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Oct 18, 2023

Vacunación con una T del VIH

npj Biopelículas y Microbiomas

npj Biofilms and Microbiomes volumen 8, Número de artículo: 104 (2022) Citar este artículo

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La microbiota intestinal está emergiendo como un factor crucial que modula las respuestas a las vacunas; sin embargo, pocos estudios han investigado si las vacunas, a su vez, pueden alterar la microbiota y en qué medida dichos cambios pueden mejorar la eficacia de la vacuna. Para comprender el efecto de la vacunación de células T en el microbioma intestinal, administramos un inmunógeno de células T del VIH-1 (brazo HTI) o PBS (control, brazo simulado) a ratones C57Bl/6 siguiendo un esquema heterólogo de inducción y refuerzo. La dinámica longitudinal de la microbiota intestinal de los ratones se caracterizó mediante la secuenciación del ARN ribosomal 16 S en muestras fecales recolectadas de jaulas, así como de tres secciones intestinales (ciego, intestino delgado y grueso). Se obtuvieron células séricas y de bazo en el último momento del estudio para evaluar los correlatos inmunitarios mediante ensayos IFNγ ELISPOT y citoquinas Luminex®. En comparación con Mock, los ratones vacunados con HTI estaban enriquecidos en géneros Clostridiales (grupo Eubacterium xylanophilum, Roseburia y Ruminococcus) conocidos como principales contribuyentes de metabolitos antiinflamatorios, como los ácidos grasos de cadena corta. Dicho cambio se observó después de la primera dosis de HTI y se mantuvo durante todo el seguimiento del estudio (18 semanas). Sin embargo, los géneros Clostridiales enriquecidos fueron diferentes entre heces y secciones intestinales. La abundancia de bacterias enriquecidas en animales vacunados se correlacionó positivamente con respuestas de células T específicas de HTI y un conjunto de citocinas proinflamatorias, como IL-6. Este análisis longitudinal indica que, en ratones, la vacunación con células T puede promover un aumento en las bacterias intestinales conocidas por producir moléculas antiinflamatorias, que a su vez se correlacionan con las citoquinas proinflamatorias, lo que sugiere una adaptación del medio microbiano intestinal a las células T inducidas. inflamación sistémica.

Está bien establecido que la microbiota gastrointestinal residente juega un papel fundamental en el desarrollo y la regulación de las respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas1. De los diferentes determinantes de la respuesta inmunitaria adaptativa, la polarización de la respuesta de las células T podría verse especialmente afectada por la composición de las bacterias intestinales2. De hecho, la ausencia de bacterias específicas se ha asociado con frecuencias reducidas de células Treg en el intestino3 o respuestas desreguladas de células Th17 en ratones libres de gérmenes y tratados con antibióticos4. Las proporciones anormales de estas subpoblaciones de células T (Th17 y Treg) se han asociado frecuentemente con enfermedades metabólicas o inmunológicas5.

Dada la estrecha interacción y la coevolución de la microbiota intestinal y el sistema inmunitario6, cada vez más pruebas sugieren que ciertos taxones bacterianos también podrían modular las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna7, ejerciendo efectos locales o sistémicos8. En los últimos años, varios estudios clínicos y en animales han demostrado que la composición y las funciones de la microbiota intestinal son determinantes cruciales de la inmunogenicidad y eficacia de las vacunas orales e inyectables9,10. Hasta ahora, la mayor parte del trabajo en esta área se ha centrado en el papel de la microbiota en la modulación de las respuestas de anticuerpos inducidas por vacunas7. Es de destacar que la importancia de la inmunidad mediada por células T se reconoce cada vez más en la protección inducida por varias estrategias de inmunización, incluidas aquellas contra patógenos como el VIH-111 o el SARS-CoV-212. Sin embargo, un número limitado de estudios ha investigado directamente la relación entre la microbiota intestinal preexistente y las respuestas de las células T a la vacunación13.

El efecto de la administración de vacunas en la microbiota intestinal ha atraído aún menos atención. Trabajos anteriores que investigaron los efectos de las vacunas contra el VIH-114,15 y la fiebre tifoidea16 oral en la microbiota intestinal humana no informaron perturbaciones perceptibles de la estructura de la comunidad microbiana inducida por la vacunación. Por el contrario, se observó un aumento en la relación Firmicutes/Bacteroidetes después de la inmunización con ADN/proteína del VIH-1 en el microbioma rectal de primates no humanos17. Además, un estudio reciente que comparó dos estrategias de vacunación contra el SARS-CoV-2 informó cambios en la microbiota intestinal humana 1 mes después de la inmunización, caracterizados por una menor diversidad alfa y una mayor abundancia de ciertas especies bacterianas, como Bacteroides caccae18. En conjunto, esto proporciona al menos evidencia circunstancial de que la vacunación puede influir en la microbiota residente. Por lo tanto, comprender cómo las vacunas promueven cambios en el medio inmunitario intestinal del huésped y alteran la estructura de la comunidad microbiana puede proporcionar información importante sobre esta interacción y, a su vez, la identificación de bacterias específicas que modulan positivamente el resultado de la vacunación.

