamente (Datos extendidos Fig. 5d).

a, Descripción general esquemática y experimental de la generación de líneas celulares informadoras utilizando RMCE. b, Análisis de citometría de flujo de la expresión de GFP 12 días después de la transfección con diferentes combinaciones de ICR/promotor premetilado. Cada punto de datos muestra el porcentaje de medición de células positivas para GFP de una población de células derivadas clonalmente. c, El análisis de citometría de flujo indica el porcentaje de células positivas para GFP en líneas celulares independientes que recuperan plásmidos donantes de RMCE metilados o no metilados que contienen Airn ICR de tipo salvaje mezclado o Airn ICR mezclado con sitios ZFP57 reconstituidos en combinación con el promotor pEF1a. La actividad de GFP se midió en dos puntos de tiempo consecutivos (16 y 23 días). d, análisis de citometría de flujo de tres clones independientes con el indicador Airn-CAG metilado después de 2 días de tratamiento con el inhibidor de metilación del ADN GSK-3484862 y controles sin tratar y DMSO. Las mediciones se repitieron 7 días después del lavado del fármaco para probar la reversión del silenciamiento del reportero. Misma representación que en el panel b.

Esta configuración nos permitió probar la contribución de la metilación y la secuencia del ADN en el potencial de silenciamiento de los ICR. Para esto, utilizamos la construcción del reportero Airn-pEF1a-GFP que mostró un mantenimiento estable de la expresión de GFP cuando se insertó un silenciamiento no metilado y estable cuando se insertó metilado (Fig. 3c). Cuando reemplazamos el Airn ICR con la versión aleatoria de Airn, observamos una pérdida de silenciamiento en la mayoría de los clones medidos después de 16 días e incluso más después de un cultivo prolongado, lo que sugiere que el silenciamiento dependiente de la metilación en cis requiere una secuencia ICR intacta (Fig. 3c). Finalmente, introdujimos la secuencia Airn mezclada que contenía sitios de unión ZFP57 reconstituidos. Aunque la versión no metilada condujo a una pérdida estocástica de la actividad transcripcional, la construcción metilada dio lugar a una represión estable del promotor cercano durante varias generaciones, lo que indica que la unión de ZFP57 no solo es necesaria para el mantenimiento de la memoria epigenética en las ICR, sino que también es suficiente para el silenciamiento epigenético. en cis (Fig. 3c).

Para probar si se requiere la metilación del ADN de los ICR para la represión del promotor cercano, desafiamos las líneas celulares informadoras establecidas cultivándolas en medios 2i y 2i + vitamina C. Ambas condiciones reducen los niveles de metilación del ADN en todo el genoma23,24,25, mientras que la adición de vitamina C da como resultado una mayor eliminación de la metilación del ADN de los ICR y los elementos repetitivos26,32. La represión de GFP se mantuvo en medio 2i; sin embargo, la represión se perdió progresivamente en presencia de 2i + vitamina C (Datos extendidos Fig. 5e-g). Para probar aún más la dependencia de la metilación del ADN para mantener el estado reprimido en los reporteros ICR, realizamos experimentos KO de los factores generales de mantenimiento de la metilación del ADN Uhrf1 y Dnmt1 (ref. 33). Como se esperaba, la eliminación de la metilación del ADN en estas células KO condujo a una reactivación del reportero ICR en 7 días (datos extendidos, Fig. 6a, b). El bajo porcentaje de células que muestran reactivación de GFP en estos ensayos se debe a la baja eficiencia de KO en el grupo de células objetivo de CRISPR. Por lo tanto, cultivamos el reportero Airn-ICR en presencia del inhibidor de DNMT1 GSK-3484862 (ref. 34) durante 2 días. Observamos una reactivación completa con más del 95% de las células que expresan GFP (Fig. 3d y Datos extendidos Fig. 6c). El uso de este inhibidor de DNMT1 nos permitió además probar si la reactivación es reversible; por lo tanto, eliminamos GSK-3484862 del medio y continuamos el cultivo durante 7 días más después del lavado (Fig. 3d y Datos extendidos Fig. 6c). No observamos resilenciamiento de los reporteros activados, lo que indica que una vez que se enciende el ICR, no puede volver a un estado silencioso.

Después de establecer múltiples líneas celulares informadoras específicas de ICR, queríamos detectar las proteínas necesarias para el mantenimiento de los estados represivos de ICR. Primero establecimos el flujo de trabajo de la pantalla CRISPR utilizando una biblioteca dirigida contra 1051 factores relacionados con la cromatina con 6204 ARN guía (biblioteca ChromMM) y una biblioteca de control con 500 guías no dirigidas en la línea celular reportera pCAGGS-Airn (Fig. 4a y datos extendidos). Fig. 7a), y determinamos el punto de tiempo para recolectar clones positivos (Datos extendidos Fig. 7b). Realizamos la pantalla en tres líneas reporteras ICR metiladas (Airn, Kcnq1ot1 y Peg10) y recolectamos células positivas para GFP después de 8 días y repetimos la pantalla para Airn, Kcnq1ot1 en condiciones medias 2i sensibilizadas (Datos extendidos Fig. 7c, d).

a, Resumen experimental de pantallas CRISPR dirigidas utilizando múltiples reporteros ICR premetilados. La estrategia de activación se describe en Datos extendidos Fig. 7a y Métodos. b, Resultados generales de las pantallas CRISPR en tres líneas celulares informadoras ICR cultivadas en condiciones de suero. Los puntos azules indican genes con un valor de P < 0,01 calculado mediante MAGeCK RRA (agregación de rango robusto). Las líneas discontinuas indican el umbral del valor P en 0,05. c, Mapa de calor que muestra candidatos potenciales de todas las pantallas CRISPR. El color indica el cambio de pliegue de registro resumido en todas las guías para un gen determinado, según lo determinado por MAGeCK. Los enriquecimientos se calcularon combinando todas las réplicas para una comparación, usando la fracción enriquecida con GFP contra el conjunto de células sin clasificar. El asterisco indica P < 0,05 utilizando la agregación de rango robusta de MAGeCK. Consulte el panel b correspondiente y los datos extendidos Fig. 8b,d. Los valores P exactos se pueden encontrar en la Tabla complementaria 1.

Como se esperaba, los tres controles positivos Zfp57, Uhrf1 y Dnmt1 obtuvieron los mejores resultados en todas las pantallas (Fig. 4b, c, datos extendidos, Fig. 8a-c y tabla complementaria 1). Además, otros factores asociados a la heterocromatina como Cbx1, Cbx5, Atrx, Daxx y Setdb1 se enriquecieron en la fracción positiva para GFP. La lista de aciertos de alta confianza que se encontraron repetidamente en todas las pantallas se enriqueció para Zfp57, Uhrf1 y Dnmt1, mientras que otros aciertos se identificaron en líneas celulares informadoras ICR individuales (Fig. 4c). Rediseñamos una biblioteca CRISPR extendida (EpiTF) que consta de 20 470 ARN guía contra 4095 genes que codifican factores nucleares para cubrir una gran fracción de la familia de proteínas con dedos de zinc KRAB y repetimos la pantalla usando el reportero Airn ICR (Tabla complementaria 1). A pesar de la mayor complejidad de la biblioteca, no identificamos factores de transcripción adicionales que desempeñen un papel en el mantenimiento del silenciamiento del reportero Airn (Fig. 4c y Datos extendidos Fig. 8d, e). Varios candidatos identificados en más de una pantalla fueron probados por validación de un solo KO. Zfp57, Uhrf1 y Dnmt1 mostraron una regulación al alza constante en las tres líneas informadoras, mientras que otros candidatos dieron como resultado una reactivación más baja o estocástica en algunas de las líneas informadoras probadas (Datos extendidos, Fig. 8f).

