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Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2734 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) constituyen un vasto y valioso banco de material de pacientes para la historia clínica y los datos de seguimiento. Todavía es un desafío lograr un perfil de ARN de una sola célula/núcleo (sc/snRNA) en tejidos FFPE. Aquí, desarrollamos una tecnología de secuenciación de snRNA basada en gotitas (snRandom-seq) para tejidos FFPE mediante la captura de RNA totales de longitud completa con cebadores aleatorios. snRandom-seq muestra una tasa de doblete menor (0,3 %), una cobertura de ARN mucho mayor y detecta más ARN no codificantes y ARN nacientes, en comparación con las tecnologías de scRNA-seq de alto rendimiento de última generación. snRandom-seq detecta una mediana de >3000 genes por núcleo e identifica 25 tipos de células típicas. Además, aplicamos snRandom-seq en una muestra clínica de cáncer de hígado humano FFPE y revelamos una interesante subpoblación de núcleos con alta actividad proliferativa. Nuestro método proporciona una potente plataforma snRNA-seq para muestras clínicas FFPE y promete enormes aplicaciones en la investigación biomédica.

Los tejidos rutinarios fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) son las muestras archivables más comunes y constituyen un vasto y valioso banco de material del paciente para la historia clínica, datos de seguimiento, etc.1. La morfología del tejido y los detalles celulares de los tejidos FFPE están bien conservados para la histopatología gracias al entrecruzamiento de formaldehído entre el ADN, el ARN y las proteínas. Inevitablemente, las modificaciones irreversibles causadas por la fijación de formalina en macromoléculas en muestras FFPE siempre hacen que sea un desafío para las aplicaciones de biología molecular. Estudios recientes han logrado grandes avances en la elaboración de perfiles de transcripción en muestras FFPE mediante métodos de extracción de ARN óptimos2 o creación de perfiles espaciales in situ3. En los últimos años, los métodos de secuenciación de ARN de núcleos/células individuales de alto rendimiento (scRNA/snRNA-seq) han revolucionado todo el campo de la investigación biomédica4,5,6. Hemos construido el primer atlas de células humanas y de ratón con nuestras plataformas personalizadas de scRNA-seq de alto rendimiento7,8. Se cree que la caracterización transcriptómica precisa de cada célula en muestras clínicas FFPE tiene la capacidad de brindar una mejor comprensión de la heterogeneidad celular y la dinámica de la población, mejorando así la precisión del diagnóstico, el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad humana. Sin embargo, tanto el aislamiento de células/núcleos intactos individuales como la captura de ARN de tejidos FFPE siguen siendo un desafío debido a la degradación, la modificación y el entrecruzamiento del ARN.

Actualmente, las plataformas sc/snRNA-seq de alto rendimiento más populares, como 10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution, se basan en oligo(dT) para capturar poli(A)+ ARN, de modo que principalmente el ARN mensajero (ARNm) madurado detectarse en lugar de ARN no poliadenilados para el análisis. Además, estos métodos sc/snRNA-seq basados en oligo(dT) se limitan principalmente a muestras frescas o congeladas, ya que los cebadores oligo(dT) suelen fallar en los ARN degradados. Se han desarrollado varios métodos para superar estos desafíos desde diferentes perspectivas. SMART-seq-total9 y VASA-seq10 capturan transcripciones poliadeniladas y no poliadeniladas mediante el despliegue de un paso adicional para seguir todas las moléculas de ARN con poli(A). Por otro lado, se informó que SPLiT-seq11 se usó con éxito en células fijas utilizando un cebador aleatorio que era más eficiente y más amplio para capturar ARN totales12,13. Sin embargo, estos métodos aún no eran viables para los tejidos FFPE. Dos métodos que se publicaron recientemente en bioRxiv, snPATHO-Seq14 y snFFPE-seq15, proporcionaron métodos optimizados para aislar núcleos únicos intactos de tejidos FFPE para realizar snRNA-Seq, lo que demuestra la viabilidad de snRNA-Seq en tejidos FFPE y desbloquea una dimensión de estas muestras difíciles de usar. snPATHO-Seq depende de la tecnología 10X Genomics basada en sondas, por lo que solo se pueden detectar genes limitados14. snFFPE-seq utiliza la plataforma 10X Genomics basada en poli(A), que no es lo suficientemente sensible para capturar los ARN de baja calidad de los tejidos FFPE15. En la práctica, siempre se requiere un perfil transcriptómico integral y a gran escala de muestras clínicas para identificar biomarcadores predictivos o tipos de células raras. Por lo tanto, el objetivo general es tener un enfoque que pueda satisfacer la necesidad de snRNA-seq de alto rendimiento, alta sensibilidad y alta cobertura en tejidos FFPE.

En este estudio, desarrollamos snRandom-seq, un método de secuenciación de snRNA de longitud completa y alta sensibilidad basado en gotitas para tejidos FFPE. En snRandom-seq, capturamos los ARN totales usando cebadores aleatorios para la transcripción inversa y sintetizamos la segunda hebra mediante la realización de colas poli(dA) en los ADNc de la primera hebra. Los cDNA en un solo núcleo se etiquetan específicamente con nuestra plataforma anterior de códigos de barras de microfluidos16,17 y, posteriormente, se amplifican y secuencian. Mientras tanto, desarrollamos un protocolo para aislar núcleos intactos únicos de tejidos FFPE realizando desparafinización, rehidratación y extracción de núcleos en condiciones suaves. Además, diseñamos un paso de bloqueo de ADN monocatenario para evitar el efecto de la contaminación del genoma. Utilizamos una muestra de mezcla de humanos y ratones para validar el rendimiento de snRandom-seq, y los resultados muestran una tasa de doblete menor (0,3 %) y una sensibilidad comparable con las tecnologías de scRNA-seq de alto rendimiento de última generación. En tejidos de ratones FFPE, snRandom-seq demuestra resultados decentes para la secuenciación de snRNA y la anotación de tipos de células, donde snRandom-seq detecta una mediana de >3000 genes por núcleo para ~20,000 núcleos únicos e identifica 25 tipos de células típicas (hepatocito, células germinales, fibroblastos , cardiomiocitos, etc.). Además, aplicamos snRandom-seq en una muestra clínica de cáncer de hígado humano FFPE y revelamos una interesante subpoblación de núcleos con alta actividad proliferativa, que podría ser un objetivo potencial para la investigación del cáncer. En resumen, snRandom-seq proporciona una potente plataforma de snRNA para muestras clínicas y de laboratorio de FFPE e implica varias aplicaciones futuras en la investigación biológica y la práctica clínica.