En el presente estudio, se utilizaron vectores que expresan el inmunógeno de células T (HTI) del VIH-119,20 para evaluar los cambios inducidos por la vacuna en la microbiota intestinal y para identificar correlaciones potenciales con la respuesta inmunológica a la vacunación en un modelo murino. La inmunogenicidad de HTI se ha probado tanto en ratones21,22 como en humanos23 utilizando diferentes vectores de vacunas (como ADN, adenovirus de chimpancé, ChAdOx1; virus de la vacuna modificada Ankara, MVA y bacilo Calmette-Guérin, BCG). En base a esta evidencia previa, se seleccionaron la cepa de ratón C57Bl/6 y un cebado de tres ADN seguido de un refuerzo de ChAdOx.1-MVA para lograr la máxima inmunogenicidad. La secuenciación del gen 16S rRNA se usó para caracterizar el microbioma fecal longitudinal y los perfiles de contenido intestinal en ratones que recibieron un régimen de inmunización HTI de refuerzo-primación o PBS (grupo de control). También se evaluaron las correlaciones entre las firmas microbianas intestinales, la respuesta a la vacuna de células T y las citoquinas después de la inmunización completa.

Para investigar los efectos de la vacunación HTI en la microbiota intestinal, se compararon dos grupos experimentales que recibieron el inmunógeno HTI (inmunizados, n = 20) o PBS (simulado, n = 20) (Fig. 1). Las muestras fecales se recolectaron longitudinalmente de jaulas y de tres secciones intestinales para el perfil del microbioma intestinal; Se obtuvieron suero y esplenocitos al final del estudio para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna y los perfiles de citoquinas, respectivamente (Figura 1 complementaria). Dos semanas antes de la vacunación, la microbiota intestinal de los ratones se homogeneizó mediante acondicionamiento con antibióticos seguido de transferencia de microbiota fecal (FMT) de ratón a ratón para reducir la variabilidad inicial, como se detalla en el texto complementario y la figura complementaria 2. Características basales del ratón a la llegada del animal ( -3w; Tablas complementarias 1 y 2) y prevacunación (0w; Tabla 1 y Tabla complementaria 3) se informan.

Se inmunizaron ratones machos y hembras con una vacuna de células T contra el VIH (tres cebadores de ADN.HTI seguidos de un refuerzo de ChAd.HTI y MVA.HTI; n = 20) o una vacuna simulada (PBS; n = 20). El acondicionamiento con antibióticos seguido de la transferencia de microbiota fecal se realizó antes de la vacunación para homogeneizar el contenido intestinal en todos los animales. La recolección de muestras, incluidas las heces, el contenido luminal, el suero y el bazo, se completó en los puntos de tiempo indicados. Abreviaturas: transferencia de microbiota fecal FMT, antibiótico Atb, solución salina tamponada con fosfato PBS. La figura se generó en parte utilizando Servier Medical Art, proporcionado por Servier, con licencia Creative Commons Attribution 3.0 unported.

Las muestras longitudinales simuladas e inmunizadas no tuvieron diferencias en la cantidad de lecturas filtradas de alta calidad, con una mediana de 52 092 y 46 584 lecturas, respectivamente (Figura complementaria 3a y Tabla S4). Los controles de extracción negativa (n = 12) y PCR sin plantilla (n = 11) tuvieron un número significativamente menor de lecturas (5966 y 1444 número medio de lectura, respectivamente) en comparación con los grupos experimentales (Fig. 3a complementaria). A pesar de que la profundidad de secuenciación fue mayor en el lote 1 (Fig. 3b complementaria), no se observó un impacto sustancial en la estructura de datos después de evaluar las diferencias entre los dos lotes (Fig. 4 complementaria) (el lote se incluyó como una covariable en la prueba de fecal agrupada). muestras recogidas en jaulas).

Antes de la vacunación, las muestras mostraron una composición bacteriana similar (semana 0, Fig. 2 complementaria) y solo el género A2 aumentó en el grupo simulado (Fig. 5a complementaria). Después de segregar por sexo, los ratones hembra mostraron una mayor abundancia de Lactobacillus y Muribaculum antes de la vacunación (Fig. 5b complementaria).

A nivel familiar, la composición general de la comunidad microbiana entre los grupos simulado e inmunizado fue similar durante el experimento (Fig. 2a). Las muestras de contenido fecal y luminal estuvieron dominadas por Muribaculaceae (49,8 % y 57,9 %), Lachnospiraceae (14,2 % y 11,4 %), Bacteroidaceae (9,4 % y 4,8 %) y Bifidobacteriaceae (7,1 % y 6,2 %) (Fig. 2a y Fig. 6a complementaria), excepto el intestino delgado (Fig. 6b complementaria). En esta sección del intestino, la reducción en el grupo Lachnospiraceae NK4A136 (0,2 %) y Bacteroides (0,05 %) fue concomitante con un aumento general en Lactobacillus (7,7 %) y Ligilactobacillus (3,7 %) (Figura complementaria 6c, d). A pesar de las similitudes en la composición general durante la administración de la vacuna (semana 0-15, Fig. 2a y Fig. 6e complementaria), las muestras se agruparon por separado por grupo experimental (p = 0,022), pero no por punto de tiempo dentro de cada grupo (p = 0,594) ( Fig. 2b), como lo indican los análisis univariados y multivariados (Tabla complementaria 5). Las covariables de jaula y sexo también mostraron un impacto significativo en la composición de la microbiota (Tabla complementaria 5). A pesar de la falta de contribución a nivel individual en nuestras evaluaciones, se observó una tendencia hacia una mayor disimilitud de Bray-Curtis en el grupo inmunizado en comparación con el grupo simulado (Fig. 6f complementaria), lo que podría indicar un fuerte impacto en la microbiota intestinal de los ratones vacunados. Además, no se observaron diferencias en la diversidad alfa (índice de Shannon) entre los grupos durante la vacunación (Fig. 6g complementaria). También se observó agrupación por grupo experimental (p = 0,021) y sección intestinal (p = 0,001) en el último momento del estudio, siendo las muestras de intestino delgado separadas de las de ciego e intestino grueso (Fig. 2c). Además, las muestras del intestino delgado mostraron una diversidad alfa más baja en los grupos simulado e inmunizado en comparación con el ciego y el intestino grueso, aunque no se detectaron diferencias entre los dos grupos experimentales (Fig. 2d).