Se identificaron dos factores en al menos tres pantallas diferentes (Fig. 4c y datos extendidos, Fig. 8g): ATF7IP, responsable del silenciamiento de elementos transponibles mediado por SETDB135,36,37, así como ZMYM2, un factor que interactúa con ATF7IP asociado con restricción del crecimiento de células pluripotentes humanas38,39. Dada su asociación con H3K9me3 y su participación informada en el silenciamiento transcripcional de elementos repetitivos, probamos su contribución a la regulación del mantenimiento epigenético en las ICR. Además, recientemente se identificó que la ATF7IP humana es un represor de genes impresos expresados ​​​​paternamente y se requiere para silenciar genes específicos de esperma40. Primero queríamos ver si estos factores realmente se localizan en los ICR endógenos y analizamos los conjuntos de datos mESC ChIP-seq existentes disponibles para SETDB1 (ref. 41), ZFP57 (ref. 42), ATF7IP39 y ZMYM2 (ref. 43). Observamos una fuerte colocalización de todos los factores en los ICR endógenos utilizados en las pantallas CRISPR (Fig. 5a). Al expandir aún más nuestro análisis a todos los ICR anotados, vemos que casi todos los ICR están unidos por ATF7IP, ZMYM2, ZFP57 y SETDB1 (Fig. 5b). Las excepciones notables son MCTS2/H13, donde ATF7IP está ausente, y H19, que muestra una localización reducida de ZMYM2. Como tendencia general, observamos que ATF7IP y ZMYM2 siempre colocalizan en presencia de SETDB1 y ZFP57, lo que sugiere que se localizan en ICR como parte de la maquinaria H3K9me3. Curiosamente, el análisis de todo el genoma de los picos ATF7IP, ZMYM2, ZFP57 y SETDB1 indica que esta colocalización no siempre se observa fuera de los ICR. Aunque la mayoría (85 %) de los pocos picos de ATF7IP que detectamos se superponen con los sitios de ZFP57 y SETDB1, solo el 30 % de los picos de ZMYM2 se colocalizan con ZFP57 y SETDB1 (datos extendidos, figura 9a). Los picos de ZMYM2 fuera de los sitios de ZFP57/SETDB1 muestran una menor metilación del ADN y H3K9me3 en comparación con los picos que se superponen con ZFP57/SETDB1, lo que sugiere que ZMYM2 está involucrado en múltiples vías reguladoras independientemente de SETDB1 (datos extendidos Fig. 9b,c). Independientemente de este enlace, vemos una reducción de la localización de ATF7IP y ZMYM2 en los ICR de Airn en ausencia de ZFP57 (datos extendidos, figura 9d).

a, Instantáneas del navegador del genoma para los ICR Airn, Kcnq1ot1 y Peg10 utilizados en los experimentos de pantalla CRISPR. Los conjuntos de datos de ChIP-seq indican la colocalización de ZFP57, ATF7IP, ZMYM2 y SETDB1 en los ICR de interés. b, mapas de calor que resumen la unión de ATF7IP, ZMYM2, ZFP57, SETDB1 y H3K9me3 10 kb (k) aguas arriba y aguas abajo en todos los ICR anotados en el genoma del ratón. Se muestran las lecturas normalizadas de la biblioteca por 20 pb. c, Izquierda: representación esquemática de la configuración de ligadura de proximidad de biotina para detectar proteínas en los sitios unidos a ZFP57 comparando ZFP57 fusionado con TurboID. LC MS/MS: cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem. Derecha: diagrama de volcán que muestra proteínas enriquecidas e indica hits estadísticamente significativos de una comparación directa entre ZFP57-TurboID y TurboID-NLS (nTurboID). Se indican proteínas enriquecidas estadísticamente (prueba t de dos colas corregida de tasa de descubrimiento falso (FDR): FDR = 0,05, varianza artificial dentro de los grupos (s0) = 1, n = 4 repeticiones técnicas). d, el análisis de metilación del ADN en los ICR seleccionados muestra pérdida de metilación en las células Atf7ip-KO y Zmym2-KO (consulte la Fig. 10c de datos ampliados para otros ICR). Se muestran los valores de metilación para CpG individuales obtenidos de WGBS en células de tipo salvaje, Zmym2-KO o Atf7ip-KO. La posición genómica de los CpG se indica a continuación. e, H3K9me3 ChIP-seq indica la pérdida de H3K9me3 en los ICR seleccionados (datos extendidos Fig. 10e para otros ICR). Se muestran lecturas por ventanas de 100 pb. Se indican los ICR en las respectivas regiones de impresión.

Para interrogar aún más el vínculo entre ATF7IP y ZMYM2 en los ICR, reclutamos la biotina ligasa de proximidad TurboID44 para los ICR metilados a través de una proteína de fusión ZFP57-TurboID expresada desde el sitio RMCE y realizamos BioID como se describió anteriormente45 (Fig. 5c). Como control de fondo, generamos una línea celular que expresaba solo NLS-TurboID (nTurbo) e incluimos una línea celular que expresaba solo el dominio KRAB de ZFP57 fusionado con la ligasa TurboID para distinguir entre las proteínas que interactúan con ZFP57 cuando no están unidas a la cromatina. La detección por espectrometría de masas de proteínas enriquecidas incluyó varios factores previamente asociados con ZFP57 (KAP1, CBX3, CBX5 y MORC3). Entre ellos, detectamos ATF7IP (Fig. 5c, Datos extendidos Fig. 9e y Tabla complementaria 1), lo que respalda los resultados obtenidos de la pantalla CRISPR y el análisis de todo el genoma. En el caso de ZMYM2, no pudimos detectar la proteína en la fracción biotinilada ni en la muestra de fondo, lo que sugiere que su enriquecimiento estaba por debajo del límite de detección o no interactuaba específicamente con ZFP57.

A continuación, queríamos probar si la ausencia de estos factores que se expresan durante el desarrollo temprano del ratón influye en el estado epigenético en los ICR endógenos, y generamos KO mESC para Atf7ip y Zmym2 usando CRISPR-Cas9 (Datos extendidos Fig. 9f, g). La secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) reveló una reducción de la metilación del ADN en la mayoría de los ICR analizados, a pesar de la pérdida limitada de metilación en todo el genoma (Fig. 5d y Datos extendidos Fig. 10a-c). Los ICR de Peg13 y Meg3/Rian retuvieron la metilación del ADN en ambas líneas celulares KO, mientras que H13/Mcts y Gnas/Nespas retuvieron específicamente la metilación en ausencia de ZMYM2 y Zrsr1/Commd1 y H19 en ausencia de ATF7IP. La pérdida de metilación de ICR se confirmó aún más mediante la secuenciación de bisulfito dirigida alrededor de los sitios de unión de ATF7IP y ZMYM2 en los ICR de Airn, Kcnq1ot1 y Peg10 (datos extendidos, figura 10d). Finalmente, perfilamos H3K9me3 en las mismas líneas celulares KO y observamos la pérdida de H3K9me3 en todos los ICR, excepto Peg13 y Meg3/Rian, que retuvieron H3K9me3 en ambas líneas KO. Además, Zrsr1/Commd1 y H19 retuvieron H3K9me3 en las células Atf7ip KO (Fig. 5e y Extended Data Fig. 10e). Los cambios concordantes en la metilación del ADN y H3K9me3 en los ICR en ausencia de ATF7IP o ZMYM2 indican que estos factores son necesarios para evitar que los ICR cambien de estado metilado a no metilado en mESC.

Aquí, nos propusimos estudiar los determinantes genéticos y epigenéticos que permiten que los ICR mantengan su metilación diferencial del ADN. Hacia esto, aislamos los ICR de su contexto cromosómico endógeno y los insertamos en una posición heteróloga en el genoma de mESC. Cuando se integraron sin metilar, los ICR probados mantuvieron un estado eucromático y libre de metilación del ADN, lo que sugiere mecanismos específicos de secuencia que evitan la metilación de novo. Este comportamiento es similar a los promotores de islas CpG, que están protegidos de la metilación del ADN a través de una densidad CpG elevada4,5. De hecho, según su densidad de CpG y su porcentaje de GC, la mayoría de los ICR cumplen la definición de islas CpG. Por el contrario, la integración de secuencias ICR metiladas con ADN en el mismo sitio sobrescribe este estado predeterminado y conduce a una propagación estable de la metilación del ADN con el posterior establecimiento de marcas de heterocromatina. Por lo tanto, los ICR son elementos de secuencia de ADN autónomos que pueden recapitular los mecanismos reguladores epigenéticos observados en su posición endógena. Este hallazgo está en línea con trabajos previos que indican que la secuencia de ADN de los ICR es suficiente para recapitular el establecimiento de improntas durante el desarrollo del ratón45,46,47,48,49. Es importante destacar que este cambio entre dos estados de cromatina opuestos basados ​​en la metilación del ADN no se observó para los promotores que no son ICR y otras secuencias de ADN de tamaño similar, densidad de CpG o contenido de GC, lo que sugiere que para esto se requieren propiedades especializadas del ICR de longitud completa. biestabilidad epigenética'.

