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Oct 18, 2023

Soltero

Volumen de medicina BMC

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 161 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La tasa de respuesta objetiva de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico (mCRC) con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) con monoterapia de primera línea con la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) es solo del 40 al 45%. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) permite un análisis imparcial de la variedad completa de células que componen el microambiente tumoral. Por lo tanto, utilizamos scRNA-seq para evaluar las diferencias entre los componentes del microambiente entre los grupos resistentes a la terapia y los grupos sensibles a la terapia en MSI-H/mCRC deficiente en reparación de desajustes (dMMR). Los tipos de células y genes relacionados con la resistencia identificados por este análisis se verificaron posteriormente en muestras clínicas y modelos de ratón para revelar aún más el mecanismo molecular de la resistencia anti-PD-1 en MSI-H o dMMR mCRC.

La respuesta de las lesiones primarias y metastásicas a la monoterapia anti-PD-1 de primera línea se evaluó mediante radiología. Las células de lesiones primarias de pacientes con MSI-H/dMMR mCRC se analizaron usando scRNA-seq. Para identificar los genes marcadores en cada grupo, se identificaron distintos grupos de células y se sometieron a análisis de subgrupos. Luego, se construyó una red de interacción proteína-proteína para identificar genes clave. Se aplicaron inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para verificar genes clave y moléculas marcadoras celulares en muestras clínicas. Se realizaron inmunohistoquímica, PCR cuantitativa en tiempo real y transferencia Western para examinar la expresión de IL-1β y MMP9. Además, el análisis cuantitativo y la clasificación de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y las células T CD8+ se realizaron mediante citometría de flujo.

Las respuestas tumorales en 23 pacientes con MSI-H/dMMR mCRC fueron evaluadas por radiología. La tasa de respuesta objetiva fue del 43,48% y la tasa de control de la enfermedad fue del 69,57%. El análisis ScRNA-seq mostró que, en comparación con el grupo resistente al tratamiento, el grupo sensible al tratamiento acumuló más células T CD8+. Los experimentos con muestras clínicas y ratones indicaron que la infiltración de MDSC impulsadas por IL-1β y la inactivación de células T CD8+ contribuyen a la resistencia anti-PD-1 en MSI-H/dMMR CRC.

Las células T CD8+ y la IL-1β se identificaron como el tipo de célula y el gen, respectivamente, con la mayor correlación con la resistencia a anti-PD-1. La infiltración de MDSC impulsadas por IL-1β fue un factor significativo en la resistencia anti-PD-1 en CRC. Se espera que los antagonistas de IL-1β se desarrollen como un nuevo tratamiento para la resistencia a los inhibidores de anti-PD-1.

Informes de revisión por pares

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores malignos del tracto digestivo más comunes y tiene la segunda tasa de mortalidad más alta y la tercera tasa de incidencia más alta entre todos los tumores malignos [1]. Aunque las estrategias de diagnóstico y tratamiento del CCR han mejorado rápidamente en los últimos años, el pronóstico es desfavorable para muchos pacientes con CCR. Muchos pacientes no son diagnosticados hasta que ya se encuentran en etapas avanzadas de la enfermedad, lo que es un obstáculo importante para un tratamiento eficaz.

La expresión de proteínas relacionadas con la deficiencia de reparación de errores de emparejamiento (dMMR) y el estado de alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) ha sido ampliamente reconocida como valiosa para predecir la eficacia de la inmunoterapia en pacientes con CRC. En comparación con las terapias tradicionales contra el cáncer, la inmunoterapia ha mejorado la tasa de respuesta objetiva (ORR) de MSI-H mCRC hasta cierto punto [2, 3]. Sin embargo, la ORR de pacientes con MSI-H/dMMR mCRC con monoterapia de primera línea con proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) fue solo del 43,8 % [4]. Por lo tanto, más de la mitad de los pacientes no se benefician de la inmunoterapia o la quimioterapia ± terapia dirigida debido al fenotipo MSI-H [5]. En vista de esto, este estudio tiene como objetivo explorar el mecanismo de resistencia anti-PD-1 en pacientes con MSI-H mCRC.

ScRNA-seq ha contribuido a una mejor comprensión del panorama inmunológico en pacientes con MSI-H, lo que a su vez ha ofrecido nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la inmunoterapia. Los estudios anteriores se han centrado principalmente en el mecanismo de resistencia inmune en mCRC microsatélite estable (MSS). Varios estudios han revelado el mecanismo molecular de la terapia con antagonistas de CD40 y CD73 a nivel de una sola célula, proporcionando una posible base teórica para su tratamiento combinado con inhibidores de puntos de control inmunitarios para MSS mCRC [6,7,8]. Sin embargo, el mecanismo de resistencia a PD-1 en pacientes con MSI-H mCRC aún no está claro. Por lo tanto, la comparación del microambiente inmunitario entre los grupos resistentes a anti-PD-1 y los grupos sensibles a anti-PD-1 por scRNA-seq podría ayudar a dilucidar los mecanismos subyacentes a la resistencia a la inmunoterapia en pacientes con CCRm MSI-H.

En el presente estudio, se recogieron muestras de tejido durante la colonoscopia de grupos de MSI-H mCRC sensibles y resistentes al tratamiento tratados con un bloqueador de PD-1 (tislelizumab). A continuación, analizamos exhaustivamente los subtipos de células y los genes clave de los dos grupos utilizando scRNA-seq. Se realizaron experimentos de seguimiento utilizando muestras clínicas y modelos de ratón para verificar el mecanismo potencial de resistencia anti-PD-1 inducida por los tipos de células o genes clave indicados por scRNA-seq.

23 pacientes con MSI-H/dMMR mCRC fueron tratados con monoterapia anti-PD-1 en el Yunnan Cancer Hospital (el tercer hospital afiliado de la Universidad Médica de Kunming) entre el 1 de agosto de 2020 y el 31 de mayo de 2022. Un bloqueador de PD-1 (200 mg, tislelizumab, Bei Gene Ltd., China) se inyectó por vía intravenosa el primer día de cada ciclo de 21 días. La eficacia se evaluó radiológicamente después de cada tercer ciclo de tratamiento. Se consideró que los pacientes eran sensibles al tratamiento anti-PD-1 si presentaban una respuesta completa (RC) o una respuesta parcial (RP), y resistentes al tratamiento anti-PD-1 si presentaban enfermedad progresiva (EP) o enfermedad estable (DAKOTA DEL SUR). Se tomaron tejidos tumorales intestinales frescos (2-4 mm) durante la colonoscopia. Se analizaron muestras de tejido de un total de 23 pacientes (10 sensibles y 13 resistentes) mediante inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF). Se seleccionaron aleatoriamente seis pacientes (3 PR y 3 PD) para scRNA-seq. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de comenzar el estudio. Además, el comité de ética del Yunnan Cancer Hospital aprobó todos los protocolos de estudio en los que participaron seres humanos de acuerdo con los principios éticos descritos en la Declaración de Helsinki. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: adenocarcinoma colorrectal primario confirmado por biopsia colonoscopia y metástasis a distancia confirmada por TC/RM; Estado de MSI-H/dMMR confirmado por multiplex qPCR o IHC; en monoterapia de primera línea con anti-PD-1. Se excluyó a los pacientes si no podíamos obtener una muestra mediante colonoscopia debido a contraindicaciones o no podíamos realizar la secuenciación unicelular debido a una cantidad o actividad celular insuficiente.