El flujo de trabajo principal de snRandom-seq se muestra en la Fig. 1. Para el aislamiento de un solo núcleo de tejidos FFPE, las áreas de interés del bloque de tejido FFPE almacenado se seleccionaron primero y se colocaron en tubos. La desparafinización y la rehidratación se llevaron a cabo con xileno estándar y lavado con alcohol. Posteriormente, los núcleos fueron disociados y permeabilizados. Para el RNA-seq total de un solo núcleo integral y de alto rendimiento, proporcionamos una estrategia con una química basada en cebadores aleatorios para capturar los RNA totales de longitud completa y una plataforma basada en gotitas fácil de operar para etiquetar un solo núcleo. Los ADN monocatenarios desnudos se bloquearon in situ mediante hibridación múltiple y extensión de cebadores de bloqueo. Los ADNc del ARN total se convirtieron in situ mediante hibridación múltiple de cebadores aleatorios y cebadores oligo(dT) en transcripción inversa. Para disminuir la tasa de doblete, involucramos una estrategia de indexación previa en el paso de transcripción inversa de acuerdo con el scifi-RNA-seq18 publicado. Los núcleos se dividieron en diferentes tubos para la transcripción inversa con cebadores aleatorios preindexados y luego se agruparon para la reacción posterior. Se agregaron colas de poli (dA) al extremo hidroxilo 3 'de los ADNc in situ mediante transferasa terminal (TdT). También establecimos una plataforma microfluídica para códigos de barras de núcleo único de alto rendimiento basada en nuestro trabajo anterior16,17. Durante la reacción de codificación de barras en gotitas, los cebadores poli(dT) se liberaron de las perlas mediante corte enzimático19 y, simultáneamente, los ADNc se liberaron del núcleo mediante la degradación del ARN. Luego, los cebadores poli(dT) se unieron con la cola poli(dA) en el extremo de los ADNc y se extendieron para agregar un código de barras específico a los ADNc en cada gota. Después del código de barras, rompimos las gotas, amplificamos el ADNc con código de barras y preparamos la biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) para la secuenciación de extremos emparejados.

El flujo de trabajo de snRandom-seq para tejidos FFPE incluye selección de muestras FFPE, disolución de parafina, aislamiento y permeabilización de núcleos únicos, bloqueo de ADN monocatenario, transcripción inversa, seguimiento de dA, código de barras de gotitas, liberación y extensión de cebadores, ruptura de gotitas y amplificación por PCR, y secuenciación. Círculo rojo discontinuo en el bloque de tejido FFPE: las áreas de interés. Recuadro azul discontinuo: las tres reacciones in situ, incluido el bloqueo de ADN monocatenario, la transcripción inversa, la cola dA. AAA: cola dA en el 3′ del cDNA. TTT: poli(dT) en los cebadores con código de barras poli(dT). Flechas grises: la dirección de extensión.

snRandom-seq utiliza cebadores aleatorios para capturar ARN total en núcleos individuales (Fig. 1), lo que difiere de los métodos actuales de RNA-seq de una sola célula basados en poli(A) y basados en sondas. Por lo tanto, realizamos un experimento estándar de especies mixtas con líneas celulares cultivadas humanas (293T) y de ratón (3T3) para evaluar la fidelidad de snRandom-seq. Las células 293T y 3T3 recién recolectadas se lisaron en núcleos y se mezclaron para la fijación. Los núcleos fijos se usaron para snRandom-seq (Fig. 1). Antes de continuar con la encapsulación de microfluidos, se tomaron imágenes de los núcleos para confirmar la morfología de un solo núcleo y se contaron (Fig. 1a complementaria). Se estableció una plataforma microfluídica de alto rendimiento para códigos de barras de células individuales/núcleos en snRandom-seq (Fig. 2a, Fig. 1b complementaria). Para la síntesis de perlas de código de barras, el dispositivo de generación de perlas de hidrogel y el dispositivo de encapsulación de células se diseñaron y fabricaron como se describió anteriormente20 (Fig. 2a complementaria). Se produjeron con precisión perlas de hidrogel de 40 μm de diámetro (Fig. 2b complementaria). Se realizaron tres rondas de ligamiento basado en división y agrupación en estas perlas de hidrogel para la síntesis de código de barras de ADN (Figura complementaria 2c, Tabla complementaria 2). La alta eficiencia de reacción de cada paso de ligadura se reflejó en el pico nítido en el electroferograma de los cebadores de código de barras liberados (Fig. 2d complementaria). El núcleo, la perla de código de barras y la mezcla de reactivos se compartimentaron conjuntamente en emulsiones de agua en aceite utilizando la plataforma de microfluidos (Fig. 2a) y cada núcleo individual se encapsuló en una gota con una perla de código de barras (Fig. 2b).

un dispositivo de encapsulación de microfluidos para códigos de barras de núcleos. b Imagen de una gota encapsulada que contiene una perla, un núcleo y una mezcla de reactivos. c Electroferograma de la biblioteca de ADNc de mezcla de núcleos 293T (humano) y 3T3 (ratón) para el analizador de fragmentos de ADN Qsep100™. Se mostraron los marcadores inferior (20 pb) y superior (1 kb). d Diagrama de código de barras para la identificación de los códigos de barras que representan núcleos verdaderos (línea roja). Los códigos de barras de los núcleos mixtos 293T-3T3 se ordenaron desde el recuento de genes más grande al más pequeño. e Gráfico de dispersión de mezcla de especies que muestra la eficiencia de captura de un solo núcleo y la tasa de doblete de snRandom-seq. f Especificidad de especie de UMI en la mezcla 293T-3T3. Núcleos 293T identificados: n = 1157, núcleos 3T3 identificados: n = 1086. La mediana de la especificidad de especie de UMI en 293T fue 0,992. La mediana de la especificidad de especie de los UMI en 3T3 fue de 0,986. g Porcentajes de lecturas asignadas a intrones y exones. Los diagramas de violín y los diagramas de caja mostraron el número de genes (h) y UMI (i) detectados en cada núcleo 293T y 3T3. Núcleos 293T filtrados: n = 1085, núcleos 3T3 filtrados: n = 1066. Los datos en el diagrama de caja correspondieron al primer y tercer cuartil (bisagras inferior y superior) y la mediana (centro). j Análisis de saturación de tres métodos. snRandom-seq usó núcleos 293T y 3T3; 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 usó células 293 T y 3T3; VASA-seq usó células 293T. k Lea la cobertura a lo largo del cuerpo del gen por los tres métodos. snRandom-seq usó núcleos 293T; 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 usó células 293T; VASA-seq usó células 293T. Los datos en (f, h, i) se presentaron como valores medianos. Los datos en el diagrama de caja en (f, h, i) correspondieron al primer cuartil (bisagras inferiores), tercer cuartil (bisagras superiores) y la mediana (centro). El bigote superior se extendía desde la articulación hasta el máximo a no más de 1,5 * IQR (rango intercuartílico) de la articulación. El bigote inferior se extendía desde la bisagra hasta el mínimo como máximo 1,5 * IQR de la bisagra. IQR es la distancia entre el primer y el tercer cuartil. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Después del código de barras y la amplificación, el tamaño del fragmento de la biblioteca de cDNA de la mezcla de humano y ratón alcanzó su punto máximo entre 300 y 800 bps (Fig. 2c), que no es necesario para fragmentar pero solo es adecuado para NGS. Después del procesamiento de datos, identificamos 2250 códigos de barras de núcleo únicos de alta calidad por la pendiente pronunciada significativa en el gráfico de rango de código de barras-gen (Fig. 2d), lo que sugiere una clara separación de los núcleos verdaderos del ruido de fondo. La tasa de captura de núcleos fue del 42,2 % y el porcentaje de lecturas asignadas a los núcleos verdaderos fue del 76 %. Contamos la proporción de lecturas asignadas a los genomas humano y de ratón en cada núcleo y descubrimos que los cebadores preindexados redujeron notablemente la tasa de doblete (del 2,9 % al 0,3 %) (Fig. 2e, Complementario 1c). La tasa de doblete de snRandom-seq es significativamente más baja que la de otros métodos sc/snRNA-seq basados en gotitas (sNucDrop-seq: ~2,6 %, VASA-drop: 3,1 %). De manera consistente, se observó una especificidad de especie muy alta de UMI (99%) (Fig. 2f), lo que sugiere que snRandom-seq produjo bibliotecas de núcleo único de alta fidelidad. Se calculó el porcentaje de las lecturas asignadas al exón o al intrón de los núcleos humanos y de ratón identificados, y los resultados mostraron que las lecturas asignadas al intrón eran tres veces las lecturas asignadas al exón (Fig. 2g). Además, se detectaron muchos ARN no codificantes largos (lncRNA) y ARN no codificantes cortos, incluido el ARN nucleolar pequeño (snoRNA), el ARN nuclear pequeño (snRNA) y el microARN (miARN) (Fig. 1d complementaria). Esos resultados sugirieron que snRandom-seq capturó transcripciones completas de manera integral.