un gráfico de barras apiladas que muestra la abundancia relativa de familias bacterianas (las 15 más abundantes) en diferentes momentos en ratones vacunados con HTI (inmunizados) o vacunados con PBS (simulados). CageID (heces agrupadas) y muestras individuales para cada jaula (contenido intestinal) se informan en el eje x. PCoA biplot basado en los componentes primero y segundo (distancias Bray-Curtis a nivel de género) de (b) muestras fecales de jaulas (c) y de secciones intestinales (intestino delgado, ciego e intestino grueso). Los biplots informan géneros con los 5 efectos principales en la composición de la comunidad, con la posición del vector que indica la dirección del efecto. Se dibujaron elipses arbitrarias para facilitar la interpretación de la figura. Se muestran los valores r-cuadrado y p de PERMANOVA. d Diversidad alfa basada en el índice de entropía de Shannon (nivel ASV) de muestras fecales individuales obtenidas en el último punto del estudio del intestino delgado, ciego e intestino grueso. Los diagramas de caja están coloreados por el grupo experimental. Los valores medianos y los rangos intercuartílicos se muestran en diagramas de caja. Se informan los valores de p de las pruebas de rango con signo de Wilcoxon.

El análisis discriminante longitudinal mostró que la abundancia de bacterias específicas cambió después de la vacunación. Si bien solo el género A2 fue diferencialmente abundante entre los grupos experimentales en la línea de base (Fig. 5a complementaria), el grupo inmunizado mostró un enriquecimiento en un conjunto de géneros Clostridiales después de la vacunación (Fig. 3). La observación más notable fue un enriquecimiento en Ruminococcus en muestras fecales de jaulas (semanas 3 a 15) y Roseburia en secciones intestinales (ciego e intestino grueso), mientras que el grupo Eubacterium xylanophilum se mantuvo consistentemente más alto en muestras fecales de jaulas y secciones intestinales después de la semana 3 Además, Ligilactobacillus se incrementó específicamente en muestras del intestino delgado (Fig. 3). La evaluación longitudinal de la abundancia de tales géneros indicó una tendencia creciente a partir de la vacunación en el grupo inmunizado (Fig. 7 complementaria). Por el contrario, ningún género específico fue consistentemente más alto en el grupo Mock a lo largo del tiempo.

Análisis LEfSe que compara la abundancia relativa de géneros bacterianos entre los grupos inmunizados y simulados durante la administración de la vacuna (muestras fecales agrupadas en la semana 3, semana 9, semana 6 y semana 15) y al final del estudio en la semana 15 para muestras fecales individuales del intestino delgado, ciego e intestino grueso. Las barras horizontales representan el tamaño del efecto para cada género discriminante (p < 0,05 y puntuaciones LDA > 2,0). La longitud de la barra representa la puntuación LDA transformada log10, indicada por líneas verticales.

Para examinar la inmunogenicidad de HTI, se realizó un ensayo de IFNγ que evalúa la magnitud y amplitud de la respuesta específica de células T contra péptidos de HTI en esplenocitos recolectados en el último momento del estudio. No se encontraron diferencias en los esplenocitos productores de IFNγ de fondo entre los ratones simulados e inmunizados, lo que indica que el régimen de vacunación no indujo una activación de células T inespecífica notable (Fig. 8a complementaria). Después de la reestimulación específica con conjuntos de péptidos que cubren la secuencia HTI, el grupo simulado no mostró ninguna respuesta de IFNγ por encima de los umbrales. Por el contrario, los ratones inmunizados mostraron fuertes respuestas, tanto en magnitud (mediana = 1560 IFN-γ SFC/millón de esplenocitos, p = 0,00031, Fig. 8b complementaria) como en amplitud (mediana = 8,0 de 17 grupos positivos, p = 0,00028, Complementaria). Fig. 8c) en comparación con Mock.

Después de evaluar los niveles séricos de 22 citoquinas en los grupos simulado e inmunizado (Fig. 9a complementaria), la IL-6 fue la única citoquina que mostró una tendencia creciente en el grupo inmunizado después de la segregación por sexo (p = 0,052) (Fig. 9b complementaria), aunque la significancia no pasó la corrección de prueba múltiple (p = 0,69 ajustada por BH). Específicamente, las mujeres del grupo inmunizado mostraron niveles más bajos de IL-6 que los hombres en los grupos inmunizados y simulados (Figura complementaria 9b). A continuación, examinamos los posibles vínculos entre las respuestas específicas de HTI, los niveles de citoquinas séricas y los géneros bacterianos discriminantes. El grupo Eubacterium xylanophilum y Roseburia de las tres secciones intestinales se correlacionaron positivamente con la respuesta de células T específicas de HTI inducida por la vacuna (Fig. 4), medida como magnitud y amplitud. Además, la mayoría de las citocinas analizadas mostraron correlaciones positivas con el grupo Eubacterium xylanophilum, Roseburia y Ruminococcus, aunque hubo algunas excepciones (es decir, IL-33). Se observó una tendencia opuesta para Ligilactobacillus, que en general mostró asociaciones negativas con los niveles de citoquinas séricas (Fig. 4). Cabe destacar que la IL-6 se asoció positivamente con el grupo Eubacterium xylanophilum, Ruminococcus y especialmente Roseburia en el intestino grueso. Además, Roseburia mostró correlaciones positivas con otras citocinas, incluidas GM-CSF, IL-2, IFNγ, IL-17A e IL-25 (intestino delgado), IL-27 (ciego e intestino grueso) e IL-22 (intestino grueso) . Las correlaciones significativas se confirmaron mediante diagramas de dispersión individuales (Figura 10 complementaria). Además, el grupo Eubacterium xylanophilum, Roseburia y Ruminococcus de los tres compartimentos intestinales se agruparon cerca de las respuestas específicas de HTI (magnitud y amplitud) en un agrupamiento jerárquico, y también mostraron asociaciones positivas con un grupo de citoquinas (Fig. 11 complementaria).