Se utilizó TC espiral de 128 cortes de Siemens (SOMATOM Definition AS +) para la exploración simple y mejorada. Los pacientes estaban en ayunas y habían realizado la preparación intestinal según las indicaciones. El rango de escaneo cubrió toda la cavidad abdominal. La capa de exploración tenía un espesor de 1,0 mm con un intervalo de 0,6 mm. Se usó iohexol (300 mg/ml, 100 ml) como agente de contraste. El tiempo de demora de la exploración de la fase arterial fue de 35 a 40 s, y el de la exploración de la fase venosa fue de 70 a 80 s. La resonancia magnética se realizó con un Philips Elision 3.0 T, y la secuencia de exploración incluyó T1WI_Tse transversal, T2WI_Tse sagital y coronal, T2WI_Tse de alta resolución, imágenes ponderadas por difusión y realce dinámico multifásico. Se utilizó gadolinio diamina como agente de contraste. La colonoscopia se realizó con Olympus CV-290 y los tejidos fueron recolectados por médicos con al menos cinco años de experiencia.

Los tejidos tumorales frescos obtenidos de pacientes con CCR se transfirieron inmediatamente a tubos MACS C (Miltenyi Biotec) con enzimas digestivas. Luego, la digestión se llevó a cabo en un GentleMACS Octo Disociator (Miltenyi Biotec) (30 min a 37 °C). Las células individuales se procesaron con Chromium Controller (10X Genomics) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se lavaron con 20 ml de RPMI 1640 (Gibco), se filtraron a través de un filtro de nailon de 70 μm (BD Falcon), se recolectaron por centrifugación (330 × g, 10 min, 4 °C) y se resuspendieron en una solución básica. que contiene suero bovino fetal al 0,2 % (FBS; Gibco).

Se utilizó un sistema de 10 × Chromium (10 × Genomics) y la preparación de bibliotecas de LC Sciences para analizar las células individuales de acuerdo con el protocolo recomendado para el kit de reactivos Chromium Single Cell 30 (química v2). Se utilizó Illumina HiSeq4000 para la secuenciación y un paquete Cell Ranger de 10 × (v1.2.0; 10 × Genomics) para el posprocesamiento y el control de calidad de las bibliotecas.

Todos los datos de secuenciación de una sola célula fueron analizados por Cell Ranger V6.1.1. Los resultados se muestran en el archivo adicional 1: Tabla S1. Las muestras de CRC de 3 pacientes resistentes (llamados R1, R2, R3) y 3 pacientes sensibles (llamados S1, S2, S3) contenían un total de 56 092 células; el número de genes detectados en cada muestra osciló entre 17.564 y 18.093; el número medio de identificadores moleculares únicos celulares osciló entre 3403 y 6915; y la saturación de secuenciación osciló entre 47 y 63%. Estos resultados indican que, en general, la calidad de la secuenciación fue suficiente para su uso en el análisis de correlación posterior.

En total, este análisis incluyó 56.092 células del grupo sensible y del grupo resistente. Para el análisis y control de calidad se utilizó el paquete Seurat en R (versión 4.0.5) [9]. Las células de baja calidad (n = 3071) se eliminaron si los genes se detectaron solo en < 3 células o si hubo < 200 genes totales detectados por matrices de genes y células. A continuación, se realizó el método LogNormalize de escala global para normalizar los valores de expresión génica de las 53 021 células restantes. Luego, se empleó la función FindVariableFeatures combinada con el método vst en R studio para identificar los genes más variables, que se usaron para la reducción de la dimensionalidad. Después del análisis de componentes principales, se identificaron 2000 genes altamente variables. Se aplicaron las funciones Jackstraw y ScoreJackStraw para determinar los componentes principales más significativos. Finalmente, el agrupamiento no supervisado basado en gráficos se llevó a cabo y se visualizó mediante un gráfico de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) no lineal, definido por las funciones FindNeighbors y FindClusters.

Las identidades de los tipos de células se caracterizaron utilizando el paquete SingleR (V1.6.1) basado en la base de datos Celldex. Se utilizó la función FindMarkers en el paquete R Seurat para enumerar los marcadores de cada grupo de células con min.pct = 0,5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0,3 y P < 0,05. Los marcadores utilizados en esta canalización se enumeran en el archivo adicional 2: Tabla S2.

Para investigar los mecanismos moleculares involucrados en cada subtipo celular, se realizaron análisis de enriquecimiento GO y análisis de ruta KEGG de proceso biológico (BP), composición celular (CC) y función molecular (MF) usando el paquete R clusterProfiler (versión 3.14.3), con el umbral de significación ajustado a (adj.) P < 0,05.

Los primeros 2000 genes altamente variables se seleccionaron utilizando la función FindVariableFeatures combinada con el método vst. La función FindMarkers en el paquete R Seurat se usó no solo para encontrar los genes marcadores para diferentes subtipos de células (con umbrales de parámetros de detección de min.pct = 0.5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0.3, P < 0.05 ) sino también para identificar los DEG de cada subtipo celular entre muestras sensibles a anti-PD-1 y resistentes a anti-PD-1 (con el umbral establecido en |avg_log2FC|≥ 0,5, P ≤ 0,05). Los genes superpuestos entre los genes relacionados con el pseudotiempo y los DEG relacionados con la resistencia a PD-1 se consideraron genes clave candidatos.

Para revelar las diferencias en las células inmunitarias de los grupos sensibles y resistentes, se utilizó el software Monocle (versión 2.20.0) [10] para analizar las trayectorias de las muestras y explorar el proceso de diferenciación. En primer lugar, se creó un método más sofisticado (dpFeature) basado en la base de los genes marcadores de desarrollo de grupos y personalizados de Monocle. Los genes característicos con un alto grado de dispersión (q < 0,01) se identificaron entre los subtipos de células seleccionados por dpFeature. A continuación, se aplicó DDRTree para la reducción de la dimensionalidad y la alineación pseudotemporal de las celdas a lo largo de la trayectoria y, por último, las trayectorias se visualizaron como mapas 2D t-SNE. Los genes relacionados con el pseudotiempo se identificaron en base a q < 0,05 de los genes característicos mencionados anteriormente.

Se utilizó la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes interactivos (STRING; http://string.embl.de/) para realizar análisis de interacción proteína‒proteína (PPI) en genes clave candidatos. La base de datos STRING se puede utilizar para evaluar las asociaciones directas (físicas) e indirectas (funcionales) de proteínas [11]. Cytoscape 3.6.1 se utilizó para establecer un modelo de red de resultados de análisis de PPI. Sobre la base de la herramienta en línea STRING, la red PPI de los genes clave candidatos se construyó con una confianza media = 0,4. Los cuatro genes principales se seleccionaron como genes clave en este estudio en función de la conectividad (grado) de cada nodo en la red PPI.