La distribución del conteo de genes y UMI mostró que snRandom-seq capturó una mediana de 4141 genes y 11,594 UMI en un solo núcleo 293T al secuenciar un promedio de ~ 29k lecturas por núcleo 293T (Fig. 2h), y 3427 genes y 9795 UMI en un solo núcleo 3T3 por ~ 25k lecturas por núcleo 3T3 (Fig. 2i). Los resultados indicaron que snRandom-seq es más sensible que otros dos métodos de snRNA-seq de alto rendimiento basados en gotas informados (DroNc-seq21: promedio de 3295 genes y 4643 UMI con ~160k lecturas por núcleo para 5636 núcleos 3T3; sNucDrop-seq22: promedio de 2665 genes y 5195 UMI con ∼ 23k lecturas por núcleo para núcleos 3T3 de 1984) (Fig. 1e complementaria). El análisis de saturación mostró que la cantidad de genes detectados en snRandom-seq aún no había alcanzado el punto de saturación por 60k lecturas alineadas de forma única por núcleo 3T3 y 293T (Fig. 2j). También comparamos nuestros datos de snRNA-seq con la solución V323 de una sola célula de cromo 10X de alto rendimiento ampliamente utilizada y la última VASA-drop10 de alto rendimiento informada para scRNA-seq. A una profundidad de secuenciación baja (<10k), la sensibilidad de snRandom-seq en núcleos 3T3 y 293T es comparable con 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 en células 3T3 y 293T, así como VASA-drop en células 293T (Fig. 2j). A diferencia de la solución V3 3′ de una sola célula de cromo 10X basada en poli(A) con un sesgo obvio en el extremo 3′, tanto snRandom-seq como VASA-drop no mostraron un sesgo obvio en el extremo 3′ o 5′ en todo el cuerpo del gen (Fig. 2k). Como era de esperar, snRandom-seq tenía un ligero sesgo hacia el extremo 3 'debido a la adición adicional de cebador oligo (dT) en la transcripción inversa (Fig. 2k).

Para los tejidos FFPE, la digestión con proteinasa K podría aislar núcleos individuales más limpios que con colagenasa (Fig. 3a complementaria). Con un procedimiento optimizado (Fig. 1), se aislaron eficientemente núcleos individuales intactos de múltiples tejidos de ratón FFPE y una muestra clínica FFPE archivada de cáncer de hígado humano de 2 años de antigüedad (Fig. 3a, Fig. 4a complementaria), y los núcleos la morfología y la distribución de tamaños fueron comparables entre FFPE y muestras frescas (Fig. 4b complementaria).

a Imagen de núcleos individuales antes del código de barras de gotas y tinción por DAPI. Barra de escala, 50 μm. b Porcentaje de lecturas asignadas a diferentes regiones genómicas en diferentes condiciones. c, Electroferograma de la biblioteca de ADNc de riñón de ratón FFPE para el analizador de fragmentos de ADN Qsep100™. Marcador inferior: 20 pb; marcador superior: 1k pb. d Descripción general de FFPE/comparación fresca y experimento de replicación técnica. El coeficiente de correlación de Pearson (R) de las expresiones génicas normalizadas entre FFPE/muestras frescas (e) y muestras de replicación técnica (FFPE1, FFPE2) (f). Cada punto representa el nivel de expresión promedio de un gen. La línea roja indica la línea de regresión lineal. El valor p (p) se calculó a partir de la prueba de permutación bilateral. g Recuentos de diferentes biotipos de ARN detectados en muestra FFPE. h Comparación de detección de genes de tejidos de ratón (corazón, riñón, testículo e hígado) e hígado humano usando snRandom-seq con cerebro de ratón por snFFPE-seq15 y mama por snPATHO-seq14. Núcleos renales: n = 5795, núcleos hepáticos: n = 4287, núcleos cardíacos: n = 6732, núcleos testiculares: n = 3774, núcleos cerebrales: n = 7031, núcleos mamarios: n = 5721. Los datos se presentaron como valores medios. Los datos en el diagrama de caja correspondieron al primer cuartil (bisagras inferiores), tercer cuartil (bisagras superiores) y la mediana (centro). El bigote superior se extendía desde la bisagra hasta el máximo a no más de 1,5 * IQR de la bisagra. El bigote inferior se extendía desde la bisagra hasta el mínimo como máximo 1,5 * IQR de la bisagra. i Análisis de saturación de snRandom-seq basado en tejidos de ratón FFPE. j Lee la distribución a lo largo del cuerpo del gen mediante tres métodos diferentes de snRNA-seq (snRandom-seq, snFFPE-seq15 y 10X Chromium Fixed RNA Profiling). k Histograma que muestra los conjuntos de datos de porcentajes de cobertura de cuerpos genéticos generados por los tres métodos. l Lecturas sin procesar representativas alineadas con el gen humano C1S en snRandom-seq y 10X Chromium Fixed RNA Profiling. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En nuestro experimento piloto de secuenciación de ARNsn FFPE, se mapearon pequeñas lecturas alineadas de manera única a exones, con muchas lecturas mapeadas a regiones intergénicas debido a la contaminación del genoma (Fig. 3b). Teniendo en cuenta que la doble hélice del ADN en los tejidos FFPE puede interrumpirse después de sufrir una modificación química, se agregó un paso de bloqueo de ADN monocatenario al procedimiento inicial de snRandom-seq (Fig. 1, recuadro). Los ADN monocatenarios desnudos en el núcleo único FFPE aislado se bloquearon in situ mediante hibridación múltiple y extensión de cebadores de bloqueo en los ADN monocatenarios del genoma. Después del bloqueo del ADN, el porcentaje de regiones intergénicas se redujo drásticamente (Fig. 3b). La distribución de la región de mapeo fue comparable entre la muestra FFPE bloqueada con ADN, la muestra fresca y snFFPE-seq (10X Chromium Single Cell 3 'Solution V3), lo que respalda aún más la alta calidad de los datos de snRandom-seq (Fig. 3b). Al integrar los procedimientos anteriores, se generaron bibliotecas de ADNc de alta calidad mediante snRandom-seq a partir de múltiples tejidos FFPE (Fig. 3c, Fig. 4c complementaria, d). El tamaño del fragmento de las bibliotecas de cDNA de FFPE y muestras frescas alcanzó un máximo entre 300 y 800 bps (Fig. 3c, Fig. 4e complementaria).