Correlaciones de rango de Spearman entre géneros bacterianos (solo se evaluaron bacterias enriquecidas longitudinalmente en ratones inmunizados con HTI), inmunogenicidad de HTI (magnitud y amplitud de la respuesta) y niveles de citoquinas en suero. Las asociaciones se evalúan para cada sección del intestino (intestino delgado, ciego e intestino grueso). Las citocinas para cada sección del intestino se ordenan en función de la agrupación jerárquica no supervisada. El color y el tamaño del cuadrado representan la magnitud de la correlación. La significación se indica mediante asteriscos blancos (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 después del ajuste de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples).

Hasta la fecha, estudios limitados han investigado cómo la administración de vacunas puede alterar las comunidades microbianas intestinales residentes. Aquí, utilizamos un régimen de refuerzo que combina el inserto de HTI en diferentes vectores de vacunas, para inducir fuertes respuestas específicas de HTI y estudiar su impacto en la microbiota. Estos resultados mostraron, en ratones, un aumento de bacterias Clostridiales después de la inmunización con células T del VIH, que a su vez se asocian con citoquinas proinflamatorias. A excepción del grupo Eubacterium xylanophilum, los géneros de Clostridiales encontrados en las heces fueron diferentes de los de las tres secciones intestinales del grupo inmunizado. Estas diferencias podrían estar relacionadas con la presencia de distintas especies en el epitelio intestinal en comparación con la luz24 y la presencia de un 50-60 % de bacterias formadoras de esporas, como Ruminococcaceae y Lachnospiraceae, que probablemente estén presentes en las heces25. Sorprendentemente, las asociaciones entre las bacterias enriquecidas y las citocinas séricas variaron en las tres secciones intestinales, siendo representativas de distintos requisitos de oxígeno y una diafonía diferente entre las células de la mucosa y las comunidades microbianas coexistentes26. La diferencia más destacada se observó en el intestino delgado, que estaba agotado de bacterias anaerobias obligadas, como Ruminococcacae y Lachnospiraceae, en comparación con el ciego y el intestino grueso, como se informó anteriormente27.

Respaldando nuestros resultados, un estudio reciente en macacos rhesus mostró que la vacunación con tres vacunas de plásmido de ADN que expresan Env del VIH-1 seguida de un refuerzo de la proteína gp140 indujo cambios en la microbiota rectal, lo que resultó en un aumento de la relación Firmicutes/Bacteroidetes, así como asociaciones de anticuerpos antirretrovirales rectales. -Respuestas a la vacuna IgG del VIH-1 con aumento de Clostridium IV y reducción de Prevotella17. También se reportó enriquecimiento en Ruminococcus en la microbiota intestinal de lechones después de la inmunización con la vacuna Lawsonia intracellularis28. Paralelamente, se encontró una mayor abundancia de Bacteroides junto con alteraciones en la estructura de la comunidad microbiana después de la administración de la vacuna Mtb (con ESAT6 adyuvada con agonistas de TLR8) en ratones29. De igual forma, se reportó un enriquecimiento en Bacteroides caccae y una reducción en especies de clostridios, como Coprococcus comes, Dorea longicatena y Ruminococcus obeum en vacunados de Covid-1918. Tales tendencias aparentemente conflictivas indican que se necesita una comprensión más profunda para descifrar cambios microbianos específicos inducidos por distintas estrategias de inmunización.