La línea celular de cáncer colorrectal CT26 fue seleccionada para este estudio. El plásmido utilizado para la transfección celular fue sintetizado por Ono Company. Dieciocho a veinticuatro horas antes de la infección por lentivirus, se esparcieron 3 × 105/pocillo de células adherentes en placas de 6 pocillos. El número de células transfectadas con lentivirus fue de aproximadamente 6 × 105/pocillo. Cuando las células se adhirieron a los pocillos y tenían una confluencia del 70 %, el medio de cultivo original se reemplazó por 2 ml de medio de cultivo fresco que contenía 8 μg/ml de polizoano y una cantidad adecuada de suspensión de virus. Luego, las células se incubaron a 37 °C durante 8 h, después de lo cual el medio que contenía el virus se reemplazó con medio nuevo. Si la transfección fue exitosa, la proteína fluorescente fue visible después de 48 a 72 h. Si no se observaba fluorescencia, se repetía el protocolo de infección. Se añadió puromicina para detectar la sobreexpresión de lentivirus durante un mes.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Kunming. En el proceso de operación experimental, seguimos estrictamente las pautas de ARRIVE. A lo largo del experimento, los investigadores no sabían a qué grupo se asignarían los animales sacados de la jaula, los administradores de animales y los investigadores que realizaban el experimento desconocían la secuencia de asignación, y los investigadores que evaluaban, probaban o cuantificaban los resultados del experimento no sabían conocer los medios de intervención.

Se compraron ratones BALB/c (machos, de 6 a 8 semanas de edad, 20 a 30 g) de Beijing Sipeifu Biotechnology Co., Ltd. Todos los ratones se mantuvieron en una sala SPF en las instalaciones de alojamiento de animales de la Universidad Médica de Kunming con alimentos y agua proporcionados a voluntad. El experimento se llevó a cabo después de 1 semana de alimentación adaptativa. Con base en el grado de libertad (E) del análisis de varianza propuesto por Mead, estimamos el tamaño de muestra de los animales de experimentación que necesitamos [12]. El tamaño total de la muestra de ratones en este estudio fue de 25, y se dividieron al azar en 5 grupos con 5 ratones en cada grupo. Todos los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos utilizando un método de muestreo aleatorio simple, definido como OE-NC, OE-IL-1β, OE-IL-1β + Diacerein, OE-IL-1β + Nivolumab y OE-IL-1β + Grupos de diacereína + nivolumab, respectivamente. Para el modelo de grupo de control (grupo OE-NC), se inyectaron subcutáneamente 1 × 106 células estabilizadas con vector vacío en 100 ul de PBS en el flanco de los ratones. Para el modelo de tratamiento, se inyectaron por vía subcutánea 1 × 106 células transfectadas de forma estable con IL-1β sobreexpresada en 100 ul de PBS en el mismo sitio de los ratones. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 40 mm3 (es decir, el día 7), el grupo de OE-IL-1β + diacereína comenzó la inyección intraperitoneal (ip) del antagonista de IL-1β (diacereína, 0,07 mg/kg), OE-IL-1β + Nivolumab el grupo recibió una inyección ip de anticuerpo anti-PD-1 (Nivolumab, 2 mg/kg); El grupo OE-IL-1β + Diacereína + Nivolumab fue tratado con una combinación de diacereína y Nivolumab por vía intraperitoneal. A los ratones del grupo OE-NC y del grupo OE-IL-1β se les administró el mismo volumen de PBS. La diacereína y el nivolumab se inyectaron por vía intraperitoneal cada 3 días a partir del séptimo día de la inoculación de células tumorales.

El peso de los ratones y el volumen del tumor se midieron en 0d, 7d, 10d, 12d, 14d y 16d en cada grupo, respectivamente. El volumen del tumor se calculó como ½ (Largo × Ancho2). El día 16 después de la inoculación de las células tumorales, todos los ratones fueron sacrificados con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (200 mg/kg). Determinar la muerte de ratones en función de la desaparición del reflejo corneal y la emisión de pupilas. Los tejidos tumorales se separaron y pesaron, y se realizaron experimentos de biología molecular posteriores. La selección de 16d como criterio de valoración experimental se basa en los resultados previos al experimento. La selección de 16d como criterio de valoración experimental se basa en los resultados previos al experimento. A lo largo de todo el experimento, la longitud del tumor no debe exceder los 20 mm y el peso del tumor no debe exceder el 10 % del peso de los ratones [13].

El ARN total se extrajo de la línea celular cultivada CT26 o tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Ambion) y se transcribió inversamente en ADNc mediante el kit de síntesis de ADNc de primera cadena SureScript (Servicebio) según las instrucciones del fabricante. Se usaron 2xUniversal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (Servicebio) y el sistema de detección de secuencias CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) para qPCR, y se usaron los siguientes cebadores: IL-1β (humano), directo: 5'- AATCTCCGACCACCACTACA-3' y viceversa: 5'-GACAAATCGCTTTTCCATCT-3'; MMP9 (humano), directo: 5'-ATGAGCCTTCTGGCAGCCCCTGGTCC-3' y reverso: 5'- GGACCAGGGGCTGCCAGAGGCTCAT-3'; GAPDH (humano), adelante: 5'-CCCATCACCATCTTCCAGG-3' y atrás: 5'-CATCACGCCACAGTTTCCC-3'; IL-1β (ratón), adelante: 5'- CCTATGTCTTGCCCGTGG-3' y atrás: 5'- GTGGGTGTGCCGTCTTTC-3'; MMP9 (ratón), adelante: 5'-GTGTGTTCCCGTTCATCTTT-3' y atrás: 5'- GCCGTCTATGTCGTCTTTAT-3'; GAPDH (ratón), adelante: 5'- CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3' y atrás: 5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'. Se utilizó GAPDH como control endógeno estandarizado y se utilizó 2−△△CT para calcular la expresión relativa de ARNm.

Las muestras de proteína se aislaron de tejidos o células usando tampón de lisis RIPA (Servicebio, Wuhan, China) que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa al 1% (PMSF; Servicebio). Se usó un kit de ensayo de proteínas BCA (Biyuntian Biotechnology) para la cuantificación de proteínas. Se aplicó electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida para separar proteínas de diferentes pesos moleculares, y las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Servicebio). La membrana se bloqueó con leche descremada al 5% durante 90 min a temperatura ambiente y posteriormente se incubó con anticuerpos primarios (Proteintech; IL-1β 1:1000; MMP9 1:1000; β-actina 1:25,000) a 4 °C durante la noche, seguido de por incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 2 horas a temperatura ambiente.

Las secciones de tejidos en parafina se desparafinizaron y rehidrataron. Luego, se usó tampón de citrato de sodio para extraer los antígenos a detectar, y la recuperación de antígenos se completó por inducción térmica. Los tejidos seccionados se incubaron con H2O2 al 3 % durante 15 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena (si se procedió sin este paso) y luego se bloquearon con PBS que contenía suero bovino fetal al 5 % durante 30 min. Los tejidos se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados C, seguido de incubación en la oscuridad con los anticuerpos secundarios conjugados a temperatura ambiente durante otras 2 h. Se utilizó DAB como marcador nuclear para IHC. Se usó DAPI (EX:330-380 nm, Em:420 nm) para teñir los núcleos celulares (azul), se usó Alexa Fluor 488 (EX:495 nm, Em:519 nm) para teñir CD11b (verde), Alexa Fluor 555 (EX:555 nm, Em:565 nm) para teñir CD14, CD15 y CD8 (rojo), Alexa Fluor 594 (EX:590 nm, Em:617 nm) para teñir CD33 (naranja).