Los ICR ectópicos permitieron estudiar sistemáticamente las secuencias de ADN y los factores reguladores de la cromatina necesarios para crear y mantener la memoria epigenética en los ICR en un entorno genómico controlado. Mediante la introducción de ICR sintéticos con secuencias de ADN modificadas, observamos que el contenido de GC y la densidad de CpG no son suficientes para codificar la biestabilidad en mESC, pero que las secuencias adicionales, como los motivos de unión a ZFP57, juegan un papel importante en el mantenimiento de la metilación del ADN y H3K9. Este hallazgo está en línea con trabajos previos, donde las mutaciones de los CpG metilados del motivo de reconocimiento ZFP57 dieron como resultado la pérdida del mantenimiento de la metilación en todo el Snrpn ICR21. Además, mostramos que la unión de ZFP57 no solo es necesaria sino también suficiente para la memoria epigenética en el estado Airn ICR metilado en mESC. En el caso del alelo no metilado, los mismos cambios de secuencia dan como resultado la pérdida de protección contra la metilación de novo, lo que sugiere mecanismos específicos de secuencia que protegen contra la metilación de novo, potencialmente similares a los observados en las regiones reguladoras de los genes no impresos3,5. Sin embargo, debido a que el mantenimiento de la metilación diferencial de Airn ICR en las células MEL fue independiente de las secuencias de ADN fuera de las CpG, sugerimos un requisito específico del tipo de célula para los factores específicos de la secuencia involucrados en el mantenimiento epigenético. En el caso de ZFP57, esto estaría en consonancia con su actividad transcripcional restringida a células germinales y durante el desarrollo temprano18,29.

Habiendo identificado el sólido establecimiento y mantenimiento de la heterocromatina en los ICR metilados, podríamos generar líneas celulares informadoras que respondan a la metilación del ADN. A diferencia de las estrategias anteriores que utilizaron el promotor Snrpn para informar cambios en la metilación en los promotores de genes endógenos50,51, nuestras líneas celulares informan directamente los cambios regulatorios en los ICR introducidos. Usamos a estos reporteros para filtrar los factores requeridos para el mantenimiento del estado reprimido. Las pantallas CRISPR dirigidas identifican Dnmt1, Uhrf1 y Zfp57 como los genes más relevantes necesarios para mantener el estado de metilación del ADN en todos los ICR probados, lo que confirma la idoneidad de nuestra configuración. Además, nuestras pantallas funcionales identificaron y, por lo tanto, validaron factores adicionales que se han descrito para regular H3K9me3 en todo el genoma y para asociarse con ICR, incluidos DAXX, ATRX, CBX1 y CBX5 (refs. 14, 52, 53).

Entre los aciertos obtenidos, identificamos ATF7IP y ZMYM2 como factores involucrados en el mantenimiento de la represión epigenética en los reporteros de ICR. ATF7IP y SETDB1 muestran superposición funcional en la regulación de elementos retrovirales endógenos, actuando ATF7IP como cofactor de SETDB1 estimulando su actividad enzimática, protegiéndola de la degradación proteasómica y facilitando su localización nuclear35,37,54,55. Aunque la pérdida de SETDB1 es letal en mESCs, la ausencia de ATF7IP reduce los niveles de SETDB1, suficientes para la viabilidad pero insuficientes para mantener todos los sitios reprimidos en el genoma37,56. Se ha demostrado que el dominio de tipo III de fibronectina C-terminal de ATF7IP interactúa con ZMYM2 (también ZFP198), y se sugirió que esta interacción es importante para silenciar algunos genes específicos de la línea germinal, incluido el gen FKBP6 impreso39,57. También se describió que ZMYM2 interactúa con la cromatina marcada con H3K9me358,59 y, además, se requiere para el silenciamiento de elementos retrovirales endógenos, evitando así la transición a células similares a dos células en el cultivo de mESC43,54. El papel de ZMYM2 en la restricción de la potencia se ve respaldado por el hecho de que se requiere ZMYM2 para salir de la pluripotencia38,60. Mostramos que ATF7IP y ZMYM2 se colocalizan junto con ZFP57 y SETDB1 en la mayoría de los ICR endógenos en mESC y son necesarios para la memoria del estado epigenético en los ICR metilados. Esto está en línea con una publicación que muestra un papel de ATF7IP en la regulación de genes específicos de esperma y genes impresos expresados ​​​​paternalmente, incluido Peg13 en ESC partenogenéticos humanos40. Nuestros resultados indican que, en mESCs, ATF7IP podría desempeñar un papel más amplio en la regulación de todos los ICR metilados, independientemente del origen parental.

Queda por probar si y cómo estos dos factores contribuyen al mantenimiento de las huellas durante la formación del cigoto y el desarrollo temprano. En mESC, su ausencia resultó en una fidelidad de mantenimiento deteriorada y una pérdida esporádica de H3K9me3 en múltiples ICR, independientemente de su origen parental. Sugerimos que esto desestabiliza el circuito de retroalimentación represiva entre la metilación del ADN y H3K9me3, lo que permite cambiar el ICR al estado no metilado predeterminado. Si bien observamos diferencias en las actividades regulatorias de ATF7IP y ZMYM2 en algunos ICR (por ejemplo, Mcts2/H13, Zrsr1/Commd1 y H19), queda por determinar si esto se debe a una especificidad de estos factores hacia estos ICR. Alternativamente, esto podría reflejar la estocasticidad en el cambio de ICR a un estado no metilado en ausencia de cualquiera de los factores, que se memoriza en células derivadas clonalmente.

Se cultivaron mESC competentes para RMCE (TC-1 (ref. 3), obtenidas de A. Dean, Institutos Nacionales de Salud (NIH)) en placas recubiertas de gelatina al 0,2 % en medio mESC que contenía DMEM (Invitrogen), 15 % de feto de ternera suero (Invitrogen), 1 × aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1 × Glutamax (Invitrogen), 0,001 % de 2-mercaptoetanol (Invitrogen) y factor inhibidor de la leucemia titulado (fabricado internamente) a 37 °C en 7 % de CO2 . Como alternativa, las mESC se cultivaron en medio 2i que contenía 50 % de medio Neurobasal (Invitrogen), medio DMEM/F12 (Invitrogen), 1 × aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1 × Glutamax (Invitrogen), 0,001 % 2-mercaptoetanol (Invitrogen ), suplemento 1x N2 (Invitrogen), suplemento 1x B27 (Invitrogen), factor inhibidor de la leucemia titulado, CHIR99021 3 µM (Sigma-Aldrich) y PD0325901 1 µM (Sigma-Aldrich). Cuando se indique, se añadió ácido l-ascórbico (Stemcell Technologies) a una concentración de 100 µg ml−1 (ref. 26). La diferenciación a células progenitoras neuronales se realizó como se describió previamente sin células alimentadoras61. Para la inhibición de DNMT1, se agregó GSK-3484862 (MedChemExpress) a una concentración final de 10 µM, como se determinó previamente34. Células MEL competentes para RMCE30 (obtenidas de D. Schübeler, FMI Basilea) se cultivaron en suspensión en DMEM (Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10% (Invitrogen) y 1x Glutamax (Invitrogen). Todas las líneas celulares competentes de RMCE (TC-1 y MEL) se autenticaron en función de la selección y la PCR en el casete de resistencia de RMCE.

Las integraciones de líneas celulares dirigidas en mESC se obtuvieron a través de RMCE usando electroporación de 2 × 106 células con Amaxa Nucleofector (Lonza) o transfecciones de Lipofectamine 3000 (Invitrogen) de 2,5 × 104 células. Todos los vectores RMCE se cotransfectaron con un plásmido que expresa CRE en una proporción de 1:0,6 µg, usando un total de 40 µg de plásmido para el kit Amaxa Nucleofector o 1 µg para Lipofectamine 3000. Dos días después de la transfección, las células se seleccionaron con 3 Ganciclovir µM durante más de 8 días. Las líneas celulares obtenidas se mantuvieron como grupos y, cuando fue necesario, se obtuvieron líneas celulares clonales mediante dilución limitada. Se genotipificaron grupos o líneas celulares clonales utilizando PCR específicas del sitio de integración. La línea celular parental para todas las líneas celulares informadoras utilizadas en las pantallas CRISPR contiene un gen Cas9 expresado de manera estable del locus Rosa26, obtenido por integración mediada por TALEN como se describió anteriormente62. Las líneas celulares KO de un solo clon se obtuvieron mediante CRISPR-Cas9 utilizando el plásmido px330-hSpCas9 (Addgene, 42230) junto con un indicador de recombinación pRR-Puro62. Se transfectó un total de 1 µg de ADN plasmídico en una proporción de 1:0,1 de px330 a pRR-Puro utilizando Lipofectamine 3000. La selección de puromicina se inició 36 h después de la transfección durante 36–48 h a una concentración de 2 µg ml−1. Las líneas celulares KO se validaron mediante PCR específica del sitio de orientación. La RMCE en células MEL se realizó utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen), sembrando 5 × 105 células en placas de 6 pocillos para células en suspensión. Se transfectó un total de 2,5 µg de ADN de plásmido, utilizando la misma proporción descrita anteriormente, según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, las células se transfirieron a matraces T75, y las células que se sometieron a recombinación se seleccionaron con medio que contenía ganciclovir 5 µM durante más de 8 días.