Nuestros datos indicaron que las bacterias aumentaron después de la vacunación con HTI (grupo Eubacterium xylanophilum, Roseburia y Ruminococcus), ubicadas en las tres secciones intestinales distintas, correlacionadas positivamente con la respuesta de células T específicas de HTI y un grupo de citocinas séricas. Específicamente, el género Roseburia, conocido como una bacteria productora de butirato30, en el ciego y el intestino grueso, se correlacionó positivamente con la magnitud y amplitud de la respuesta de las células T específicas de HTI en las células del bazo. A nivel sérico, Roseburia se correlacionó con IL-27, que es producida por células presentadoras de antígenos y regula las células B y T31. Curiosamente, a pesar de su diferente función efectora, la IL-27 comparte la subunidad del receptor gp130 con la IL-632 y tanto las citoquinas como la IL-22 se asociaron con el contenido de Roseburia en el intestino grueso. Aunque los niveles de Roseburia en el intestino delgado no se correlacionaron con las respuestas de células T específicas de HTI, se observaron fuertes correlaciones con citocinas inflamatorias (IL-6, GM-CSF), dos citocinas de polarización Th1 (IFNγ e IL-2) y Th17. citocinas de polarización (IL-17A e IL-22). Sin embargo, ninguna de estas citocinas se produjo de manera diferencial entre el grupo simulado y el grupo inmunizado y solo la IL-6 mostró una importancia marginal, que no pasó la corrección de comparación múltiple. Presumimos que la abundancia de Roseburia puede aumentar debido a la estimulación de la vacuna de células T y relacionarse con las respuestas Th1, como lo indica la correlación positiva con IFNγ e IL-2 en plasma, pero más notablemente con las respuestas de células T específicas de HTI en células de bazo. El aumento de Roseburia también puede estar relacionado con la presencia de mediadores de la inflamación como la IL-633, probablemente producida después de la vacunación y las citocinas Th17 (IL-17A e IL-22) en el suero, que podrían estar afectando las respuestas inmunitarias de las mucosas en el intestino. Clostridiales géneros adicionales productores de butirato34 enriquecidos en animales vacunados mostraron correlaciones positivas con las respuestas de células T específicas de HTI (grupo Eubacterium xylanophilum en intestino delgado y ciego) y los niveles séricos de IL-6 (grupo Ruminococcus y Eubacterium xylanophilum en intestino grueso). Además, aunque Ligilactibacillus no se asoció con las respuestas de las células T, las correlaciones con las citocinas representativas de la población Th17 y Treg (IL-10 e IL17A), conocidas como biomarcadores de inflamación intestinal35, podrían indicar cambios específicos en la composición de la microbiota. Si bien el mecanismo exacto por el cual la inmunización con HTI induciría cambios en el medio intestinal y promovería un aumento de bacterias específicas aún no está claro, la señalización de citoquinas después de la inmunidad innata y la activación de células T por vacunación es una hipótesis plausible. De hecho, la administración intramuscular de la vacuna puede inducir un efecto de depósito local. Esta consiste en una liberación prolongada de antígenos en el sitio de inyección, que inducen una estimulación persistente del sistema inmunitario y el reclutamiento de macrófagos que, a su vez, desencadenan la activación de mediadores inflamatorios36. Es de destacar que la administración de vectores de vacunas virales ricos en patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), como se usa en este estudio, también puede desencadenar la activación de los receptores de reconocimiento de patógenos (PRR), estimulando la producción de citocinas proinflamatorias, como IL- 1 y TNF-α por células dendríticas y macrófagos37. Los mediadores de la inflamación pueden luego migrar a través del torrente sanguíneo y los vasos linfáticos para alcanzar los tejidos intestinales y promover cambios locales en la respuesta inmune y, a su vez, alterar la estructura de la microbiota asociada38. Además, las células inmunitarias, como las células dendríticas o las células T reguladoras, activadas en el sitio de la infección, pueden mediar en la señalización inflamatoria a los ganglios linfáticos, incluidos los ganglios linfáticos mesentéricos o las placas de Peyer39.

En particular, las bacterias correlacionadas con citocinas proinflamatorias (como IL-6, IL-27 e IFNγ) en nuestro estudio (Roseburia, Ruminococcus y Eubacterium) se conocen como principales contribuyentes de metabolitos antiinflamatorios, principalmente ácidos grasos de cadena corta (AGCC). ), en el intestino40. Este hallazgo puede parecer inconsistente con la evidencia previa, como en las enfermedades inflamatorias del intestino, en las que los AGCC inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias41; aunque, varios mecanismos por los cuales las bacterias comensales pueden adaptarse al ambiente intestinal inflamado se han discutido en otra parte42. Por ejemplo, se ha implicado a componentes específicos de la microbiota intestinal en la producción de citocinas pleiotrópicas por parte de las células inmunitarias innatas, como la IL-6, y la posterior expansión de las células Th1743, que son fundamentales para las respuestas inmunitarias de memoria inducidas por la vacuna44. Además, la flagelina y los peptidoglicanos producidos por las bacterias intestinales, como Ruminococcus spp.45, pueden detectarse mediante receptores de reconocimiento de patrones (PRR) expresados ​​por las células T y las células B y actúan como adyuvantes naturales de las vacunas7. De hecho, una mayor abundancia de bacterias con flagelos y fimbrias, incluidas las que producen butirato, como Roseburia y Eubacterium, pueden aumentar la inmunogenicidad de la vacuna sirviendo como adyuvantes a través de agonistas TLR inmunomoduladores46.

En particular, los miembros de estos grupos bacterianos, como Roseburia intestinalis y Eubacterium hallii, han sido incluidos como candidatos a probióticos por la Asociación Científica Internacional de Probióticos y Prebióticos47. De hecho, se ha demostrado que algunas bacterias productoras de butirato, incluidas las identificadas en este estudio, modulan el metaboloma luminal del colon, regulan las respuestas de las células T y mejoran las funciones reguladoras de las células T48. En conjunto, estos datos impulsaron la hipótesis de que las bacterias que producen moléculas antiinflamatorias pueden adaptarse al aumento de la inflamación local después de la vacunación, colonizar el medio intestinal y prosperar en él, modulando y apagando así los procesos inflamatorios. Sin embargo, se necesita más trabajo para comprender cómo la inflamación inducida por la vacuna promueve un aumento de bacterias antiinflamatorias en el intestino. En este contexto, el equilibrio de células Th17/Treg, la polarización de células T y los perfiles de activación, las respuestas de ILC y la relación Kyn/Trp49 en los tejidos intestinales son candidatos prometedores para futuras validaciones. Además, los enfoques ómicos adicionales, incluidas las mediciones de SCFA específicas y de metabolitos, ayudarían a identificar posibles vías antiinflamatorias inducidas después de la vacunación con HTI. Reconocemos plenamente la limitación del pequeño tamaño de la muestra y la falta de contribución a nivel individual en este estudio. Además, la falta de medición longitudinal de citocinas no nos permitió identificar variaciones temporales de los correlatos inmunitarios con firmas bacterianas específicas en cada etapa del régimen de vacunación. A pesar de que un grupo de bacterias mostró fuertes correlaciones con las respuestas de células T específicas de HTI, otra limitación fue que el diseño experimental no permitió diferenciar en qué medida los cambios en la microbiota inducidos por la vacuna se debieron a un efecto adyuvante de los vectores o a la inserción específica. respuestas Los experimentos futuros que incluyan un brazo de control que utilice vectores vacíos ayudarán a discriminar la contribución directa del inserto de la vacuna en los cambios en la microbiota intestinal. Además, otra limitación intrínseca fue la incapacidad de la secuenciación del gen 16 S rRNA para distinguir los organismos vivos de la colonización transitoria de microorganismos50. Finalmente, la especificidad del huésped de la microbiota intestinal central puede limitar la posible extrapolación de estos resultados de un modelo de ratón a humanos. Por lo tanto, se necesitan ensayos clínicos que incluyan la caracterización de la microbiota para validar tales hallazgos en la microbiota intestinal humana.