Las MDSC polimorfonucleares (PMN)/MDSC monocíticas (M) se tiñeron con CD11b-FITC (Biolegend, 101 205, EE. UU.), Ly-6G-PE (Biolegend, 127 607, EE. UU.) y Ly-6C-APC (Biolegend, 128 016 , EE. UU.), y las células T CD8+ se tiñeron con CD3-FITC (Biolegend, 100,203, EE. UU.) y CD8-PE (Biolegend, 100,707, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte 8HT (Millipore). La activación de la dispersión frontal y lateral se realizó con FlowJo_V10.

Los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando el software R. Se aplicó la herramienta en línea varElect para analizar la correlación entre genes en la red PPI y CRC. Una puntuación alta indicaba una fuerte correlación, con un umbral de significación de P < 0,05, a menos que se indique lo contrario. Todos los datos se presentan como la media ± error estándar (SE) de experimentos independientes. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional de dos colas con análisis post hoc de comparación múltiple y valores de P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***) y P < 0,0001 (****) se indican como significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.0.

Un total de 23 pacientes con MSI-H/dMMR mCRC fueron tratados con monoterapia anti-PD-1 de primera línea entre el 1 de agosto de 2020 y el 31 de mayo de 2022. La respuesta al tratamiento se evaluó mediante examen radiológico después de cada 3 ciclos de PD-1 inhibidor PR se registró para siete pacientes, CR se registró para tres pacientes, SD se registró para seis pacientes y PD se registró para siete pacientes. La ORR fue del 43,48 % (10/23) y la tasa de control de la enfermedad (DCR) fue del 69,57 % (16/23) (fig. 1A). Los hallazgos radiológicos de lesiones primarias y metastásicas en seis pacientes antes y después de la inmunoterapia se pueden ver en las figuras 1B y C. La figura 1B muestra los cambios en las lesiones primarias y metastásicas en 3 pacientes del grupo de resistencia (R1, R2 y R3). ) después del tratamiento anti-PD-1. La longitud de las lesiones primarias de R1 aumentó de 2,1 cm a 3,2 cm, mientras que la de las lesiones metastásicas aumentó de 1,6 cm a 2,7 cm; las lesiones primarias y metastásicas de R2 aumentaron de 0,5 cm a 1,9 cm y de 0,3 cm a 0,8 cm, respectivamente; la longitud de las lesiones primarias de R3 aumentó de 1,5 cm a 1,9 cm y el número de lesiones metastásicas aumentó de 3 a más de 20. Las respuestas de R1, R2 y R3 se evaluaron como DP. Del mismo modo, la figura 1C muestra los cambios en las lesiones primarias y metastásicas en 3 pacientes del grupo sensible (S1, S2 y S3) tras la monoterapia con anti-PD-1. La longitud del tumor primario de S1 disminuyó de 2,0 cm a 1,5 cm y la del tumor metastásico disminuyó de 2,1 cm a 1,2 cm; las longitudes de las lesiones primarias y metastásicas de S2 disminuyeron de 1,2 cm a 0,7 cm y de 5,3 cm a 4,4 cm, respectivamente; y las longitudes de las lesiones primarias y metastásicas de S3 disminuyeron de 1,3 cm a 0,8 cm y de 2,1 cm a 0,5 cm, respectivamente. Las respuestas de S1, S2 y S3 se evaluaron como PR.

Evaluación de la eficacia de MSI-H mCRC después de la monoterapia de primera línea con PD-1. Diagrama de flujo para la detección de 23 pacientes que reciben monoterapia con PD-1 de primera línea. Se muestran imágenes de lesiones primarias y metastásicas antes y después de la inmunoterapia para (B) tres pacientes resistentes y (C) tres pacientes sensibles

Se seleccionó aleatoriamente un total de seis pacientes (tres PR y tres PD) para scRNA-seq. Se obtuvieron conjuntos de datos de secuenciación de scRNA de 10 × Genomics a partir de tejidos CRC frescos obtenidos de tres pacientes resistentes (llamados R1, R2, R3) y tres sensibles (llamados S1, S2, S3). Después de eliminar 3071 células de baja calidad, se utilizaron un total de 53 021 células en el análisis final (Fig. 2A); específicamente, había 7679 celdas de R1, 10 797 celdas de R2, 9020 de R3, 7880 celdas de S1, 9369 celdas de S2 y 8276 celdas de S3. La Figura 2B muestra los 2000 genes altamente variantes principales, con los diez genes más variables etiquetados. El PCA de los 2000 genes altamente variables no demostró una separación significativa en las células CRC entre los grupos resistentes y sensibles (Fig. 2C). Se seleccionaron veinte componentes principales en base al análisis de reducción de dimensionalidad lineal (Fig. 2D). La reducción de la dimensionalidad no lineal de los datos según el valor de dimensión 20 combinado con la función RunMap reveló una distribución más uniforme de las células en cada muestra (Fig. 2E). Posteriormente, estas células se clasificaron en 23 grupos de células según los niveles de expresión génica por t-SNE, y se encontró que la distribución de estos taxones celulares era casi idéntica en los grupos sensibles y resistentes (Fig. 2F).

Los grupos de células en seis muestras de CRC se identificaron mediante secuenciación de scRNA. Un número de células en diferentes muestras. B Visualización de los 2000 genes variantes principales. C PCA de los 2000 principales genes variantes. D Análisis de reducción de dimensionalidad lineal de componentes principales. E Análisis de distribuciones de celdas por reducción de dimensionalidad no lineal combinada con la función RunMap. F Análisis de distribuciones de clusters celulares en los grupos sensibles y resistentes a través de t-SNE

Utilizando los paquetes R SingleR y celldex, se anotaron 23 grupos de células en nueve subtipos de células: células T CD8+, células epiteliales, células B, células dendríticas (DC), células madre hematopoyéticas, monocitos, fibroblastos, miocitos y células endoteliales (Fig. .3A). En combinación con la Fig. 2F, la agregación de células T CD8+ y monocitos en el grupo sensible fue significativamente mayor que en el grupo resistente. El número de células de cada subtipo celular en cada muestra se muestra en el archivo adicional 3: Tabla S3. Se obtuvo un total de 679 genes marcadores para los nueve subtipos de células (Archivo adicional 2: Tabla S2): había 176 marcadores para fibroblastos, 143 marcadores para células endoteliales, 131 marcadores para miocitos, 67 marcadores para DC, 65 marcadores para monocitos, 40 marcadores para células madre hematopoyéticas, 27 marcadores para células epiteliales, 17 marcadores para células T CD8+ y 13 marcadores para células B (Fig. 3B). El gen superior para cada subtipo celular se muestra en la Fig. 3C. El mapa de calor de estos genes ilustró que cada grupo mostraba características distintas de expresión génica (Fig. 3D).