Se usó una columna vertebral que contenía dos sitios loxP invertidos3 para clonar varios vectores indicadores vacíos que contenían un sitio de entrada universal de 60 pb con un sitio de restricción EcoRV central, seguido de un promotor (pCAGGS, hPGK y Ef1alpha) que impulsa un gen eGFP o mScarlet para el Pantallas de ChroMM y EpiTF, respectivamente, seguidas de una secuencia BGH-poly(A) descendente y WPRE. Las secuencias de control o ICR individuales se amplificaron a partir de ADN genómico (Tabla complementaria 1). El ensamblaje de Gibson se realizó de acuerdo con el protocolo NEB Gibson Assembly Master Mix. La metilación in vitro se realizó con hasta 40 µg de ADN plasmídico usando NEB M.SssI metiltransferasa en dos reacciones consecutivas de al menos 4 h con 600 µM SAM (NEB, B9003S) y 1,5 U M.SssI (NEB, M0226L) por microgramo ADN. La metilación completa de los plásmidos se confirmó usando la enzima de restricción sensible a la metilación CpG HpaII (NEB) y una reacción de control insensible a la metilación con MspI (NEB). Las líneas celulares se generaron como se describió anteriormente. Los clones individuales se genotiparon usando PCR con cebadores que abarcaban los sitios loxP. La metilación de la construcción informadora integrada se validó en clones seleccionados.

La adquisición de datos de citometría de flujo se realizó en un analizador de células BD FACSCanto II o BD LSR Fortessa. FACS se realizó con un clasificador de células BD FACSAria III. El análisis de datos se realizó con FlowJo (versión 10.7) o BD FACSDiva (9.1.2). Todas las muestras se seleccionaron para celdas individuales, utilizando el área de dispersión frontal (FSC-A) versus el área de dispersión lateral (SSC-A), seguido de FSC-A versus la altura de dispersión frontal (FSC-H). Las poblaciones positivas y negativas de GFP se cuantificaron usando células de tipo salvaje negativas de GFP como referencia. Para la tinción de marcadores de superficie celular, se preparó una suspensión celular uniforme mediante tripsinización y filtración a través de un filtro celular de 40 μm (BD Bioscience). Las células se tiñeron con un anticuerpo CD90.1 conjugado con aloficocianina (APC) (Invitrogen, 17-0900-82) durante 30 min a 4 °C con una concentración de anticuerpo saturada (1 µl por 15 millones de células).

Se usó BPnet28 (versión 0.0.23) para determinar el motivo de secuencia y el contexto de la unión de ZPF57 en mESC. Los datos de ZFP57 ChIP-seq y los archivos de entrada correspondientes42 se alinearon con el genoma del ratón (NCBI Build 37 mm9, julio de 2007) usando bowtie2 (versión 2.3.5.1) después de quitar los adaptadores usando trimgalore (versión 0.6.6). Las lecturas alineadas se filtraron en busca de duplicados de PCR con Picard (versión 2.23.9), y solo las lecturas con una calidad de mapeo (MAPQ) > 40 se guardaron para análisis posteriores. Todas las réplicas se fusionaron antes del pico de llamadas usando MACS2 (versión 2.1.1.20160309) con los siguientes parámetros: callpeak -g mm–keep-dup all -q 0.05–call-summits. Las lecturas asignadas a la hebra positiva y negativa de los conjuntos de datos combinados se dividieron en archivos individuales y se recortaron a la base de 5 'como pistas de entrada para BPnet. Se entrenó un modelo con la arquitectura predeterminada bpnet9 (https://github.com/kundajelab/bpnet), utilizando los cromosomas 1, 8 y 9 como conjunto de prueba y picos en los cromosomas 2, 3 y 4 como conjuntos de validación. Los picos en los cromosomas X e Y se excluyeron del entrenamiento del modelo. Después del cálculo de las puntuaciones de contribución con el método DeepLIFT de BPnet, los motivos se determinaron utilizando el método TF-MoDISco de BPnet. Para determinar las puntuaciones de contribución en las secuencias Airn y Airn mezcladas, el ADN de entrada se codificó en caliente antes de someterlo al modelo entrenado para generar predicciones de unión ZFP57. Para las mutaciones andantes, 10 nt de la secuencia mezclada se intercambiaron con la secuencia original de Airn y se desplazaron 1 pb por predicción.

Se usaron hasta 2 µg de ADN genómico, o la cantidad total del material eluido de ChIP, para la conversión de bisulfito usando el EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen). La PCR con bisulfito se llevó a cabo utilizando la polimerasa PhusionU (Thermo Fisher Scientific) con los cebadores indicados en la Tabla complementaria 1 utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguido de 45 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 50–60 °C (dependiendo del par de cebadores) y 1 min a 72 °C, seguido de 5 min de extensión final a 72 °C. Los amplicones se clonaron en el vector CloneJET (Thermo Fisher Scientific), se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger y se analizaron con QUMA63.

Las bibliotecas de secuenciación de bisulfito dirigidas se hicieron a partir de fragmentos de PCR de bisulfito agrupados equimolares. Se realizaron dos reacciones de PCR independientes por objetivo con temperaturas de hibridación de 50 °C y 58 °C para mitigar el sesgo de amplificación. Las bibliotecas indexadas se prepararon utilizando el kit NEBNext Ultra II (NEB) a partir de 10 ng de amplicones agrupados según el protocolo del fabricante. La secuenciación se realizó en una máquina Illumina NovaSeq6000 con lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Los archivos Fastq se recortaron con trim_galore (versión 0.6.6) y la alineación se realizó con Bismark (versión 0.23.0) con el parámetro no direccional. La metilación de CpG se extrajo con el extractor de metilación Bismark y la metilación de CpG promedio se calculó en R, excluyendo los CpG que se cubrieron menos de 500 veces.

WGBS de Atf7ip y Zmym2 KO mESCs se realizó como se describió anteriormente64. En resumen, se sonicaron 10 µg de ADN genómico hasta una longitud de aproximadamente 400–500 pb. Para cada muestra, se mezclaron 2 µg de ADN genómico cizallado con 10 ng combinados equimolares de ADN de fago T7 metilado sonicado y ADN de fago Lambda no metilado. La ligadura del adaptador se realizó con el kit NEBNext Ultra II (NEB E7645L) usando adaptadores metilados (NEB, E7535S), antes de la conversión de bisulfito usando el kit de conversión de bisulfito Qiagen Epitect, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la conversión, las bibliotecas se amplificaron durante 10 ciclos usando la ADN polimerasa Pfu TurboCx Hotstart (Agilent) y los cebadores de índice dual NEB (NEB, E7600S). Las reacciones de PCR se corrieron con los siguientes parámetros: 95 °C por 2 min, 98 °C por 30 s, seguido de 10 ciclos de 98 °C por 15 s, 65 °C por 30 s y 72 °C por 3 min, finalizando con 5 min a 72 °C. Las reacciones de PCR se limpiaron utilizando perlas 1,2x AMPure XP (Beckman Coulter) y se eluyeron en 20 µl de tampón EB (Qiagen). La calidad de la biblioteca se verificó en una Agilent TapeStation y la secuenciación se realizó en una máquina Illumina NovaSeq 6000.

Se recolectaron aproximadamente 15 × 106 células por IP y se fijaron con formaldehído sin metanol al 1 % durante 8 min. La reticulación se extinguió agregando glicina a una concentración final de 0,125 nM y se incubó durante 10 min a 4 °C en hielo. Las células se sedimentaron a 600 × g durante 5 min, se lavaron con PBS frío y se incubaron durante 10 min en hielo en un tampón que contenía EDTA 10 mM, Tris 10 mM pH 8, EGTA 0,5 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Después de la centrifugación, las células se incubaron en EDTA 1 mM, Tris 10 mM pH 8, EGTA 0,5 mM y NaCl 200 mM durante 10 min en hielo. La cromatina se extrajo en un tampón con alto contenido de sal que contenía HEPES 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato al 0,1 %, SDS al 0,2 % y NaCl 500 mM durante 2 h a 4 °C, y se extrajo la cromatina. cortado usando un sonicador Bioruptor Pico (Diagenode). Luego, se usaron 100 µg de cromatina por reacción IP con 30 µl de perlas de proteína A magnéticas prebloqueadas (Invitrogen). Las perlas se bloquearon con 1 mg de BSA y 100 ng de ARNt de levadura (Sigma) en una mezcla de inhibidor de proteinasa que contenía tampón TE (Roche) antes de su uso. Antes de la IP, la cromatina se aclaró previamente con 20 µl de perlas bloqueadas durante 1 h a 4 °C. A continuación, el 5 % del material de entrada se mantuvo a -20 °C y se desentrecruzó a lo largo del material IP. Luego, se usaron 5 µg de anticuerpo por IP para la incubación durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 30 µl de perlas bloqueadas a la cromatina y se incubaron durante 4 ha 4 °C. Las perlas se separaron en un imán y se lavaron dos veces durante 8 min con tampón de alta salinidad, una vez con LiCl 50 mM, NP-40 al 0,5 %, desoxicolato al 0,5 %, EDTA 1 mM y Tris 10 mM, pH 8. Después de dos lavados adicionales con TE durante 8 min, la cromatina se eluyó después de 30 min de incubación a 37 °C con 60 µg de RNaseA (Roche) en SDS al 1 % y NaHCO3 100 mM, seguido de 3 h de incubación añadiendo EDTA 10 mM, Tris 40 mM, pH 8 , y 60 µg de Proteinasa K (Roche). La desreticulación final se realizó durante la noche a 65 °C. El material eluido se limpió mediante extracción con cloroformo de fenol y se cuantificó mediante un fluorómetro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Se usaron los siguientes anticuerpos para ChIP: H3K9me3 (Abcam, ab8898, 5 µg por IP), H3K4me2 (Diagenode, C15410035, 5 µg por IP), H3K4me3 (Abcam, ab8580, 5 µg por IP), ATF7IP (Bethyl, A300- 169A, 5 µg por IP) y ZMYM2 (betil, A301-711A, 10 µg por IP).