Para determinar si snRandom-seq puede generar suficiente información a partir de tejidos FFPE como muestras frescas, recolectamos tanto FFPE como muestras frescas de los mismos tejidos de ratón y comparamos sus perfiles de ARN usando snRandom-seq (Fig. 3d). La calidad del ARN de FFPE y muestras frescas se evaluó en primer lugar mediante la distribución de fragmentos de ARN y DV200. Como se esperaba, la calidad del ARN de la muestra FFPE fue relativamente más pobre que la de la muestra fresca (Fig. 5a complementaria), lo que sugiere que el ARN en la muestra FFPE se degradó. Las pistas del navegador del genoma combinado de los resultados de snRandom-seq mostraron que las áreas de cobertura de lecturas de FFPE y las muestras frescas eran similares (Fig. 6a-g complementaria). De manera consistente, los perfiles de ARN total de FFPE y muestras frescas por snRandom-seq mostraron una buena correlación (R de Pearson: ~ 0.9, p < 2.2e-16; Fig. 3e, Fig. 7a complementaria, b). Mientras tanto, para probar la repetibilidad de nuestro método, la misma muestra FFPE se secuenció de forma independiente con snRandom-seq (Fig. 3d), y una alta correlación (Pearson R ~ 0.92, p < 2.2e-16) de los perfiles de expresión génica en estos también se observaron dos lotes (Fig. 3f). Estos resultados mostraron que snRandom-seq funcionó bien tanto en muestras frescas como FFPE.

A continuación, comparamos nuestros resultados FFPE con otros resultados FFPE snRNA-seq informados. Después del procesamiento de datos, miles de núcleos verdaderos en estos tejidos FFPE se identificaron con éxito a partir de los datos de snRandom-seq (Fig. 3h, Fig. 8a complementaria). snRandom-seq identificó un amplio espectro de biotipos de ARN en la muestra FFPE (Fig. 3g), con aproximadamente ocho veces más lncRNA que snFFPE-Seq, y solo se detectaron snoRNA, scaRNA y miRNA en snRandom-seq (Fig. 8b). Las medianas de los genes detectados por núcleo en conjuntos de datos snRandom-seq no saturados fueron todos superiores a 3000, significativamente más altos que los de otros dos métodos de snRNA-seq de alto rendimiento informados para muestras FFPE (snFFPE-Seq 10X Chromium Single Cell 3′ Solution V3: 276 genes/núcleo;snPATHO-Seq: 1850 genes/núcleo) (Fig. 3h), así como las medianas de los UMI (Fig. 8c complementaria). Nuestros datos aún no han alcanzado el punto de saturación, incluso secuenciando ~ 300k lecturas mapeadas por núcleo y detectando ~ 10,000 genes (Fig. 3i).

Además, comparamos la cobertura de ARN de snRandom-seq con los otros dos métodos FFPE snRNA-seq. En el gráfico de distribución de lecturas promedio en el cuerpo del gen, snFFPE-Seq usando cebadores oligo(dT) mostró un claro sesgo en el extremo 3′ y el perfilado de ARN fijado en cromo 10X usando la misma tecnología de base de sonda de snPATHO-seq mostró un ligero 5′. -sesgo final (Fig. 3j). Sin embargo, se observó una distribución homogénea en el cuerpo del gen en los datos de snRandom-seq para el tejido FFPE (Fig. 3j), lo que sugiere que los cebadores aleatorios se unieron uniformemente en las transcripciones y los cebadores extra oligo (dT) en snRandom-seq no eran válidos para la muestra FFPE . Para la cobertura de ARN a nivel de un solo núcleo, snRandom-seq mostró una cobertura mucho mayor que la de snFFPE-seq o 10X Chromium Fixed RNA Profiling (Fig. 3k). Para la cobertura de ARN a nivel de un solo gen, la distribución de lecturas a lo largo de tres genes seleccionados (C1S, EMG1, KLRG1) indicó la diferencia crítica entre la tecnología basada en sondas y la estrategia basada en cebadores aleatorios (Fig. 3l, Fig. 8d complementaria). Las lecturas mapeadas por 10X Chromium Fixed RNA Profiling se limitaron a las regiones objetivo de la sonda (<100 pb). Por el contrario, las lecturas mapeadas por snRandom-seq se distribuyeron uniformemente en las regiones exónica e intrónica. Estos resultados sugirieron que snRandom-seq para tejidos FFPE puede capturar una cantidad significativa de ARN de alta calidad y extraer mucha más información transcriptómica que las plataformas de última generación.

Luego comparamos los tipos de células identificados en FFPE y muestras frescas por snRandom-seq. La agrupación no supervisada del perfil de núcleo de riñón único de alta calidad filtrado anterior reveló más de diez grupos distintos. Todos los grupos podrían anotarse aún más en función de los marcadores clásicos de tipo celular conocidos24,25 (Fig. 4a, b, Fig. 9a complementaria). Las expresiones génicas de genes marcadores de tipo celular conocidos clásicos22, como Nphs1 para podocitos, Pecam1 para células endoteliales y Pdgfrb para células de tipo mesangial, se mapearon de manera confiable en los grupos correspondientes (Fig. 4b). El túbulo renal de los mamíferos en el riñón contiene al menos 16 tipos distintos de células epiteliales26. Aquí identificamos la mayoría de los términos recomendados para los tipos de células epiteliales del túbulo renal en muestras de riñón de ratón FFPE mediante snRandom-seq, incluido túbulo contorneado proximal, túbulo recto proximal, nefrona distal, túbulo contorneado distal, asa de Henle, células principales del conducto colector, podocitos , células tubulares proximales, células intercaladas del conducto colector y células del conducto colector (Fig. 4a). Además de los principales marcadores conocidos de los tipos de células, como Slc14a2 para las células del conducto colector, también descubrimos varios marcadores potenciales para estos tipos de células (Fig. 4c). Al fusionar los datos snRandom-seq de las muestras FFPE y la muestra fresca, así como el otro lote de muestras FFPE, obtuvimos un agrupamiento de celdas robusto por t-SNE (incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t) (Figura complementaria 9b). La mayoría de los tipos de células se identificaron en los tres conjuntos de datos snRandom-seq (Fig. 4d, Fig. 9c complementaria). Como era de esperar, hay algunas diferencias en la proporción de tipos de células de FFPE y muestras frescas (como PTC), que pueden deberse al error de muestreo y a los diferentes métodos de extracción de núcleos para FFPE y muestras frescas.

un análisis t-SNE de núcleos aislados de una muestra de riñón de ratón FFPE mediante snRandom-seq en función de sus expresiones génicas y coloreados por tipos de células identificados. Catorce tipos de células identificados se colorearon y se muestran a continuación. b Expresión de tres marcadores de tipo celular seleccionados en núcleos individuales en los mapas t-SNE de riñón de ratón FFPE. Los niveles de expresión génica se indican mediante tonos de rojo. c Diagrama de puntos de las expresiones promedio de los dos marcadores principales en cada uno de los 14 tipos de células. d Proporción de tipos de células anotadas de FFPE1, FFPE2 y muestras frescas por snRandom-seq. e t-SNE y análisis de velocidad de ARN de snRNA de testículos de ratón FFPE mediante snRandom-seq. La velocidad se muestra como flechas negras en diferentes tipos de celdas por colores separados. Las flechas negras indican la trayectoria de maduración del ARN. f Porcentajes de transcritos empalmados y no empalmados en diferentes tipos de células. g Análisis del ciclo celular de testículos de ratón FFPE mediante snRandom-seq. Los puntos en t-SNE se colorearon según las fases del ciclo celular identificadas (G1, G2M o S). Círculo rojo discontinuo: dos subpoblaciones de espermatocitos tardíos en la fase G2M con actividad transcripcional activa. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, agregamos más tejidos de ratón FFPE para demostrar la utilidad biológica de los datos de snRandom-seq. En total, secuenciamos y analizamos 19 258 núcleos individuales de cuatro tejidos de ratón FFPE (corazón, riñón, testículo e hígado) utilizando snRandom-seq e identificamos un total de 25 tipos de células (como hepatocitos, células germinales, fibroblastos, cardiomiocitos, etc. .). (Figura complementaria 10a, b). Se pudo observar una subrepresentación de las células inmunitarias, lo que es consistente con los hallazgos previos sobre la composición del tipo de célula por bibliotecas de RNA-seq de un solo núcleo27.