Anotación de subtipos celulares y análisis de enriquecimiento funcional de genes marcadores. Una anotación de subtipos de celdas según el paquete R SingleR y celldex. B Número de genes marcadores para cada subtipo celular. C Diagrama de dispersión que muestra el marcador genético superior para cada subtipo. D Mapa de calor que muestra el principal creador de genes para cada subtipo

El análisis GO mostró que estos genes marcadores estaban enriquecidos principalmente en procesos biológicos relacionados con el sistema inmunitario, como la diferenciación de linfocitos y monocitos y la regulación positiva de los leucocitos. Además, también se asociaron significativamente con la "vía de señalización mediada por citoquinas" (Archivo adicional 4: Figura S1A-C). El análisis de enriquecimiento KEGG (Archivo adicional 4: Figura S1D) indicó que los genes marcadores se correlacionaron significativamente con las respuestas inmunitarias/inflamatorias (p. ej., "interacción del receptor de citoquinas citoquinas", "vía de señalización Fc epsilon RI", "vía de señalización AGE - RAGE", "moléculas de adhesión celular"). Las vías relacionadas con el cáncer, incluida la "vía de señalización PI3K-Akt" y los "proteoglicanos en el cáncer", también se enriquecieron significativamente.

Se simularon trayectorias de desarrollo para los nueve subtipos celulares, y se encontró que 1623 genes característicos se expresaban diferencialmente entre las subpoblaciones celulares (Archivo adicional 5: Tabla S4). La Figura 4A ilustra la dispersión relativamente alta de estos genes característicos. Luego, las células individuales se clasificaron por estos genes característicos utilizando el paquete R Monocle, y se construyó una estructura de árbol de todo el espectro de trayectorias de diferenciación (Fig. 4B). Desde una perspectiva de tipificación celular, en general, la tendencia evolutiva temporal propuesta de los subtipos celulares fue una transición gradual de células epiteliales a células intermedias (p. ej., fibroblastos, células madre hematopoyéticas, monocitos, células B) y finalmente a células T CD8+ (Fig. 4C). Se identificaron un total de 1454 genes relacionados con el pseudotiempo de los 1623 genes característicos (P <0.05; Archivo adicional 6: Tabla S5). El análisis KEGG (Archivo adicional 7: Figura S2A) reveló que estos genes estaban involucrados en la "interacción del receptor de citoquinas-citoquinas", "interacción de proteínas virales con citoquinas y receptores de citoquinas" y "ciclo celular"; también estaban inextricablemente vinculados a las vías asociadas a tumores "vía de señalización de NF-kappa B", "vía de señalización de p53" y "vía de señalización de PPAR". El análisis de GO-BP reveló que estos genes relacionados con el pseudotiempo estaban relacionados con la respuesta inmunitaria, la respuesta inflamatoria, la diferenciación de células inmunitarias, la proliferación, la migración y la quimiotaxis (Archivo adicional 7: Figura S2B). Además, estos genes también realizaron funciones moleculares como "unión de antígeno", "unión de receptor de inmunoglobulina" y "constituyente estructural de matriz extracelular" (Archivo adicional 7: Figura S2C) en fracciones celulares como "complejo de inmunoglobulina", "lado externo de membrana plasmática" y "complejo de inmunoglobulina, circulante" (Archivo adicional 7: Figura S2D).

Construcción de trayectorias de desarrollo de grupos de células e identificación de genes clave. A Dispersión relativa de genes característicos. B Construcción de la estructura de árbol del espectro de trayectoria de diferenciación. C Tendencia evolutiva temporal de los subtipos celulares. D Identificación de genes comunes mediante análisis de superposición. Red EA PPI basada en 130 genes comunes

Para observar las diferencias en la expresión génica de cada subtipo celular entre los grupos sensibles y resistentes, realizamos un análisis diferencial utilizando la función FindMarkers en el paquete Seurat. Se obtuvieron un total de 155 DEG; 97 estaban regulados al alza y 98 estaban regulados a la baja (Archivo adicional 8: Tabla S6). El análisis de enriquecimiento funcional indicó que estos genes estaban relacionados con las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Los DEG en el subtipo de células T CD8+ estuvieron principalmente involucrados en la respuesta relacionada con IFN y el transporte de oxígeno, mientras que los DEG en los subtipos DC y fibroblastos se asociaron con la respuesta relacionada con quimiocinas y la migración de neutrófilos (Archivo adicional 9: Figura S3A y B) . Los resultados de enriquecimiento para GO-CC y GO-MF se presentan en el archivo adicional 9: Figura S3B y C. El análisis de enriquecimiento KEGG mostró que los DEG en los subtipos de células B y monocitos estaban involucrados en vías similares y se enriquecieron en el procesamiento y presentación de antígenos; Los DEG en los subtipos de DC y fibroblastos estuvieron involucrados en vías relacionadas con el cáncer, incluida la señalización de quimiocinas e IL-17 (Archivo adicional 9: Figura S3D).

A través del análisis de superposición, se identificaron 130 genes comunes entre 1454 genes relacionados con el pseudotiempo y 155 genes relacionados con la resistencia a PD-1 (desduplicados) (Fig. 4D; Archivo adicional 10: Tabla S7). Se dibujó una red PPI que contenía 109 nodos y 435 bordes en función de los 130 genes comunes utilizando la base de datos STRING (Fig. 4E). El análisis VarElect de los 130 genes comunes identificó los dos genes con la mayor conectividad en la red PPI como IL-1β (puntuación = 17,72) y MMP9 (puntuación = 13,45), lo que indica que estos dos genes están más estrechamente asociados con CRC (Archivo adicional 11: Tabla S8; Archivo adicional 12: Figura S4). El análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG de estos dos genes clave mostró que están involucrados en la interacción citoquina-receptor de citoquina (IL-1β) y las vías de señalización MAPK y PI3K-Akt (IL-1β y MMP9). Los mapas de vías de señalización específicas se muestran en el archivo adicional 12: Figura S5.

IL-1β y MMP9 se identificaron como los dos genes principales con la mayor correlación con la resistencia anti-PD-1 a través de scRNA-seq. Usamos IHC para detectar la expresión de IL-1β y MMP9 en 10 tejidos tumorales sensibles y 13 resistentes de pacientes con MSI-H/dMMR. El grado IHC de IL-1β en tejidos positivos para IL-1β fue significativamente mayor que el de tejidos tumorales negativos para IL-1β (P < 0,001; Fig. 5A). A continuación, los 23 pacientes se clasificaron en grupos negativos para IL-1β o positivos para IL-1β en función del grado IHC de IL-1β. De los 13 tejidos de pacientes resistentes, once tejidos tenían una alta expresión de IL-1β; de los 10 tejidos de pacientes sensibles, solo un tejido tenía una expresión alta (Fig. 5B). Se observó una tendencia de expresión similar para otro gen clave, MMP9 (P < 0,0001; Fig. 5C). La expresión de MMP9 se correlacionó positivamente con la expresión de IL-1β (R = 0,6945, P <0,0001; Fig. 5D).