Las reacciones de qPCR se realizaron como duplicados técnicos en una máquina Rotor Gene Q (Roche) utilizando el kit universal de qPCR KAPA SYBR Fast (Sigma) en reacciones de 10 µl con 1 µl de ADN eluido para el material IP o 1 µl de una dilución 1:10 del material de entrada. Los valores de Delta Ct se calcularon sobre la entrada, seguidos de delta Ct y cambio de pliegue sobre una región intergénica. Los cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 1. Los gráficos correspondientes se generaron con Prism (5.0a).

Las bibliotecas de ChIP-seq se prepararon con el conjunto NEBNext ChIP-seq Library Prep Master Mix para Illumina (NEB, E6240) o el kit NEBNext Ultra II, siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas finales se visualizaron y cuantificaron en un sistema TapeStation 2200 (Agilent) y se agruparon con proporciones molares iguales antes de la secuenciación en una máquina Illumina NovaSeq6000 con lecturas de extremos emparejados de 150 pb.

Los conjuntos de datos de todo el genoma mESC publicados se obtuvieron de GEO (WGBS65; H3K9me3, H3K4me3, H3K36me3 y H3K27me3 (ref. 66), DNase-seq y RNA-seq67, SETDB1 (ref. 41), ZFP57 (ref. 42), ZMYM2 ( ref. 43) y ATF7IP39. Las lecturas de secuenciación de los conjuntos de datos publicados y las lecturas de ChIP-seq generadas en este estudio se filtraron para lecturas de baja calidad, así como secuencias adaptadoras usando trimgalore (versión 0.6.6) y se asignaron al genoma del ratón (NCBI Build 37 mm9, julio de 2007). El mapeo de H3K9me3, H3K4me3, H3K36me3, H3K27me3, DNase-seq y RNA-seq se realizó con QuasR (1.30.0) en R con la configuración estándar de qAlign(). Las pistas de peluca se obtuvieron con QuasR qExportWig( ) y visualizado usando el navegador de genoma UCSC (https://genome.ucsc.edu). El mapeo de datos WGBS se realizó con QuasR usando qAlign() con la siguiente configuración: genoma = 'BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm9', alineador = 'Rbowtie' y bisulfito = 'dir'. Las llamadas de metilación de CpG se extrajeron usando qMeth() y se filtraron para contener solo CpG cubiertos al menos 10 ×. Las coordenadas máximas de ChIP-seq se obtuvieron usando MACS2 (versión 2.1.1.20160309) con lo siguiente parámetros: callpeak -g mm–keep-dup all -q 0.05–call-summits. Las coordenadas se importaron a R como objetos GenomicRanges y los picos de más de 1 kb se eliminaron del análisis posterior. Las superposiciones entre picos se calcularon utilizando la función findOverlaps() en R, con maxgap=1000 L. Los mapas de calor sobre ICR y las regiones de pico se generaron con genomation() en R utilizando las funciones ScoreMatrixList() y multiHeatMatrix().

La biblioteca de ChromMM y EpiTFs se construyó como un subgrupo de la biblioteca de ARNsg de Viena como se describió anteriormente68. Lentivirus se produjo en células HEK293T (obtenidas de G. Schwank, Universidad de Zurich) como se describe69. El virus no concentrado se tituló con diferentes cantidades siguiendo el mismo procedimiento de transducción utilizado para las pantallas CRISPR reales. La transducción se realizó con 1,25 × 106 células sembradas en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina en medio de células madre embrionarias que contenía 8 µg ml−1 de polibreno (Merck), girando durante 60 min a 500 × g a 37 °C. Después de la centrifugación, las células se incubaron durante 12 horas a 37 °C, antes de transferirlas a múltiples placas de 15 cm y cultivarlas durante otras 24 horas. Después de 36 h, las células transducidas se seleccionaron usando FACS. Para la biblioteca ChromMM, las células se tiñeron frente al marcador de superficie celular CD90.1 utilizando un anticuerpo conjugado con APC (Invitrogen, 17-0900-82, 1 µl por 15 millones de células), seleccionando células individuales positivas para APC y negativas para GFP. Para la biblioteca EpiTF, las células se bloquearon en células individuales positivas para GFP y negativas para mScarlet. Después de la clasificación, las células se sembraron escasamente en varios platos de 15 cm y solo se pasaron una vez después de 4 días para evitar cuellos de botella en la representación de la biblioteca. El día 10 después de la transducción, las células positivas para GFP se clasificaron y procesaron adicionalmente para la extracción de ADN genómico utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Todas las pantallas se realizaron con al menos 30 millones de células y una baja multiplicidad de infección entre 0,1 y 0,2, lo que arrojó un número total de células de al menos 3 millones de células y una representación de guía de al menos 450x por guía después de la primera clasificación. Para la clasificación final, se usó el mismo número de células transducidas inicialmente para la clasificación y se mantuvo como grupo de referencia. La selección con la biblioteca EpiTF se realizó como se describe anteriormente, sin embargo, se usaron 90 millones de células para la transducción con una multiplicidad de infección de 0,2. Inicialmente, todas las pantallas se realizaron como duplicados o triplicados técnicos con clones informadores individuales y luego se repitieron una vez más como experimentos independientes. Para puntuar los genes esenciales y de restricción del crecimiento, las células agrupadas en los días indicados se compararon con la biblioteca de plásmidos inicial.

La preparación de la biblioteca se realizó para la cantidad total de ADN genómico extraído en dos pasos consecutivos de amplificación por PCR. En la primera PCR, las secuencias guía integradas se amplificaron usando la ADN polimerasa Herculase II Fusion (Agilent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un máximo de 500 ng de entrada de ADN por 50 µl de reacción usando cebadores específicos de biblioteca con secuencias adaptadoras de 3′ para códigos de barras ( Tabla complementaria 1). La mezcla de PCR contenía DMSO al 1,5 % y tenía una concentración final de 3 nM de MgCl2. Los productos amplificados se purificaron primero con el kit de extracción MinElute Gel (Qiagen) y los posibles dímeros de cebadores se eliminaron con perlas AmpureXP (Beckmann) en una proporción de 0,7 veces el volumen. El código de barras específico de la muestra se realizó en una segunda PCR utilizando NEBNext Multiplex Oligos (NEB) y NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master mix (NEB) de acuerdo con el manual del fabricante con el 10 % del producto eluido de la primera PCR y 7 ciclos de amplificación. Para la biblioteca EpiTF, el código de barras se realizó con los cebadores i5 del kit NEBNext Multiplex Oligo (NEB) y un cebador personalizado que lleva la secuencia P7 (Tabla complementaria 1). La secuenciación se realizó en una máquina Illumina NovaSeq6000 o MiSeq, especificando un índice de lectura 1 de 10 pb para la biblioteca EpiTF.

La demultiplexación se realizó utilizando la canalización estándar de Illumina. Para la biblioteca EpiTF, la demultiplexación solo se realizó en el índice i5, ya que el índice i7 contiene el UMI68. Los archivos Fastq se recortaron para incluir solo la secuencia de ARN guía usando cutadapt (versión 3.10) especificando -g 5′-TAGCTCTTAAAC...GGTGTTTCGTC-3′ para las secuencias del adaptador vinculado en la columna vertebral de lentivirus para la biblioteca ChromMM o -g aaacaccg…gtttaaga para la biblioteca EpiTF. La alineación se realizó utilizando bowtie2 (versión 2.3.5.1) contra un genoma de referencia creado a partir de las secuencias de sgRNA, especificando los siguientes parámetros de alineación: -k 1: muy sensible. Los archivos BAM se convirtieron en archivos bed utilizando la función bamtobed ​​de bedtools (versión 2.27.1). Los archivos de cama se importaron a R para crear una matriz de conteo para MAGeCK (versión 0.5.9.2). Para el análisis final, se agregaron los conteos de réplicas técnicas, así como diferentes contenedores GFP alto y bajo GFP. MAGeCK se ejecutó con el método de norma establecido en total y se ejecutó contra el grupo no clasificado como muestra de control, especificando las réplicas independientes.