La gran proporción de secuencias intrónicas detectadas en muestras FFPE (Fig. 3b) sugirió que los datos de snRandom-seq serían más adecuados para el análisis de velocidad de ARN al distinguir los ARN recién transcritos (sin empalmar) de los ARN maduros (empalmados)28. A continuación, aplicamos snRandom-seq a testículos de ratón FFPE, donde la espermatogénesis es un excelente modelo para estudiar la dinámica celular. De manera consistente con otros estudios en testículos frescos por scRNA-seq29,30, t-SNE dispuso las células germinales en etapas de transición (principalmente espermatocito temprano y espermatocito tardío) para estar en sucesión continua. Por el contrario, las espermatogonias indiferenciadas y las espermátidas maduras se encuentran en grupos (Fig. 4e). Las velocidades calculadas por las transcripciones nacientes detectadas se visualizaron en el gráfico t-SNE, lo que revela distintas direcciones de vectores de velocidad en diferentes tipos de células, especialmente en las células ubicadas a la izquierda de los espermatocitos tempranos y tardíos (Fig. 4e, f). Combinado con el análisis de los estados del ciclo celular basado en la expresión génica, la velocidad del ARN reveló una trayectoria de maduración celular obvia en dos subpoblaciones de espermatocitos tardíos en la fase G2M con actividad transcripcional activa (Fig. 4g).

Finalmente, aplicamos snRandom-seq en una muestra clínica FFPE de aproximadamente dos años de edad del subtipo de carcinoma hepatocelular (CHC) macrotrabecular masivo (MTM) humano (Fig. 5a). Seleccionamos un área tumoral interesada en el bloque de parafina de acuerdo con los exámenes histopatológicos (Fig. 5b) y realizamos snRandom-seq. snRandom-seq identificó 5914 núcleos verdaderos y detectó una mediana de 3220 genes y una mediana de 8182 UMI por núcleo en esta muestra clínica FFPE (Figura complementaria 11a, Figura 5b). A medida que aumenta la profundidad de secuenciación, snRandom-seq detectó alrededor de 8000 genes en saturación (Figura complementaria 11b). Se detectó en la muestra un amplio espectro de biotipos de ARN, incluidos lncRNA, snRNA, miscRNA, miRNA y snoRNA (Fig. 11c complementaria). La agrupación no supervisada del núcleo único del hígado humano reveló varios grupos distintos. Los principales tipos de células del hígado humano podrían identificarse a partir de la muestra humana en función de los marcadores de tipos de células conocidos31, incluidos los hepatocitos (APOA1), las células de Kupffer (CD163), las células T (CD3E), los fibroblastos (PDGFB), las células plasmáticas (FCRL5 ) (Fig. 5d, Fig. 11d complementaria). En particular, un subgrupo de hepatocitos (hepatocito-2) se separó de la población principal de hepatocitos, con alta expresión del marcador proliferativo MKI67 y los otros dos marcadores (ASPM y TOP2A), que se informó que estaban relacionados con la progresión del CHC32,33. (Figura 5e). Mientras tanto, el análisis del ciclo celular de estos snRNA reveló que la mayoría de las células en el grupo de hepatocitos-2 estaban en la fase G2M (Fig. 5f), lo que sugiere que el grupo de hepatocitos-2 podría ser un grupo de células tumorales en división. Después de investigar más a fondo la comunicación celular entre los grupos (Fig. 5g), encontramos que el hepatocito-1 y el hepatocito-2 mostraban diferentes patrones de señalización entrante y saliente (Fig. 5h). El hepatocito-2 recibe principalmente señales de las células plasmáticas a través de la vía de señalización de BMP (Fig. 12a complementaria), que se informa que está correlacionada con la progresión tumoral en HCC34,35. El análisis de pares ligando-receptor encontró que las células plasmáticas envían preferentemente señales al hepatocito-2 mediante BMP6-(ACVR1 + ACVR2A) y la comunicación entre las células plasmáticas y el hepatocito-2 tiene pares específicos de ligando-receptor, incluidos BMP6-(BMPR1B + BMPR2), BMP6-(BMPR1B + ACVR2B), BMP6-(BMPR1B + ACVR2A), BMP6-(BMPR1A + ACVR2A) y BMP6-(ACVR1 + ACVR2A) (Fig. 5i). La expresión génica también mostró que BMPR1B y ACVR2A tienen expresiones específicas en el hepatocito-2 (Fig. 12b complementaria). En conjunto, snRandom-seq descubrió una subpoblación proliferativa y activada de hepatocitos de una muestra clínica FFPE, lo que proporciona una pista valiosa para estudios adicionales en el futuro.

una descripción general experimental de la muestra clínica FFPE del subtipo de carcinoma hepatocelular masivo macrotrabecular humano (MTM-HCC) para snRandom-seq. b Aspecto histológico de MTM-HCC a bajo aumento (izquierda, barra de escala, 5 mm.) y alto aumento (derecha, barra de escala, 200 μm). Círculo rojo discontinuo: área tumoral. Línea y círculo discontinuo azul: área de muestreo. Línea y círculo discontinuo blanco: área ampliada. c Gráficos de violín y gráficos de caja que muestran el número de genes y UMI detectados en una muestra humana clínica FFPE mediante snRandom-seq. Núcleos MTM-HCC: n = 5914. Los datos se presentaron como valores medios. Los datos en el diagrama de caja correspondieron al primer y tercer cuartil (bisagras inferior y superior) y la mediana (centro). Los datos en el diagrama de caja correspondieron al primer cuartil (bisagras inferiores), tercer cuartil (bisagras superiores) y la mediana (centro). El bigote superior se extendía desde la bisagra hasta el máximo a no más de 1,5 * IQR de la bisagra. El bigote inferior se extendía desde la bisagra hasta el mínimo como máximo 1,5 * IQR de la bisagra. d Mapa t-SNE de núcleos aislados de la muestra FFPE en función de sus expresiones génicas. Se anotaron y mostraron seis tipos de células, incluidos dos subtipos hepatocelulares. e Los tres marcadores principales de cada uno de los seis tipos de células. f Porcentajes de núcleos en fase G1, G2M o S en los seis tipos celulares. g El número total de interacciones entre diferentes poblaciones celulares. Los tamaños de los círculos representaban el número de celdas en cada grupo de celdas y el ancho de los bordes representaba la probabilidad de comunicación. h El mapa de calor que muestra los patrones de señalización salientes (izquierda) y los patrones de señalización entrantes (derecha) de cada grupo de células. i Diagramas de burbujas que muestran la probabilidad de comunicación y la importancia estadística de los pares de receptor-ligando en la red de señalización de BMP. El color del punto representaba las probabilidades de comunicación y el tamaño del punto representaba los valores p calculados. Los espacios vacíos significan que la probabilidad de comunicación era cero. Los valores de p se calcularon a partir de la prueba de permutación unilateral. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