Relación entre IL-1β y MDSC o células T CD8+ en pacientes con CRC MSI-H/dMMR. Una tinción IHC para IL-1β en tejidos CRC. B Proporción de tejidos positivos para IL-1β y negativos para IL-1β en los grupos sensibles y resistentes. C Tinción IHC para MMP9 en grupos positivos y negativos para IL-1β. D Correlación entre MMP9 e IL-1β según puntuaciones IHC. Examen IF y cuantificación de (E) PMN-MDSC, (F) M-MDSC y (G) células T CD8+ en los grupos IL-1β-negativo y positivo. Análisis de correlación de Pearson de las puntuaciones de IF entre IL-1β y (H) PMN-MDSC, (I) M-MDSC y (J) células T CD8.+. **** P < 0,0001

Las MDSC son células heterogéneas derivadas de la médula ósea que provocan la inactivación de las células T CD8+ y la resistencia inmunitaria. Múltiples estudios han demostrado que la IL-1β podría desempeñar funciones cruciales en la agregación y diferenciación de las MDSC. Examinamos más a fondo la relación entre la expresión de IL-1β y las MDSC usando IF. La intensidad de fluorescencia de los fabricantes en PMN-MDSC y M-MDSC en los tejidos de pacientes positivos para IL-1β fue significativamente mayor que la de los pacientes negativos para IL-1β (P < 0,0001; Fig. 5E-F). Las células T CD8+ se identificaron como uno de los grupos de células más significativamente diferentes entre el grupo sensible y el grupo resistente mediante scRNA-seq. Las células T CD8+ en el microambiente tumoral (TME) son esenciales para los efectos antitumorales de la inmunoterapia. Utilizamos IF para detectar la expresión del marcador de células T CD8+ en tejidos y evaluamos la correlación entre IL-1β y células T CD8+. La intensidad de fluorescencia de CD8 en tejido positivo para IL-1β fue significativamente menor que en tejido negativo para IL-1β (P < 0,0001; Fig. 5G). Hubo una correlación significativa entre IL-1β y PMN-MDSC (R = 0,8168, P < 0,0001; Fig. 5H), M-MDSC (R = 0,7604, P < 0,0001; Fig. 5I) o células T CD8+ (R = 0,7684, P < 0,0001; figura 5J).

Para demostrar aún más la influencia de IL-1β en la resistencia a PD-1 en el cáncer colorrectal, se utilizó un modelo de xenoinjerto in vivo. El gen de la IL-1β humana se transfectó de manera estable en líneas celulares CT26 para aumentar la expresión de IL-1β, según lo verificado por qPCR y transferencia Western (Archivo adicional 12: Figura S6). A continuación, se inyectaron por vía subcutánea células CT26 de control que sobreexpresaban IL-1β o no transfectadas en ratones BALB/c macho (n = 5 en cada grupo; Fig. 6A y B). Después de 7 días de la inoculación de células tumorales, se observó un crecimiento tumoral progresivo. Como se muestra en la Fig. 6C-D, la regulación positiva de IL-1β dio como resultado un aumento sustancial en el volumen del tumor y no hubo una diferencia significativa en el peso del ratón entre los cinco grupos. Tratamos a los tres grupos con diacereína, nivolumab o ambos y observamos el crecimiento de los tumores para determinar si el antagonista de IL-1β coopera con el agente inmunitario para inhibir el crecimiento de los tumores. La elevación del volumen del tumor CCR (745,74 ± 188,34) y el peso (0,73 ± 0,16) inducida por IL-1β se vio muy atenuada por diacereína (619,59 ± 127,03, 0,49 ± 0,09) o nivolumab (540,47 ± 90,92, 0,49 ± 0,10, P < 0,05). ), y el tratamiento con ambos fármacos condujo a la mayor atenuación del crecimiento tumoral (355,49 ± 39,89, 0,32 ± 0,08, P < 0,001). La diacereína y el nivolumab mostraron marcados efectos sinérgicos. Las secciones de tumor de los ratones inoculados se muestran en la Fig. 6E.

El antagonista de IL-1β y el inhibidor de PD-1 tienen un efecto antitumoral sinérgico. Un diagrama de la línea de tiempo experimental. B Tumores de xenoinjerto de ratones BALB/c 16 días después de la inoculación con células CT26 que contenían un vector vacío o un vector de sobreexpresión de IL-1β (n = 5). C Peso del tumor (n = 5). D Peso corporal promedio y volumen tumoral promedio de ratones BALB/c en cada grupo de tratamiento (n = 5). E Tinción con hematoxilina-eosina de tumores de ratones BALB/c inoculados (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001

Para examinar si la eficacia del tratamiento con diacereína contra la resistencia a nivolumab inducida por IL-1β estuvo mediada por MDSC, se realizó citometría de flujo usando biomarcadores para PMN-MDSC, M-MDSC y células T CD8+. Como se muestra en la Fig. 7, IL-1β resultó en un aumento significativo en el número de PMN-MDSC (17,62 ± 5,56 frente a 4,64 ± 0,84, P < 0,0001) y M-MDSC (5,61 ± 1,35 frente a 1,26 ± 0,33, P < 0,0001) en el TME, disminuyó la proporción de células T CD8+ (2,94 ± 1,17 frente a 4,35 ± 1,37, P < 0,01) en los tejidos tumorales de ratones y mejoró la inmunosupresión. A continuación, evaluamos más a fondo si la diacereína y el nivolumab mostraban efectos sinérgicos similares para revertir el efecto mediado por IL-1β en PMN-MDSC, M-MDSC y células T CD8+. La monoterapia con diacereína o nivolumab suprimió la diferenciación de PMN-MDSC (11,15 ± 2,90 frente a 17,621 ± 5,561, 12,0 ± 1,88 frente a 17,621 ± 5,561, P < 0,01) y M-MDSC (3,21 ± 0,77 frente a 1,26 ± 0,33, 4,09 ± 0,90 frente a 1,26 ± 0,33, P < 0,01) y aumentó el número de células T CD8+ (4,16 ± 0,76 frente a 2,94 ± 1,17, 4,81 ± 1,07 frente a 2,94 ± 1,17, P < 0,01). Las Figuras 7B y C sugieren que, en comparación con nivolumab solo, el tratamiento combinado redujo significativamente el número de PMN-MDSC (8,79 ± 2,98 frente a 12,0 ± 1,89, P < 0,01) y M-MDSC (2,26 ± 0,72 frente a 4,09 ± 0,90, p < 0,001). La Figura 7D muestra que el grado de agregación de células T CD8+ en los grupos de monoterapia con nivolumab (4,81 ± 1,07 frente a 5,695 ± 0,90, P < 0,05) se redujo sustancialmente en comparación con el grupo de terapia combinada.