La validación de una sola guía se realizó con una guía de ARN que se incluyó en la biblioteca y una guía diseñada de forma independiente con alta actividad en el objetivo y baja actividad fuera del objetivo, como se describe en la ref. 70 (Cuadro complementario 1). Las guías se clonaron en el esqueleto px459 (Addgene, 62988) que permite la selección de puromicina. Para ello, se sembraron 1.000 células en pocillos recubiertos de gelatina de una placa de 96 pocillos 1 día antes de la transfección. A continuación, se transfectaron 100 ng de ADN de plásmido por pocillo como réplicas técnicas utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Después de 36 h, las células transfectadas se seleccionaron durante 36–48 h con 2 µg ml−1 de puromicina usando células no transfectadas como control. La reactivación del reportero se evaluó 12 días después de la transfección mediante citometría de flujo, y la reactivación de GFP se cuantificó sobre células transfectadas con guías de control no dirigidas.

Para la transferencia Western, se separaron 20–35 μg de proteína en geles de poliacrilamida al 6 % o al 10 % y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno utilizando el sistema TransBlot Turbo (Bio-Rad). Para la tinción basada en anticuerpos, la membrana se lavó una vez con TBS-T (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,1 %), se bloqueó con leche descremada en polvo al 5 % en TBS-T y se tiñó con anticuerpos primarios contra ATF7IP (betil, A300-169A), ZMYM2 (betil, A301-711A-M) o LAMIN B1 (Santa Cruz Biotechnology, 374015) a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces con TBS-T durante 10 minutos antes de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante específicos de especie durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con TBS-T durante 10 min cada uno, se detectó la señal usando el reactivo de detección de transferencia Western Amersham ECL (GE Healthcare Life Sciences; RPN2109) y la exposición en Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences; 28906836) en un cuarto oscuro.

Las líneas celulares se generaron como se describe en Villaseñor et al.45. La secuencia codificante de la enzima BioID2 del vector de entrada original se cambió por la secuencia codificante de la enzima TurboID44. Las células se transfectaron con el vector de entrada, que contenía solo el TurboID con una secuencia de localización nuclear, la secuencia de ADNc de ZFP57 de ratón de longitud completa clonada aguas arriba del TurboID o el dominio KRAB de ZFP57 como se anota en UniProt. Todas las células se validaron mediante transferencia Western de células incubadas con biotina 50 µM (Sigma-Aldrich) durante 12 h como se describió anteriormente con ajustes menores para adaptarse a la detección de biotina. En resumen, las membranas se bloquearon en BSA al 5 % en TBS que contenía Triton X-100 al 0,1 % durante 1 h y se tiñeron con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:20 000) en TBS que contenía Triton X-100 al 0,1 % durante la noche a 4 °C. La membrana se lavó dos veces con TBS que contenía Triton X-100 al 0,3 %, dos veces con TBS que contenía Triton X-100 al 0,3 % y más NaCl 500 mM, antes de un lavado final con TBS que contenía Triton X-100 al 0,3 % durante 10 min a temperatura ambiente. cada.

Las muestras de TurboID se prepararon como se describe en Villaseñor et al.45. En resumen, las células se cultivaron por cuadruplicado en placas de 15 cm, se incubaron con biotina 50 μM (Sigma-Aldrich) durante 12 h con una confluencia del 70 % y se recolectaron con tripsina. A continuación, las muestras se manipularon a 4 °C o en hielo. Los sedimentos celulares se hincharon en 5 veces el volumen de tampón de extracción nuclear 1 (NEB1; HEPES 10 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, inhibidor de proteasa completo sin EDTA 1 vez. cóctel (PIC; Roche) durante 10 min, antes de girar a 2000 × g durante 10 min. Las células se homogeneizaron utilizando un pistilo suelto Dounce en 2 × volúmenes de NEB1. Los núcleos se recogieron mediante centrifugación a 2000 × g durante 10 min, se resuspendieron en Tampón de extracción nuclear 2 de volumen 1x con NaCl 450 mM (NEB2; HEPES 20 mM, pH 7,5, EDTA 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, glicerol al 20 %, DTT 1 mM y PIC 1x) y homogeneizado 10 veces más con un Dounce apretado pistilo, seguido de una incubación durante 1 h con rotación superior. Los desechos se eliminaron mediante centrifugación a 2000 × g durante 10 min antes de ajustar la concentración de sal del sobrenadante a 150 mM NaCl con 2 × volúmenes de NEB2 y ajustar la concentración final de NP40 a Los extractos de proteínas al 0,3 % se cuantificaron con el kit de ensayo de proteínas Qubit (Thermo Fisher Scientific, Q33211) y se usaron cantidades iguales de extractos de proteínas por IP. Para cada IP, 40 µl de Streptavidin M-280 Dynabeads (Thermo Fisher Scientific), prebloqueado en tampón IP (IPB; NEB2, 150 mM NaCl, 0,3 % NP40, 1 mM DTT, 1× PIC) que contiene 1 % de pescado frío gelatina, se añadieron a los extractos y se incubaron a 4 °C durante la noche mientras se rotaban. A continuación, las perlas se lavaron dos veces con SDS al 2 % en TE que contenía DTT 1 mM y PIC 1x durante 10 min rotando a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 10 min con un tampón de alta salinidad (HEPES 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato al 0,1 %, SDS al 0,1 %, NaCl 500 mM, DTT 1 mM, PIC 1x), un lavado con tampón DOC (LiCl 50 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, NP40 al 0,5 %, 0,5 % de desoxicolato, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y PIC 1x) y dos veces con tampón TE que contenía DTT 1 mM, PIC 1x. Después de los lavados, las perlas se digirieron previamente con 5 µg ml−1 de tripsina (Promega; V5111) en 40 µl de tampón de digestión (urea 1 M en Tris 50 mM, pH 8,0, Tris-(2-carboxietil)-fosfina 1 mM) durante 2,5 h a 26 °C y agitando a 600 rpm. El sobrenadante se redujo adicionalmente con Tris-(2-carboxietil)-fosfina 2 mM durante 45 min a temperatura ambiente, se alquiló con cloroacetamida 10 mM durante 30 min a temperatura ambiente y se protegió de la luz. Para la digestión final, la solución de proteína se incubó con 0,5 µg adicionales de tripsina durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las muestras digeridas se prepararon para cargarlas en C18 StageTips mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) hasta una concentración final del 0,5 % y acetonitrilo (ACN) hasta una concentración final del 3 %. Las C18-StageTips (Centro de Genómica Funcional de Zúrich) de producción propia se humedecieron con metanol al 100 %, se limpiaron dos veces con la solución de elución (ACN al 60 %, TFA al 0,1 %) y se prepararon para la carga lavándolas dos veces con ACN al 3 % y TFA al 0,1 %. . Después de cargar la solución de péptido, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se cargó durante más tiempo, antes de lavar dos veces con ACN al 3 % y TFA al 0,1 %. Finalmente, los péptidos se eluyeron dos veces con la solución de elución, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se secaron en un centrifugador de vacío rápido y se reconstituyeron en ACN al 3%, ácido fórmico al 0,1%, que contenía péptidos estándar de tiempo de retención interno (iRTs, Biognosys). Las muestras se analizaron en un sistema Easy-nLC 1000 HPLC acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) con muestras aleatorias en bloque

MaxQuant (versión 1.5.3.30) se utilizó para la identificación de proteínas y la cuantificación sin etiquetas71 en función del proteoma de referencia de ratón (UniProtKB/Swiss-Prot y UniProtKB/TrEMBL) versión 2018_12 combinado con proteínas contaminantes anotadas manualmente, con valores FDR de proteína y péptido ajustado al 1%. Se utilizó Perseus para el análisis estadístico como se describió anteriormente72. Para ello, solo se conservaron las proteínas que se identificaron en tres de las cuatro muestras por grupo. Los valores perdidos se imputaron a partir de una distribución gaussiana desplazada a la izquierda de 1,8 desviaciones estándar con un ancho de 0,3. Se usó una prueba t para identificar interactuadores potenciales usando un umbral FDR de < 0.05 y un valor S0 de 1. Los datos se visualizaron usando R (versión 4.0.3).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación se han depositado en NCBI GEO con el siguiente número de acceso GSE176461; Los datos proteómicos de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD034918. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todos los análisis se realizaron utilizando herramientas publicadas o desarrolladas previamente. No se desarrolló ni utilizó ningún código personalizado.