snRandom-seq también se realizó en una muestra FFPE de subtipo de CHC normal humano (Fig. 13a complementaria). Según los datos de snRandom-seq, se detectaron suficientes recuentos de genes y UMI, y se identificaron los principales grupos de células del hígado (Fig. 13b, c complementarias). Estudios previos han indicado que los lncRNA exhiben una expresión específica de tejido36,37, que siempre se ignora en el análisis rutinario de RNA-seq de una sola célula debido a su baja expresión. Descubrimos que los grupos de hepatocitos del subtipo HCC normal tenían una expresión notable de lncRNA, incluidos LINC02476 y LINC01151 en hepatocito-2, LINC00540, LINC02307 y LINC02109 en hepatocito-3, LINC02384 en hepatocito-4 (Fig. 13d complementaria). Se ha informado que LINC02476 promueve el fenotipo maligno de CHC mediante la esponja de miR-497 y el aumento de la expresión de HMGA238, y LINC00540 influye en la progresión y metástasis del CHC humano a través de la vía Wnt/β-catenina dependiente de NKD239. Estos resultados sugirieron que el hepatocito-2 (expresado en LINC02476) y el hepatocito-3 (expresado en LINC00540) del subtipo de HCC normal podrían exhibir una patogénesis diferente. En conjunto, snRandom-seq con las ventajas de la cobertura de transcripciones de longitud completa se muestra prometedor en el análisis de lncRNA en biología del cáncer.

Además, realizamos una aplicación de snRandom-seq en un par emparejado de muestras clínicas FFPE iniciales y recidivantes del mismo paciente con metástasis hepática de cáncer colorrectal (CRLM). snRandom-seq detectó medianas de ~ 1000 recuentos de genes y ~ 2000 recuentos de UMI en muestras FFPE tanto iniciales como recidivantes (Fig. 14a complementaria). Las células de los especímenes FFPE iniciales y recidivantes se integraron exhaustivamente y los principales tipos de células (hepatocitos, células cancerosas, células T, fibroblastos, células mieloides, células endoteliales, células estrelladas, macrófagos, colangiocitos, células B/plasmáticas) se identificaron en ambas muestras (Fig. 14b, c complementarias). Observamos que la proporción de células T fue mayor en la muestra FFPE recidivante (Fig. 14d complementaria), lo que sugiere una respuesta inmune antitumoral más activa en la muestra recidivante. De manera constante, las proporciones de los grupos de cáncer dominantes (células cancerosas 1, -2 y -3) se redujeron en la muestra recidivante (Fig. 14d complementaria). Sin embargo, la proporción de células cancerosas-4 aumentó en la muestra recidivante (Fig. 14d complementaria). Además, encontramos que los genes que codifican el regulador de la composición de lípidos (SCD) y los lípidos que se unen a las proteínas (APOA2, APOC3 y APOA1) mostraron altos niveles de expresión en el grupo de células cancerosas-4 en la muestra recidivante (Fig. 14e complementaria), lo que sugiere un lípido mejorado metabolismo en el subgrupo de células cancerosas del CRLM recidivante.

Desarrollamos un método snRNA-seq de alto rendimiento basado en gotitas para tejidos FFPE archivados mediante el uso de cebadores aleatorios para capturar ARN totales de longitud completa de núcleos únicos de manera sensible y completa, lo que, por lo tanto, proporciona un avance fundamental para perfilar el transcriptoma de núcleos únicos de tejidos FFPE o otro tipo de muestras biológicas de baja calidad. Vale la pena señalar que snRandom-seq utiliza procedimientos de biología molecular de rutina y una plataforma madura de códigos de barras de microfluidos que es similar a la popular plataforma 10X Genomics actual. Por lo tanto, snRandom-seq es fácil de operar y comercializar para aplicaciones a gran escala.

La aplicación de biología molecular de los tejidos FFPE siempre ha sido un desafío debido al ARN reticulado químico y de baja calidad. Aunque los núcleos individuales podrían aislarse de los tejidos FFPE y el entrecruzamiento del ARN podría revertirse mediante calor y digestión con proteasa, la popular estrategia de captura de ARN basada en oligo(dT) no es eficiente con estas muestras de baja calidad, como lo demuestra el snFFPE-seq con 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 platform15, así como el cebador oligo(dT) no válido en nuestro snRandom-seq. snPATHO-Seq14, que adoptó la tecnología basada en sondas 10X Genomics para el núcleo FFPE, puede reflejar las firmas genéticas de los genes de interés, mientras que solo se dirige a una parte muy pequeña de los transcriptomas. Mientras utilizamos el enfoque basado en cebadores aleatorios, podemos realizar perfiles de transcripción de un solo núcleo imparciales de manera eficiente en las muestras FFPE. También prevemos una integración de la química snRandom-seq con la tecnología de código de barras espacial3,40, que permite un análisis de expresión génica espacial integral y de alta sensibilidad en tejidos FFPE, junto con la histología de rutina. Microbe es otro tipo de muestra desafiante para scRNA-seq, cuyo contenido de mRNA es muy bajo y generalmente carece de colas de poli(A) en el extremo 3′41. Estamos intentando modificar snRandom-seq y expandir su aplicación en RNA-seq de un solo microbio de alto rendimiento y alta sensibilidad.

En comparación con los métodos de snRNA-Seq de alto rendimiento de última generación en las muestras FFPE14,15, snRandom-seq supera estos métodos desde varias perspectivas, respaldado por los rendimientos decentes en la identificación de tipos de células, el análisis de expresión diferencial y el ciclo celular. análisis de fases. Los datos de snRNA-seq de alta calidad y alta sensibilidad de muestras clínicas FFPE por snRandom-seq permiten revelar genes diana específicos del tipo de célula o identificar subpoblaciones raras de diagnóstico y tratamiento de precisión para enfermedades humanas. Además, los cebadores aleatorios permiten que snRandom-Seq cubra más regiones del cuerpo del gen, lo que permite la detección de una gran cantidad de ARN no codificantes y la utilidad adicional de las transcripciones nacientes en el análisis de la velocidad del ARN. Hemos utilizado transcripciones nacientes para el análisis de la velocidad del ARN y revelamos una trayectoria de maduración celular obvia en dos subpoblaciones específicas en este estudio. Además, estos conjuntos de datos completos de snRNA-seq totales permiten un análisis exhaustivo de la variación del número de copias (CNV), el empalme alternativo y las mutaciones a nivel de una sola célula/núcleo.

En conclusión, se espera que los protocolos experimentales simples y la información transcriptómica integral de los tejidos FFPE descritos en este estudio permitan que snRandom-seq tenga aplicaciones a gran escala en investigaciones básicas y clínicas en el futuro.

Todos los procedimientos que involucraron ratones en este estudio fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Zhejiang (números de aprobación: ZJU20170466). La recolección de muestras humanas y la investigación realizada en este estudio fueron aprobadas por el Comité de Ética de Investigación del Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (números de aprobación: IIT20220893A). La información clínica se recopiló después del consentimiento informado por escrito. Este estudio cumple con la Guía del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) para la revisión y aprobación de los recursos genéticos humanos (números de aprobación: 2023BAT0303).