En resumen, nuestros datos sugieren que las bacterias intestinales pueden adaptarse a la inflamación inducida por la vacuna. Además, establecen un marco para futuros estudios a fin de capturar completamente la dinámica de los cambios microbianos a la vacunación de células T y, en última instancia, proporcionar nuevos objetivos potenciales para optimizar la eficacia de la vacuna.

Se compraron en Envigo ratones C57BL/6JOlaHsd de seis semanas de edad (n = 40, 20 hembras y 20 machos), criados en la misma instalación de reproducción, y alojados en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Centro de Medicina Comparada y Bioimage (CMCiB) animalario en el IGTP de Badalona, ​​España. Los ratones se asignaron aleatoriamente a jaulas de acuerdo con una combinación de sexo (hembra/macho) y grupo de tratamiento (simulado/inmunizado), con un máximo de 5 animales por jaula (Fig. 1 complementaria) y se les permitió aclimatarse durante una semana antes del tratamiento inicial. tratamiento.

Para reducir las posibles diferencias iniciales en la composición de la microbiota, la microbiota intestinal de los ratones se homogeneizó mediante acondicionamiento con antibióticos seguido de FMT de ratón a ratón (1 semana después de la llegada y 2 semanas antes de la vacunación). El tratamiento antibiótico consistió en una combinación de ampicilina, amikacina, metronidazol y vancomicina (10 mg/ml de cada antibiótico), administrados por sonda oral (200 µl/animal) durante 5 días antes del FMT. Se usaron heces mixtas de cinco ratones donantes machos y cinco hembras (jaulas MF1 y MM1, Fig. 1 complementaria) para FMT en todos los animales del estudio. Brevemente, las heces de los donantes se recolectaron, agruparon, dividieron en alícuotas (viales de 350 mg) y se conservaron a -80 °C hasta su uso. El día de la transferencia fecal, las heces descongeladas se resuspendieron en suero salino fisiológico estéril (2,3 ml por vial), se homogeneizaron, se centrifugaron (500 × g, 1 min) y se administró el sobrenadante por sonda oral (100 µl/animal). La carga bacteriana en FMT se midió utilizando el kit de recuento y viabilidad bacteriana LIVE/DEAD® BacLight™ (Invitrogen, Carlsbad, MA, EE. UU.).

Los animales fueron vacunados con el inmunógeno de células T del VIH (HTI), una proteína sintética diseñada como la fusión de diferentes fragmentos de proteínas del VIH-1 asociados con el control de la infección por el VIH por parte de las células T20. Brevemente, la secuencia HTI codifica para un inmunógeno de 529 aminoácidos, diseñado como la concatenación de 16 fragmentos de proteínas Gag, Pol, Vif y Nef del VIH de consenso del clado B, que fueron dirigidos preferentemente por personas que mostraban un control natural de la infección por el VIH, unidos por tripletes de alanina. . La secuencia de aminoácidos se retrotradujo a nucleótidos, se optimizó el uso de codones para la expresión en humanos y se sintetizó el marco de lectura abierto (ORF) resultante para insertarlo en diferentes vectores22. En concreto, se insertó en un ADN plasmídico bajo el control de un promotor CMV (DNA.HTI, D) y en dos vectores virales: Chimpanzee Adenovirus Ox1 (ChAdOx1.HTI, C) y Modified Vaccinia Ankara (MVA.HTI, M) 22 La inmunogenicidad de la vacuna HTI se ha probado previamente en el modelo de ratón C57BL/6 y en primates no humanos22, así como en humanos23. En este estudio, se inmunizaron veinte ratones (10 hembras y 10 machos) por vía intramuscular (músculo caudal del muslo) con un régimen heterólogo de inducción y refuerzo que constaba de tres vectores de vacunas diferentes que expresaban HTI: (i) tres inmunizaciones de ADN.HTI (100 μg/animal ), (ii) un refuerzo con ChAd.HTI (1 × 109 VP/animal), y (iii) un segundo refuerzo con MVA.HTI (1 × 106 pfu/animal). Las vacunas DNA.HTI se administraron en las semanas 0, 3 y 6, seguidas de ChAd.HTI y MVA.HTI, separadas por un intervalo de 6 semanas (semanas 9 y 15, respectivamente) (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria) . Los ratones del grupo simulado (n = 20, 10 hembras y 10 machos) se vacunaron con PBS como grupo de control, siguiendo el mismo programa de inmunización.