IL-1β estimula la agregación de MDSC e inhibe la proliferación de células T CD8+ en tumores. Se realizó una citometría de flujo para detectar PMN-MDSC, M-MDSC y células T CD8+ (n = 5). Diagrama estadístico cuantitativo para la expresión de (B) PMN-MDSC, (C) M-MDSC, (D) células T CD8.+ en cada grupo (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001

Como uno de los genes clave relacionados con la resistencia identificados por secuenciación unicelular, se considera que MMP9 tiene fuertes funciones antivasculares e inmunosupresoras. Sin embargo, la correlación entre MMP9 e IL-1β sigue sin estar clara. MMP9 se detectó en tejido CRC de ratón mediante qPCR, transferencia Western e IHC. Como se muestra en la Fig. 8, el tratamiento con IL-1β aumentó significativamente la expresión de MMP9 en tejidos tumorales de ratón sobre la base de los resultados de qPCR (9,57 ± 0,26 frente a 1,08 ± 0,44, P < 0,0001) y transferencia Western (1,13 ± 0,07 frente a 0,21 ± 0,04, P < 0,0001). A continuación, evaluamos si la diacereína podría cooperar con nivolumab para reducir la expresión de MMP9. La monoterapia con diacereína (4,21 ± 0,60 frente a 9,57 ± 0,26, P < 0,01) o nivolumab (6,36 ± 1,10 frente a 9,57 ± 0,26, P < 0,01) atenuó la regulación positiva de MMP9 inducida por IL-1β a través del análisis qPCR. La terapia combinada redujo la expresión de MMP9 de forma más potente que la monoterapia con diacereína (1,62 ± 0,59 frente a 4,21 ± 0,60, P < 0,0001) o nivolumab (1,62 ± 0,59 frente a 6,36 ± 1,10, P < 0,0001). La expresión de MMP9 en tejido tumoral se correlacionó casi positivamente con la de IL-1β (el valor de R2 se muestra en la Fig. 8I).

Correlación entre IL-1β y MMP9 en el modelo de xenoinjerto de ratón. qPCR de (A) IL-1β y (B) expresión de ARNm de MMP9 en cada grupo de tratamiento (n = 3). C Análisis de transferencia Western (n = 3). Análisis en escala de grises de (D) IL-1β y (E) proteína MMP9 (n = 3). Tinción IHC y puntuaciones de (F, G) IL-1β y (H, I) expresión de MMP9 (n = 5). (J) Análisis de correlación de Pearson de la expresión de MMP9 e IL-1β (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001

En comparación con la quimioterapia tradicional o la terapia dirigida, la inmunoterapia tiene un mecanismo molecular único mediante el cual reduce los tumores. En general, se considera que los inhibidores de puntos de control inmunitarios mejoran la inmunidad general del cuerpo al inducir la activación de las células T y "liberar el freno inmunitario" en el TME [14, 15]. En un estudio anterior de nuestro centro, 29 pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado MSI-H/dMMR recibieron inmunoterapia neoadyuvante con un inhibidor de PD-1 como agente único, y el ORR fue del 100 % (29/29), en consonancia con los resultados de el estudio NICHE [16, 17]. En el presente estudio, 23 pacientes con MSI-H/dMMR mCRC recibieron tratamiento de primera línea con un inhibidor de PD-1, pero el ORR fue solo del 43,5 % (10/23). Estas respuestas divergentes de MSI-H mCRC a la monoterapia anti-PD-1 probablemente se deban a diferencias en la composición de TME [18,19,20].

En vista de esto, a través de scRNA-seq, definimos varios subtipos celulares, seleccionamos genes clave y revelamos las vías de señalización de TME que difieren entre los grupos sensibles y resistentes al tratamiento anti-PD-1. En conjunto, los resultados sugirieron que las proporciones de los subconjuntos de células T CD8+ en el grupo sensible eran significativamente más altas que las del grupo resistente [21,22,23,24]. Múltiples subconjuntos de células T CD8+ en el TME pueden afectar la tasa de respuesta de nuevas terapias dirigidas al sistema inmunitario [21, 22]. Las MDSC son células heterogéneas derivadas de la médula ósea que promueven la angiogénesis y la inmunosupresión [25]. Estudios recientes han demostrado que la disminución de la agregación de MDSC en el TME puede aumentar significativamente la infiltración de células T CD8+ y mejorar los efectos antitumorales de la inhibición de PD-1 [26, 27]. El efecto inmunosupresor de las MDSC podría estar relacionado con la secreción de varias citocinas, como la óxido nítrico sintasa inducible, la arginasa 1, la interleucina-6 y el factor de crecimiento transformante-β [28].

En este estudio, IL-1β ocupó el primer lugar en términos de conectividad en la superposición de genes relacionados con el pseudotiempo y genes relacionados con la resistencia a PD-1. Los macrófagos derivados de monocitos son una fuente importante de producción de IL-1β durante la respuesta inmunitaria a la infección por patógenos [29, 30]. Estudios previos han sugerido que la IL-1β podría promover la invasión y el crecimiento de células de cáncer de colon humano [31], y los polimorfismos de la IL-1β están asociados con la recurrencia del CCR [32]. Se ha demostrado que el bloqueo de IL-1β revierte la inmunosupresión y muestra sinergia con los inhibidores de PD-1 para promover la eliminación de varios tipos de tumores, incluidos los tumores de mama [32], pancreáticos [18] y renales [33]. Sin embargo, el papel preciso de la IL-1β en la inmunoterapia para el CCR aún no se ha dilucidado. Varios estudios han sugerido que la IL-1β puede inducir la infiltración de MDSC mediante la producción de factor estimulante de colonias de granulocitos, varias quimiocinas CXC y moléculas de adhesión vascular [34]. Sin embargo, el papel de la agregación de MDSC mediada por IL-1β en la inmunoterapia con CRC sigue sin estar claro.

MMP9 es una metaloproteinasa de matriz que se ha identificado como un componente del cambio angiogénico durante la carcinogénesis [35, 36]. MMP9 media la invasión tumoral, la metástasis y el escape inmunitario a través de una vía de señalización prooncogénica [37,38,39] y se asocia con recaídas y mal pronóstico en pacientes con CCR [40]. La combinación de la inhibición de MMP9 con la inhibición del punto de control inmunitario mejoró la eficacia de la inmunoterapia en modelos de ratón con melanoma [41] y cáncer de mama [42]. MMP9 también se ha mostrado prometedor en la estratificación del pronóstico y la capacidad de respuesta al tratamiento del punto de control inmunitario en pacientes con carcinoma hepatocelular [43]. Los resultados del presente análisis KEGG para 130 genes clave revelaron que IL-1β y MMP9 estaban altamente correlacionados con las vías de señalización MAPK y PI3K-Akt. Estudios recientes también han indicado que la IL-1β aumenta la expresión de MMP9 a través de diferentes vías de señalización en diferentes enfermedades [44,45,46]. La infiltración de MDSC podría estimular aún más la secreción de MMP9 [47], y la acumulación de MDSC impulsada por IL-1β podría ser una de las principales fuentes de MMP9. Sin embargo, la función de la regulación positiva de MMP9 mediada por IL-1β en la inmunoterapia con CCR necesita más estudio.