Las células HEK293T (Cat. CL-0005) y las células 3T3 (Cat. CL-0006) se solicitaron a la empresa (Procell Life Science & Technology). Se ordenaron ratones macho C57BL6/J de tipo salvaje (6 a 8 semanas de edad) a Shanghai SLAC Laboratory Animal. Solo se utilizaron ratones machos en el estudio. El sexo se determinó en base a estudios similares en este campo. Los ratones se alojaron en una sola casa en condiciones estándar de laboratorio, incluido un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperaturas de 18 a 23 °C con 40 a 60 % de humedad, con libre acceso a la dieta y el agua del ratón. Todos los experimentos se ajustaron a las normas reglamentarias pertinentes del Centro de animales de laboratorio de la Universidad de Zhejiang. Las muestras FFPE de tejidos de ratón fueron preparadas por Core Facilities, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Los tejidos FFPE de cánceres humanos clínicos fueron proporcionados por el Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Los tejidos FFPE de carcinoma hepatocelular masivo macrotrabecular y HCC normal se recolectaron de dos pacientes chinos masculinos (edad 43 y 45, respectivamente) mediante resección quirúrgica. El par emparejado de especímenes clínicos FFPE inicial y recidivante se obtuvo del mismo paciente chino masculino (edad inicial 62, edad recidivante 64) con metástasis hepática de cáncer colorrectal. La información clínica se recolectó después de escribir el consentimiento informado.

Las células HEK293T y las células 3T3 se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Cat # 11965092), complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v) (FBS, Gibco, Cat # 26010074) y se cultivaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% (Thermo Heracell 240i). Ambas células se pasaron cada 2 días. Para el experimento de mezcla de especies, se recolectaron células HEK293T y células 3T3 y se lavaron tres veces en PBS mediante centrifugación a 4 °C, 600 g durante 3 min. Las células se lisaron con tampón de lisis de núcleos preenfriado (1X PBS con Nonidet P-40 al 0,1 % (NP-40, Aladdin, n.º de cat. N274254) y 1 U/μl de inhibidor de RNasa (Invitrogen, n.º de cat. N8080119)) incubando a 4 °C. C durante 5 min. Luego, los núcleos frescos se lavaron tres veces y se fijaron agregando 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA, Aladdin, Cat # P395744) en PBS e incubando a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, el PFA se descartó por centrifugación a 600 g durante 3 min, y los núcleos se lavaron tres veces con 1 mL de tampón de lavado prefrío (1X PBS con 1 U/μL de inhibidor de RNasa). Los núcleos se permeabilizaron mediante la adición de 500 µl de Triton X-100 al 0,1 % (Aladdin, n.º de cat. T109027) diluidos en tampón de lavado previo en frío y se incubaron a 4 °C durante 5 min. Luego, se agregó 1 ml de tampón de lavado directamente a los núcleos y los núcleos se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de lavado preenfriado. Los núcleos HEK293T y 3T3 se contaron respectivamente y se mezclaron por igual. Luego, la mezcla se procesó en un solo núcleo RNA-seq de acuerdo con el siguiente protocolo snRandom-seq.

Las muestras de FFPE se cortaron del bloque de parafina y se lavaron dos veces con 1 ml de xileno (Aladdin, Cat # X112054) durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar la parafina. Las muestras se rehidrataron suavemente sumergiéndolas en una serie graduada de soluciones de etanol (Aladdin, Cat # E130059), comenzando con etanol puro al 100 % y terminando con etanol al 30 %. Luego, las muestras se lavaron dos veces con tampón de lavado prefrío y se homogeneizaron con el homogeneizador Dounce (Bellco Glass, Inc. Dounce Homogenizer 2 mL, Cat # 50-194-5204) con la presencia de tampón de lisis prefrío (tampón PBS 1X, Triton X-100 al 0,1 %, inhibidor de RNasa 1 U/μL) en hielo. Después de la homogeneización, se usó 1 mL adicional de tampón de lisis para enjuagar el dosificador y se agregaron 100 μL de 10 mg/mL de proteinasa K (Sangon Biotech, Cat # A610451) al tampón de lisis, incubando a 37 °C durante 5 min. . Luego, los núcleos aislados se filtraron a través de un filtro de células de 20 μm (pluriSelect, Cat # 43-10020-40) y se lavaron dos veces con tampón de lavado. Una alícuota de núcleos se tiñó con solución de tinción DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) (Abcam, Cat # ab228549), se cargó en un hemocitómetro y se observó bajo un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse, Ts2-FL). Los núcleos únicos calificados se procesaron a núcleos únicos RNA-seq de acuerdo con el siguiente protocolo snRandom-seq. Se proporcionó un protocolo detallado, incluido el volumen del tampón de lisis y el tampón de permeabilización, los sistemas de reacción y los programas de reacción, en el archivo de información complementaria (Nota complementaria 1: protocolo snRandom-seq 1.0).

Se recogieron muestras frescas de tejidos de ratón adulto del mismo ratón para muestras FFPE. Las muestras frescas se lavaron dos veces con tampón de lavado prefrío, se cortaron en trozos y se homogeneizaron con un homogeneizador Dounce con tampón de lisis prefrío en hielo. Después de la homogeneización, los núcleos aislados se lavaron dos veces con tampón de lavado. Los núcleos únicos frescos se fijaron, permeabilizaron y calificaron de acuerdo con el protocolo de línea celular, y luego se procesaron en RNA-seq de núcleos únicos de acuerdo con el siguiente protocolo snRandom-seq.

Se cortaron por separado dos muestras idénticas de riñón de ratón FFPE del mismo bloque de parafina y luego se procesaron con el protocolo snRandom-seq.

Se contaron los núcleos FFPE calificados y se utilizó un total de 100 000 a 1 000 000 núcleos para el bloqueo de ADN in situ. Se preparó la siguiente mezcla de reacción: núcleos en 25,5 µL de PBS, 5 µL de cebador de bloque 10 µM, 2 µL de ADN polimerasa, 10 µL de tampón de polimerización de ADN 5X, 5 µL de dNTP 100 mM, 2,5 µL de inhibidor de RNasa. La secuencia del cebador de bloque se proporcionó en el archivo de información complementaria (Tabla complementaria 1: Cebadores). El kit de ADN polimerasa se incluyó en el kit VITAPilote-EFT1300 (Cat # R20123124) pedido a M20 Genomics. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 30 min. Después de la incubación, los núcleos se lavaron con PBST (1X PBS con T-ween 20 al 0,05 %) tres veces para eliminar por lavado los cebadores de bloqueo y los dímeros de cebadores residuales.

In situ, la transcripción inversa se realizó utilizando la siguiente mezcla de reacción: 100 000–1 000 000 núcleos en 22,5 µL de PBS, 5 µL de cebador aleatorio 10 µM, 5 µL de cebador oligo(dT) 10 µM, 2,5 µL de transcriptasa inversa, 10 µL de cebador 5X inverso tampón de transcripción, 2,5 µl de dNTP 100 mM, 2,5 µl de inhibidor de RNasa. Las secuencias del cebador aleatorio y el cebador oligo (dT) se proporcionaron en el archivo de información complementaria (Tabla complementaria 1: cebadores). El kit de transcripción inversa se incluyó en el kit VITAPilote-EFT1300 (Cat # R20123124) pedido a M20 Genomics. La mezcla de reacción se incubó con doce ciclos de recocido múltiple desde 8 °C hasta 42 °C y 30 min a 42 °C. Después de la transcripción inversa, los núcleos se lavaron con PBST tres veces para eliminar el cebador aleatorio residual y los dímeros de cebador.