Los datos de microbiota se generaron en dos lotes (muestras extraídas y secuenciadas en 2019 y 2020), como se ilustra en las figuras complementarias. 1 y 2. El primer lote de secuenciación incluyó muestras fecales agrupadas recolectadas longitudinalmente de jaulas, mientras que el segundo lote incluyó agrupaciones longitudinales de heces de jaulas y muestras fecales individuales obtenidas de diferentes secciones del tracto intestinal en el último momento del estudio. Se recolectaron muestras fecales longitudinales (un grupo por jaula, n = 5) a la llegada del animal (semana 3), después del condicionamiento con antibióticos antes de FMT (semana 2) y antes de cada vacunación (semanas 0, 3, 6, 9 y 15). ). La muestra fecal del grupo de donantes (semana 1) también se recolectó y secuenció en el lote 1. Tres semanas después de la última inmunización (semana 18), los ratones fueron sacrificados y los contenidos luminales de tres secciones intestinales (intestino delgado, ciego e intestino grueso), sangre completa y el bazo fueron recolectados. El suero se separó de la sangre completa mediante centrifugación (10 000 × g, 5 min) en tubos de Serum Gel S/1.1 (Sarstedt) y se congeló a -80 °C hasta su uso. Los esplenocitos se aislaron mediante ruptura mecánica y se presionaron a través de un filtro de células (Falcon) utilizando un émbolo de goma de jeringa de 5 ml. Después de la lisis de glóbulos rojos, los esplenocitos se lavaron, se resuspendieron en R10 (RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) y se crioconservaron en N2 líquido hasta su uso.

El ADN genómico de las muestras fecales y del contenido intestinal se extrajo con el QIAamp DNA Stool Kit, según las instrucciones del fabricante, y se almacenó a -80 °C hasta la secuenciación. La amplificación de la región hipervariable V3–V4 del gen 16 S rRNA se realizó utilizando cebadores universales flanqueados por adaptadores directos e inversos estándar (16S_F 5′-TCG TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG- 3′; 16S_R 5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3′) descrito en el protocolo Illumina MiSeq rRNA Amplicon Sequencing (San Diego, CA, EE. UU.). Las PCR se realizaron en un volumen de reacción de 25 μL, que contenía 2,5 μL de plantilla de ADN, 12,5 μL de KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase, tampón, MgCl2 y dNTP, KAPA Biosystems Inc., Wilmington, MA, EE. UU.) y 5 μL de cada cebador a 1 μM. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: paso inicial de desnaturalización a 95 °C por 3 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, hibridación a 55 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 30 s y una paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Una vez que se confirmó el tamaño esperado del amplicón en una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % (~460 pares de bases), los productos de la PCR se almacenaron a -30 °C hasta la preparación de la biblioteca de secuenciación. Se cargaron controles de extracción y PCR negativos (controles en blanco que utilizan agua sin ADN como plantilla) para evaluar la posible contaminación y se procesaron en las mismas condiciones que cualquier otra muestra. Las plantillas de ADN amplificadas se limpiaron con el reactivo AMPure XP (Beckman Coulter Life Sciences, Indianápolis, EE. UU.) para moléculas que no son de ADN y los adaptadores de secuenciación de Illumina y los índices duales se adjuntaron con el kit de índice Nextera XT (Illumina Inc.), seguido de un correspondiente Programa de amplificación por PCR como se describe en el protocolo MiSeq 16 S rRNA Amplicon Sequencing (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Después de la segunda ronda de limpieza, las bibliotecas de amplicones se cuantificaron con un kit de ensayo Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, MA, EE. UU.) y se diluyeron en concentraciones equimolares (4 nM) para una mayor agrupación. Las bibliotecas agrupadas se secuenciaron en una plataforma Illumina MiSeqTM (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) en las instalaciones centrales de genómica en el campus de investigación Germans Trias i Pujol (Badalona, ​​España) utilizando un protocolo de longitud de base 300 de extremo emparejado.

La calidad de los datos de secuenciación sin procesar se estimó mediante FastQC51 y el análisis de las secuencias de ARNr 16 S se realizó mediante la canalización DADA2 (v1.10.1)52. La tubería se ejecutó de acuerdo con los parámetros predeterminados usando maxEE = 4.10 en el paso de filtrado. Después de eliminar las lecturas quiméricas, se asignó una taxonomía a las variantes de secuencias de amplicón únicas (ASV) y se alinearon con la base de datos de genes SILVA rRNA53. Los análisis posteriores se realizaron en el entorno R (v3.5.2)54 utilizando varios paquetes, incluidos phyloseq (v1.26.1)55, vegan (v2.5-5)56 ade4 (v1.7-13)57 y ggplot2 (v3. 2.0)58. Los recuentos de ASV se normalizaron y transformaron en abundancia relativa utilizando la función phyloseq transform_sample_counts (100 × (x/sum(x))). La diversidad alfa (índice de entropía de Shannon) se evaluó utilizando la estimación_riqueza en recuentos de ASV enrarecidos. La diversidad beta se calculó en función de las distancias de Bray-Curtis (datos normalizados) y la matriz de distancia utilizada para realizar un análisis de coordenadas principales de ordenación (PCoA).