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Agradecemos a A. Dean (NIH/NIDDK) por proporcionar amablemente la línea TC-1 mESC y a M. Buehler (FMI Basel) y C. Földy (Universidad de Zúrich) por compartir plásmidos. Además, agradecemos a G. Schwank y al grupo (Universidad de Zúrich) por su ayuda para establecer el protocolo de pantalla CRISPR, el Centro de genómica funcional de Zúrich (FGCZ), S3IT Zúrich y el Centro de citometría de la Universidad de Zúrich por su apoyo. Agradecemos a P.-A. Defossez (Universidad Paris Diderot) y miembros del grupo Baubec por sus aportes y por su crítica constructiva. TB reconoce el apoyo de la Universidad de Zúrich y la Universidad de Utrecht, la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (183722, 180354 y 190378), el Consejo Europeo de Investigación (865094 - ChromatinLEGO - ERC-2019-COG) y el programa EMBO Young Investigator. NS recibió el apoyo de becas postdoctorales de EMBO y la Universidad de Zúrich y es becaria de la SNSF Ambizione (186012). RV reconoce el apoyo de la Universidad de Zúrich (beca postdoctoral UZH FK-21-060). DS reconoce el apoyo de la Fundación de Investigación de Novartis, el Consejo Europeo de Investigación en virtud del acuerdo de subvención del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (UE) (667951-ReadMe y 884664-DNAccess) y la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (310030B_176394). ARK reconoce el apoyo del Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 5247/1-1) y el Fondo Nacional Suizo Ambizione (subvención PZOOP3_161493).

Nina Schmolka

Dirección actual: Instituto de Inmunología Experimental, Universidad de Zúrich, Zúrich, Suiza

Rodrigo Villaseñor

Dirección actual: División de Biología Molecular, Centro Biomédico de Múnich, Universidad Ludwig-Maximilians, Múnich, Alemania

silvia docke

Dirección actual: Departamento de Ciencias del Genoma, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Arnaud R. Krebs

Dirección actual: Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), Unidad de Biología del Genoma, Heidelberg, Alemania

Departamento de Mecanismos Moleculares de Enfermedades, Universidad de Zúrich, Zúrich, Suiza

Stefan Butz, Nina Schmolka, Ino D. Karemaker, Rodrigo Villaseñor, Isabel Schwarz & Tuncay Baubec

Programa de Doctorado en Ciencias de la Vida Molecular de la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de Zúrich, Universidad de Zúrich y ETH Zúrich, Zúrich, Suiza

Stefan Butz

Instituto Friedrich Miescher de Investigación Biomédica, Basilea, Suiza

Silvia Domcke, Florian Lienert, Arnaud R. Krebs y Dirk Schübeler

Facultad de Ciencias, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

Silvia Domcke, Florian Lienert y Dirk Schübeler

Instituto de Biotecnología Molecular de Austria (IMBA), Vienna BioCenter (VBC), Viena, Austria

Esther CH Uijttewaal y Ulrich Elling

Instituto de Investigación de Patología Molecular (IMP), Vienna BioCenter (VBC), Viena, Austria

Julián Jude y Johannes Zuber

División de Biología del Genoma y Epigenética, Instituto de Biodinámica y Biocomplejidad, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Nathalie P. de Wagenaar, Xue Bao y Tuncay Baubec

Universidad Médica de Viena, Vienna BioCenter (VBC), Viena, Austria

Juan Zuber

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SB y TB diseñaron el estudio. SB, NS, IK, RV, IS, SD, FL, NdW, XB y TB realizaron experimentos. JJ, UE, JZ y UE diseñaron y generaron bibliotecas CRISPR específicas. AK y DS proporcionaron líneas celulares y conjuntos de datos utilizados en este estudio. SB y TB escribieron el manuscrito, con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Tuncay Baubec.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Genetics agradece a Maxim Greenberg y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a) Instantánea del navegador del genoma para el locus Airn ICR en células madre embrionarias de ratón. Se muestran pistas de ChIP-seq para modificaciones de cromatina, datos de RNA-seq para actividad transcripcional, DHS-seq para accesibilidad de cromatina, datos de WGBS para metilación de ADN y densidad de GC local en porcentaje. La secuencia ICR utilizada para los experimentos está resaltada. b) Gel de agarosa representativo para digestión de restricción de plásmidos metilados y no metilados in vitro antes de la transfección. HpaII y MspI comparten el mismo sitio de reconocimiento, sin embargo, HpaII está bloqueado por la metilación de CpG. El experimento se repitió al menos dos veces antes de la integración de RMCE. Se indican marcadores de tamaño molecular. c) Resumen esquemático del fragmento de ADN integrado ectópico para H19 con líneas verticales que ilustran los sitios CpG individuales (arriba) y las mediciones de moléculas individuales de la metilación del ADN de las secuencias premetiladas y no metiladas mediante PCR con bisulfito (abajo). de) igual que en (c): para Zrsr1 (d) y Kcnq1ot1 (e). f) Resumen esquemático del fragmento de ADN integrado ectópico para el DMR gamético Igf2r con líneas verticales que ilustran sitios CpG individuales (arriba) y mediciones de moléculas individuales de la metilación del ADN de las secuencias premetiladas y no metiladas usando bisulfito PCR (abajo). gi) igual que en f: Hes3 (g), Syt1 (h) y Tcl1 (i). Los datos de bisulfito no metilado (- M.SssI) para gi se obtuvieron de Lienert et al.3 y se muestran para comparación.

Datos fuente

a) Tabla de resumen para el análisis de metilación de Airn ICR después de un cultivo a largo plazo (más de 20 pases consecutivos), integración aleatoria en un sitio genómico diferente, durante la diferenciación en células progenitoras neuronales (NPC) o después de cultivar en 2i durante 10 días. bd) Mediciones de una sola molécula de bisulfito PCR correspondientes a los datos resumidos en a. e) Análisis de metilación para el Airn ICR ectópico y endógeno después de Zfp57 KO mediado por CRISPR. Los triángulos indican CpG dentro de motivos ZFP57. Se indica la región analizada por bsPCR. f) Resumen esquemático de los fragmentos Airn ICR probados en el estudio (arriba) y resultados de PCR de bisulfito de molécula única de los fragmentos individuales (abajo) g) Tabla de resumen para el análisis de metilación de los fragmentos H19 ICR, incluido el tamaño, la densidad CpG y GC información de contenido. h) Mediciones de molécula única de bisulfito PCR correspondientes a los datos resumidos en g.

a) Análisis de las características de la secuencia para ventanas de 1 kb de todo el genoma. Los puntos amarillos indican las secuencias ICR utilizadas en este estudio. Los puntos rojos indican fragmentos similares a Airn. b) Instantáneas del navegador del genoma para las cuatro secuencias tipo Airn. Los cuadros resaltados indican las secuencias de ADN utilizadas en los experimentos RMCE. c) Características de secuencia de secuencias similares a Airn seleccionadas en comparación con Airn ICR. Las líneas verticales corresponden a sitios CpG individuales dentro de la secuencia. d) porcentaje de GC de secuencias tipo Airn seleccionadas. e) Representación de una sola molécula de los datos resumidos en f. f) Resumen tabular del análisis de metilación para todas las secuencias similares a Airn, incluido Airn ICR para comparación.

a) Flujo de trabajo que indica el barajado de secuencias in silico para Airn ICR. b) Característica de secuencia de la secuencia barajada más divergente (Airn barajada) en comparación con la secuencia original de Airn. c) Evaluación de BPNet de la unión de ZFP57 en el ICR de Airn de tipo salvaje y unión predicha en el ICR de Airn mezclado. d) Unión de ZFP57 predicha en Airn de tipo salvaje con un reemplazo de exploración de 10 pb de la secuencia de Airn mezclada. Cada fila representa la predicción de un experimento de reemplazo. e) Predicción de unión a ZFP57 en motivos de unión a ZFP57 reconstituidos con Airn + mezclados.