En el presente estudio, describimos el panorama celular de los grupos resistentes a la inmunoterapia y sensibles a la inmunoterapia a nivel unicelular. El grado de agregación de células T CD8+ y monocitos en el grupo sensible fue significativamente mayor que en el grupo resistente. IL-1β y MMP9 se identificaron como los dos genes con mayor correlación con la resistencia anti-PD-1. Además, la infiltración de MDSC impulsada por IL-1β mejoró la resistencia anti-PD-1 en MSI-H/dMMR CRC.

En el presente estudio, la ORR y la DCR de MSI-H/dMMR mCRC tratados con monoterapia de primera línea con PD-1 fueron del 43,75 % (7/16) y del 68,75 % (11/16), respectivamente. Se encontró que las células T IL-1β y CD8+ tenían la correlación más alta con la resistencia anti-PD-1 entre genes y tipos de células, respectivamente. Los experimentos con ratones demostraron que la infiltración de MDSC impulsada por IL-1β suprimió la acumulación de células T CD8+, lo que mejoró la resistencia anti-PD-1 de MSI-H/dMMR CRC. Juntos, estos hallazgos sugieren que los antagonistas de IL-1β pueden resultar prometedores como nuevos fármacos para revertir la resistencia a los inhibidores de PD-1.

Los conjuntos de datos de scRNA-seq generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA932556].

Proceso biológico

Composición celular

Respuesta completa

Cáncer colonrectal

Tasa de control de enfermedades

Células dendríticas

Genes expresados ​​diferencialmente

Reparación deficiente de desajustes

inmunohistoquímica

inmunofluorescencia

Células supresoras derivadas de mieloides

Cáncer colorrectal metastásico

Células supresoras monocíticas derivadas de mieloides

Inestabilidad de microsatélites-alta

Microsatélite estable

Tasa de respuesta objetiva

Enfermedad progresiva

Proteína de muerte celular programada-1

Células supresoras polimorfonucleares derivadas de mieloides

Respuesta parcial

Realizar interacción proteína-proteína

función molecular

Secuenciación de ARN de una sola célula

enfermedad estable

Herramienta de búsqueda para la recuperación de genes que interactúan

Microambiente tumoral

Incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en T

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No aplica.

Este tema fue financiado por subvenciones del Proyecto de Tecnología del Equipo de Innovación Provincial de Yunnan (No. 2019HC009), Proyecto de Construcción del Centro Provincial de Cáncer Colorrectal de Yunnan (No. 2020YZ001), Fondo de Investigación Científica del Departamento de Educación Provincial de Yunnan (No. 2022J0227) y Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de Yunnan (No. 202201AY070001-149).

Tao Wu, Xuan Zhang y Xinxing Liu son coautores y contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Cirugía Colorrectal, Yunnan Cancer Hospital, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 519, Kunzhou Road, Xishan District, Kunming, 650118, China

Tao Wu, Xuan Zhang, Xinxing Liu, Xinyi Cai, Tao Shen, Dingguo Pan, Ruixi Hu, Jianhua Dong, Shilei Gen, Zhaoyu Yang y YunFeng Li

Facultad de Bioingeniería, Universidad de Chongqing, Chongqing, China

Rui Liang

Departamento de Intervención Mínimamente Invasiva, Hospital del Cáncer de Yunnan, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming, Kunming, China

Rong Ding

Departamento de Gastroenteroscopia, Hospital del Cáncer de Yunnan, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming, Kunming, China

furong li y jinsha li

Departamento de Oncología, Hospital del Cáncer de Yunnan, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming, Kunming, China

lin xie

Departamento de Radiología, Hospital del Cáncer de Yunnan, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming, Kunming, China

Chun Long Wang

Departamento de Dermatología, Hospital Infantil de Kunming, Kunming, China

lu xing

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YL y LX2 diseñaron el artículo. TW, XZ y XL redactaron el manuscrito y fueron responsables de analizar los datos de scRNA-seq. XC fue responsable del experimento con animales. DP y RD fueron responsables de inscribir a los pacientes y recolectar muestras. RL y TS realizaron inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. RH y JD modificaron el manuscrito. FL y JL realizaron la colonoscopia. CW realizó el examen radiológico. LX1 y SG realizaron el análisis estadístico. ZY completó la qPCR y la transferencia Western. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Lu Xing o Yun Feng Li.

Todos los participantes tenían consentimiento informado por escrito antes del estudio. Además, el Comité de Ética del Hospital Oncológico de Yunnan aprobó protocolos de estudio que se diseñaron en base a los principios éticos de investigación médica que involucran seres humanos de la Declaración de Helsinki (número de aprobación: KYLX202127). Los ratones aplicados en este estudio son todos del Departamento de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Kunming, y el esquema experimental ha sido aprobado por el Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Kunming (número de aprobación: kmmu20221065).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés potencial.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Tabla S1. Datos de secuenciación de células individuales de muestras clínicas de 6 pacientes con MSI-H/dMMR.

Tabla S2. Marcadores utilizados en la canalización de análisis de subtipos de células.

Número de células de 9 subtipos de células en cada muestra.

Figura S1. Análisis GO y KEGG de genes marcadores.

Tabla S4. 1623 genes expresados ​​diferencialmente en 9 subconjuntos de células.

Tabla S5. Se identificaron 1454 genes relacionados con el pseudotiempo a partir de 1623 genes característicos.

Figura S2. Análisis KEGG y GO de genes relacionados con el pseudotiempo.

Tabla S6. 155 DEGs en expresión génica de cada subtipo celular entre grupo sensible y grupo resistente.

Figura S3. Análisis GO y KEGG de DEG relacionados con la resistencia a PD-1.

Tabla S7. 130 genes comunes entre 454 genes relacionados con el pseudo-tiempo y 155 (desduplicación) genes relacionados con la resistencia a PD-1.

Tabla S8. Análisis VarElect de 130 genes comunes.

Figura S4. Resultados del análisis VarElect de 130 genes comunes en 454 genes relacionados con el pseudotiempo y 155 (desduplicación) genes relacionados con la resistencia a PD-1 DEG. Figura S5. (A) La interacción citoquina-receptor de citoquina y (B) los mapas de vías de señalización MAPK y PI3K-Akt de IL-1β y MMP9. Figura S6. Construcción de una línea celular CT26 estable que sobreexpresa IL-1β. (A) Línea celular de cáncer colorrectal CT26 utilizada en este experimento. (B) Mapa de plásmido del vector de sobreexpresión de IL-1β. (C) Cribado de colonias positivas por ampicilina después de la transformación del plásmido. (D) Mapa de gel de electroforesis de plásmidos. (E) Se aplicó transferencia Western para detectar la expresión de IL-1β en líneas celulares transformadas de forma estable. (F) Se utilizó qPCR para detectar la expresión de IL-1β en líneas celulares transformadas de forma estable.

Imágenes de las manchas originales.

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Reimpresiones y permisos

Wu, T., Zhang, X., Liu, X. et al. La secuenciación de una sola célula revela el panorama del microambiente inmunitario relacionado con la resistencia anti-PD-1 en el cáncer colorrectal metastásico con alta inestabilidad de microsatélites. BMC Med 21, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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Recibido: 08 diciembre 2022

Aceptado: 14 abril 2023

Publicado: 27 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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