Los ensayos ELISPOT se realizaron utilizando el kit ELISPOT de IFNγ de ratón (ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, SE), siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Brevemente, los esplenocitos se descongelaron, lavaron, contaron (NucleoCounter® NC-3000, Chemometec), la densidad celular se ajustó con R10 a 4 × 105 células/pocillo y se sembraron en placas de polivinilideno de 96 pocillos (Millipore Corp., Bedford, MA), previamente recubierto con anticuerpo de captura de IFNγ (clon AN-18). Las células se estimularon con 17 grupos de péptidos específicos de HTI (concentración final de 14 μg/ml para cada péptido) durante 16 ha 37 °C en CO2 al 5 %. Se diseñó un conjunto de 147 péptidos superpuestos (OLP) de 15 aminoácidos de longitud, superpuestos en 11 aminoácidos y cubriendo toda la secuencia HTI, utilizando el algoritmo PeptGen (base de datos de VIH de Los Alamos) y sintetizado (Synepeptide). Para evaluar las respuestas a HTI, los OLP se ensamblaron en 17 grupos de péptidos separados que constaban de 7 grupos para Gag (8-11 péptidos/grupo), 7 para Pol (11 o 5 péptidos/grupo), 2 para Vif (8 y 6 péptidos/grupo). pool) y 1 para Nef (2 péptidos/pool). Se usó concanavalina A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO), a 5 µg/ml, como control positivo y R10 por triplicado como control negativo. Después de la estimulación, se revelaron las células formadoras de manchas (SFC) mediante la adición de un anticuerpo de detección de IFNγ biotinilado (clon R4-6A2), estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) y el kit de sustrato conjugado AP (Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CALIFORNIA). Los SFC por pocillo se contaron utilizando un sistema de lectura ELISPOT automatizado (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH) junto con el software ImmunoSpot y la magnitud de las respuestas se expresó como SFC por 106 esplenocitos. El umbral para respuestas positivas se definió como respuestas que eran al menos 50 SFC/106 células de bazo, la media de SFC/106 células de bazo en los pocillos de control negativo más 3 desviaciones estándar de los pocillos de control negativo, o tres veces la media de los pocillos de control negativo. cualquiera que fuera mayor. Los resultados se dieron como magnitud total (respuesta acumulada a todos los grupos; SFC/106 PBMC) y amplitud (número de grupos positivos).

Concentraciones de ligando CD40 (CD154), GM-CSF, IFN γ, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, IL-33, TNFα, TNFß al final del estudio ( semana 21 wpi) se midieron simultáneamente en sueros de ratones, en un solo lote. Brevemente, las muestras de suero se descongelaron, se agitaron con vórtex y se centrifugaron a 10000 xg durante 10 minutos antes de recolectar 25 µl de suero para realizar más pruebas. La concentración sérica de las 22 citoquinas se midió simultáneamente usando muestras duplicadas en un kit de panel de perlas magnéticas Th17 de ratón personalizado (Milliplex) y un lector Luminex® 200 (Luminex Corp), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las diferencias en la diversidad alfa y la abundancia de taxones entre los grupos experimentales se evaluaron utilizando el rango con signo de Wilcoxon y la prueba de Kruskal-Wallis (bilateral). Para la diversidad beta, la significación estadística se evaluó mediante la prueba de análisis de varianza multivariante permutacional por pares (PERMANOVA, adonis). El tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe)59 se realizó para identificar firmas bacterianas discriminantes entre los grupos simulado e inmunizado (α = 0,05 y puntuación LDA > 2,0). Las asociaciones entre las citocinas, la respuesta inmunitaria y las bacterias se calcularon en función de los coeficientes de correlación de Spearman en combinación con la corrección de pruebas múltiples de Benjamini-Hochberg utilizando la función rcorr dentro del paquete R/hmisc. Los análisis estadísticos se realizaron en el entorno R y el nivel de significancia del 5 % de dos colas (valor de p ≤ 0,05) se consideró significativo, a menos que se indique lo contrario.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las lecturas de secuenciación de 16 S rRNA sin procesar utilizadas en este estudio se han depositado en el depósito Sequence Read Archive (SRA) (Bioproject No. PRJEB52963).

Los scripts de análisis de R y los datos asociados con este documento están disponibles en https://doi.org/10.5281/zenodo.7017193.

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El proyecto recibió financiación del programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 847943 (MISTRAL) y fue patrocinado en parte por Grifols.

Estos autores contribuyeron por igual: Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Alex Olvera, Roger Paredes.

IrsiCaixa AIDS Research Institute, Badalona, ​​Spain

Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent, Maria Casadellà, Luis Romero, Tuixent Escribà, Mariona Parera, Francisco Catalán-Moll, Marco Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), Barcelona, ​​Catalonia, Spain

Luis Romero & Roger Paredes

Universidad de Vic-Universidad Central de Cataluña (UVic-UCC), Vic, Spain

Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Ciber de Enfermedades Infecciosas CIBERINFEC, ISCIII, Madrid, España

Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Institución Catalana de Investigación y Estudios Avanzados (ICREA), Barcelona, ​​Spain

quemador cristiano

AELIX Terapéutica, Barcelona, ​​España

quemador cristiano

Centro de Salud y Enfermedades Globales, Departamento de Patología, Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH, EE. UU.

Roger Paredes

Fundación Lucha contra las Infecciones, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​Catalonia, Spain

Roger Paredes

Department of Infectious Diseases, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​Catalonia, Spain

Roger Paredes

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MN-J., CB, AO y RP diseñaron el estudio y supervisaron la investigación. AB analizó los datos y escribió el manuscrito. AE-T. contribuido a la interpretación de datos y redacción del manuscrito. AE-T., MC y AO prepararon los experimentos con animales y recolectaron muestras. AE-T., MC y MP realizaron la extracción de ADN fecal, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. LR, TE y AO realizaron perfiles de citoquinas y determinaciones de respuesta inmune. FC-M., MN-J. y AB contribuyó al procesamiento, la gestión y el almacenamiento de datos. AB y AE-T. son co-primeros autores del manuscrito. AO y RP son co-autores correspondientes del manuscrito. Todos los autores editaron los borradores de manera crítica, revisaron el manuscrito y aprobaron la versión final tal como se envió.

Correspondencia a Alex Olvera o Roger Paredes.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Hospital Germans Trias i Pujol (IGTP) y la Generalitat de Catalunya (Número de proyecto: 10559).

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Reimpresiones y permisos

Borgognone, A., Elizalde-Torrent, A., Casadellà, M. et al. La vacunación con un inmunógeno de células T del VIH induce alteraciones en la microbiota intestinal del ratón. npj Biofilms Microbiomes 8, 104 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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Recibido: 25 Agosto 2022

Aceptado: 12 de diciembre de 2022

Publicado: 30 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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