a) Diseño de construcciones de indicadores de GFP con diferentes promotores utilizando secuencias sobresalientes idénticas para el ensamblaje de Gibson, yb) análisis de citometría de flujo de la expresión de GFP de células que llevan las construcciones de indicadores vacías y sin metilar sin ICR. c) Análisis de citometría de flujo que indica el porcentaje de células positivas para GFP por población (derivado de clones individuales) que muestra la estabilidad de la represión para los indicadores ICR metilados en combinación con promotores EF1a (arriba) o PGK (abajo) medidos a los 16, 23 y 30 días después de la transfección. Además, se muestra el porcentaje de GFP para las células que reciben reporteros con promotores metilados únicamente (sin ICR) o en combinación con el promotor Dazl como controles. Cada punto indica clones derivados de forma independiente. d) Análisis de citometría de flujo de células que contienen un reportero H19-EF1a. e) Análisis de citometría de flujo para un clon representativo de mESC con el reportero Airn-pCAGGS cultivado en suero, 2i o 2i + vitamina C durante 12 días. f) Análisis de citometría de flujo de tres clones independientes con el reportero Airn-CAG metilado después de 8 días en diferentes condiciones de medios. g) Curso de tiempo para la reactivación de diferentes combinaciones de ICR-promotor en diferentes condiciones de crecimiento. Los puntos de datos muestran el valor medio de 3 clones independientes. La barra de error indica el error estándar de la media.

a) Análisis de citometría de flujo de la reactivación de GFP 8 días después de la transfección con ARN guía dirigidos a los genes Uhrf1 y Dnmt1, en comparación con células transfectadas con ARN guía no dirigidos. Los datos se muestran de toda la población de células objetivo sin preselección de células KO. b) Resultados resumidos de a. Cada punto indica el % de células positivas para GFP en la población total de células objetivo. c) Análisis de citometría de flujo de Airn-EF1a-GFP premetilado tratado con el inhibidor de metilación del ADN GSK-3484862 durante 2 días (arriba) y después del lavado durante 7 días, lo que indica que una vez reactivado, el reportero no vuelve a silenciarse.

a) Estrategia de activación de FACS para pantallas CRISPR utilizando las bibliotecas ChromMM. Las mESC transducidas se seleccionan en función del marcador de superficie celular CD90.1, coexpresado a partir del transgén que contiene sgRNA. Las células reactivadas se clasifican según la expresión de GFP (por ejemplo, 8 días). b) Experimento de curso de tiempo para una pantalla CRISPR utilizando ChromMM o biblioteca de control realizada con tres clones independientes. Las barras de error indican el error estándar de la media. cd) Análisis de citometría de flujo de líneas celulares transducidas con la biblioteca dirigida a la cromatina frente a la biblioteca de control no dirigida en suero y 2i, respectivamente. El eje indica el porcentaje de células positivas para GFP en la población de la pantalla CRISPR.

a) Gráfico de rango para pantallas en condiciones de suero. La línea horizontal discontinua indica el umbral del valor p de 0,05. Los valores P se obtuvieron utilizando MAGeCK RRA (agregación de rango robusta). Los puntos rojos indican factores de heterocromatina conocidos asociados con la regulación de ICR, los puntos azules indican genes encontrados en múltiples pantallas y los puntos verdes indican los controles positivos. b) Descripción general de los aciertos de CRISPR para las líneas celulares reporteras Airn y Kcnq1ot1 cultivadas en condiciones 2i. La línea horizontal discontinua indica el umbral del valor p de 0,05 obtenido mediante MAGeCK RRA (agregación de rango robusta). c) Gráfico de rango para pantallas en condiciones 2i. La línea horizontal discontinua indica el umbral del valor p de 0,05 obtenido mediante MAGeCK RRA (agregación de rango robusta). d) Descripción general de los aciertos de CRISPR utilizando la biblioteca EpiTF en la línea celular reportera Airn cultivada en suero. La línea horizontal discontinua indica el umbral del valor p de 0,05 obtenido mediante MAGeCK RRA (agregación de rango robusta). e) Gráfico de rango para la pantalla usando el reportero Airn pEF1a en suero usando la biblioteca EpiTF. La línea horizontal discontinua indica el umbral del valor p de 0,05 obtenido mediante MAGeCK RRA (agregación de rango robusta). f) Validación de candidatos potenciales utilizando transfecciones individuales de ARN guía contra el gen indicado. La expresión de GFP se midió 12 días después de la transfección. Las transfecciones se realizaron en réplicas técnicas. Los candidatos potenciales fueron seleccionados con una guía independiente y una guía de la biblioteca ChromMM. Los datos muestran el porcentaje de células positivas en grupos después de la selección de CRISPR. g) Representación en la red para todos los candidatos potenciales utilizando la base de datos STRING. El borde rosa indica interacciones determinadas experimentalmente; el borde cian indica interacciones conocidas de bases de datos seleccionadas. Los bordes verde, rojo y azul indican interacciones predichas basadas en la vecindad de genes, la fusión de genes y la coocurrencia de genes, respectivamente. Los bordes amarillo y negro son interacciones predichas basadas en minería de texto y coexpresión, respectivamente.

a) Análisis de superposición de picos que muestra el porcentaje de picos de ZMYM2 o ATF7IP que coinciden con SETDB1, ZFP57 o sitios genómicos unidos por ZFP57 y SETDB1. b) Mapa de calor que indica la unión de ZMYM2 en los picos de ZMYM2 y separados por picos que superponen SETB1 y picos independientes de SETB1. Se muestra la señal H3K9me3 ChIP-seq para los mismos conjuntos de picos. c) Análisis de metilación de WGBS en picos independientes de ZMYM2 y ATF7IP (N = 159). Los picos de ZMYM2 están separados por sitios que se superponen (N = 4201) y no se superponen (N = 10292) con SETDB1. Los diagramas de caja denotan el rango intercuartílico como una caja (IQR) y los valores más bajo y más alto dentro del rango de 1,5 x IQR alrededor de la caja como bigotes. d) ChIP-qPCR para la unión de ATF7IP y ZMYM2 en el Airn ICR endógeno en células de tipo salvaje y Zfp57-KO. El enriquecimiento de ChIP se normaliza a una entrada del 5 % y se calibra en un sitio genómico de fondo (intergénico). Se muestran réplicas técnicas independientes. e) Gráficos de volcán que indican proteínas enriquecidas en ZFP57_dZNF-TurboID (solo dominio KRAB) sobre una línea celular TurboID de fondo (nTurbo). Se indican las proteínas enriquecidas estadísticamente (prueba t de dos colas corregida por FDR: FDR = 0,05, s0 = 1, n = 4 réplicas técnicas). f) Niveles de expresión de ZFP57, ATF7IP y ZMYM2, medidos en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario temprano. Se muestran las lecturas normalizadas de RPKM obtenidas de la ref. 73. g) Detección por inmunotransferencia de ATF7IP y ZMYM2 en células de tipo salvaje y KO utilizando anticuerpos específicos. Lamin B1 se utiliza como control de carga. El asterisco indica el clon Zmym2-KO utilizado para el análisis WGBS. El experimento se repitió al menos tres veces. Marcadores de peso molecular están indicados.

Datos fuente

a) Diagramas de caja que indican la metilación promedio del ADN en todos los CpG cubiertos al menos 10 veces en el genoma del ratón. El rango intercuartílico se muestra como un recuadro (IQR) y los valores más bajo y más alto dentro del rango de 1,5 x IQR alrededor del recuadro como bigotes. Se indica el número de CpG independientes analizados. b) Los controles de conversión de bisulfito del ADN del fago T7 metilado y Lambda añadido muestran una conversión completa de las moléculas de ADN. El rango intercuartílico se muestra como un recuadro (IQR) y los valores más bajo y más alto dentro del rango de 1,5 x IQR alrededor del recuadro como bigotes. Se indica el número de CpG independientes analizados. c) Análisis de datos WGBS de todos los ICR anotados en mESC de tipo salvaje, Atf7ip-KO y Zmym2-KO. d) Perfiles de metilación individuales de experimentos de secuenciación de bisulfito dirigidos para Airn, Kcnqot1 y Peg10 ICR en mESC de tipo salvaje, Atf7ip-KO y Zmym2-KO. Se muestrearon aleatoriamente 1000 amplicones por muestra para una mejor visualización. e) Mapa de calor que muestra H3K9me3 en todos los ICR en mESC de tipo salvaje, Atf7ip-KO y Zmym2-KO. Se muestran las lecturas normalizadas de la biblioteca por 20 pb.

Tabla complementaria que contiene información adicional y valores numéricos relacionados con pantallas CRISPR, experimentos bioID MS e información de secuencias de ADN.

Gel de ADN sin recortar.

Western blots sin recortar.

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Reimpresiones y permisos

Butz, S., Schmolka, N., Karemaker, ID et al. La secuencia de ADN y los modificadores de cromatina cooperan para conferir biestabilidad epigenética en las regiones de control de impresión. Nat Genet 54, 1702-1710 (2022). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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Recibido: 10 junio 2021

Aceptado: 19 de septiembre de 2022

Publicado: 04 noviembre 2022

Fecha de emisión: noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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Epigenética y cromatina (2023)