Para la cola dA, se preparó la siguiente mezcla de reacción: 100 000–1 000 000 de núcleos en 39 µL de PBS, 5 µL de tampón de reacción 10X TdT, 0,5 µL de enzima TdT, 0,5 µL de dATP 100 mM (NEB, n.° de cat. N0440S), 5 µL de CoCl2 . El kit de reacción de TdT se solicitó a NEB (n.° de catálogo M0315S), que incluye tampón de reacción de TdT 10X, enzima de TdT y CoCl2. La mezcla de reacción de colas de dA se incubó a 37 °C durante 30 min y luego se lavó tres veces con PBS con Tween 20 al 0,05 %.

Los dispositivos microfluídicos se diseñaron utilizando AutoCAD (2021, AutoDESK, EE. UU.) de acuerdo con nuestro trabajo anterior17. Los diseños asistidos por computadora se imprimieron como fotomáscaras para solidificar un patrón en relieve como maestro en una oblea de silicio. El diseño del dispositivo se proporciona en el Suplemento 1a y el Suplemento 2a. La profundidad del canal en los dispositivos para perlas de hidrogel es de 30 μm y para la encapsulación de células es de 50 μm. Los dispositivos de microfluidos se fabricaron utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) de acuerdo con el protocolo descrito42. La base de PDMS y los agentes de curado (10:1, peso/peso) se mezclaron con Thinky Mixer y se marcaron en canales utilizando el patrón como molde. Luego se adquirió una losa de PDMS y se perforaron los puertos de entrada y salida. El lado del canal se trató con plasma de oxígeno y la losa de PDMS se unió con un portaobjetos de vidrio para obtener el dispositivo de microfluidos. Trate las superficies de los canales con perfluorododeciltriclorosilano para que el recubrimiento fluorofílico produzca gotas monodispersas y confiables antes de usar este dispositivo.

Diseñamos las microesferas con código de barras basándonos en trabajos anteriores16,17 y las personalizamos con la empresa M20 Genomics. Las perlas de hidrogel se sintetizaron mediante la emulsificación microfluídica y la polimerización de la mezcla de acrilamida y cebador. La mezcla de imprimación de acrilamida contiene 1 solución de acrilamida:bis-acrilamida (Invitrogen, Cat. n.° AM9022), 50 μM de oligonucleótidos modificados con acridita, 10 % p/vol de persulfato de amonio (APS, Sangon Biotech Cat. n.° A100486-0025) y 1 ×Tampón de solución salina-EDTA-Triton tamponada con Tris (TBSET). En este estudio, el oligonucleótido modificado con acridita se diseñó para contener una base de desoxiuridina, en lugar de un resto fotoescindible. Luego, las perlas se dividieron en una placa de 96 pocillos dentro de cebadores de código de barras únicos para ligaciones de 3 pasos en lugar de reacciones de extensión de 2 pasos. Las secuencias de los cebadores de códigos de barras se proporcionaron en el archivo de información complementaria (Tabla complementaria 1: Cebadores).

El código de barras de las gotas se realizó de acuerdo con trabajos previos16,17. La morfología de los núcleos individuales después de las reacciones in situ se observó mediante microscopio óptico. Se contaron los núcleos individuales y se diluyeron con una solución de gradiente de densidad al 30%. Los núcleos, la mezcla de reacción de extensión de ADN 2X y las perlas con código de barras se encapsularon en gotitas usando la plataforma de microfluidos como se describió anteriormente. La mezcla de reacción de extensión de ADN 2X se solicitó a M20 Genomics. Luego, las emulsiones se incubaron a 37 °C durante 1 h, 50 °C 30 min, 60 °C 30 min y 75 °C 20 min. Después de la reacción del código de barras, las gotas se rompieron mezclándolas con tampón PFO. La fase acuosa se extrajo y se purificó con perlas Ampure XP (Beckmen, Cat #A63881). Se realizó una PCR para amplificar el producto purificado con los cebadores Primer1 y Primer2 (Tabla complementaria 1). El producto amplificado se purificó con perlas Ampure XP y se cuantificó con Qubit (Invitrogen).

Después de la amplificación y la purificación, se utilizó el kit de preparación de bibliotecas de ADN universal VAHTS para Illumina V3 (Vazyme, n.° de catálogo ND607-01) para construir la biblioteca. El ADN de entrada se cuantificó mediante Qubit2.0 (Life Technologies) y el tamaño se midió con el analizador de fragmentos de ADN Qsep100™ (BIOptic). Luego se realizaron la reparación de extremos y la adenilación. La mezcla de reacción que contenía ADN fragmentado (50 ng), tampón de reparación de extremos, enzimas de reparación de extremos y agua libre de nucleasas se incubó a 30 °C durante 30 min y se inactivó a 65 °C durante 30 min. La mezcla de reacción de preparación final terminada se añadió con adaptador de trabajo y enzimas de ligadura y luego se incubó a 20 °C durante 15 min. El ADN ligado se purificó y el tamaño se seleccionó con perlas AMPure XP (Beckmen, Cat #A63881). Se siguió la amplificación de la biblioteca y se realizó la purificación con perlas AMPure XP. La biblioteca final se cuantificó con Qubit2.0 y el tamaño de la biblioteca se midió con el analizador de fragmentos de ADN Qsep100™. La secuenciación de la biblioteca se realizó con NovaSeq 6000 y el kit de reactivos S4 con lecturas emparejadas de 150.

En primer lugar, las secuencias de cebadores y las bases adicionales generadas por el paso de cola dA se recortaron en los datos de secuenciación sin procesar. Luego, para cada Lectura 1, extrajimos UMI (8 nts) y un código de barras específico de celda (30 nts) y fusionamos códigos de barras secuenciados que se pueden asignar de forma única al mismo código de barras aceptado con una distancia de Hamming de 2 nts o menos. Read2 se utilizó para generar la matriz de expresión génica mediante el módulo STARsolo en STAR (2.7.10a) con parámetros razonables. Los núcleos válidos fueron identificados por STARsolo. Bedtools (2.26.0) se utilizó para calcular la cobertura del transcriptoma. Se usó IGV (2.13.2) para generar un gráfico de cobertura del genoma. Se usó ggplot2 (3.3.5) en R (4.2.1) para generar diagramas sin procesar.

La matriz de expresión génica filtrada por código de barras se generó con los ARN mitocondriales y los ARN ribosómicos eliminados. El análisis y la visualización de datos de snRNA-seq se realizaron con el kit de herramientas RStudio y Seurat 3, incluido el preprocesamiento, la integración, la visualización, la agrupación, la identificación de tipos de células y las pruebas de expresión diferencial. Se filtraron los núcleos con menos de 200 genes detectados y los genes detectados en menos de tres núcleos. Para la integración de conjuntos de datos de snRNA-seq, los recuentos primero se normalizaron mediante la función sctransform en Seurat43 y se integraron mediante el análisis de correlación canónica (CCA)44. Las integraciones se realizaron en las muestras de comparación FFPE/frescas (FFPE1, FFPE2 y frescas). Para cada muestra, se identificaron 2000 anclajes y los conjuntos de datos snRNA-seq se integraron con la función IntegrateData utilizando 20 dimensiones44. Los conjuntos de datos integrados se construyeron en el gráfico del vecino más cercano compartido (SNN) mediante la ejecución del análisis de componentes principales (PCA), FindNeighbors con 30 PC, la función FindClusters con una resolución de 1. Los clústeres se visualizaron utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) de los componentes principales implementados en Seurat. Las identidades de tipo celular para cada grupo se determinaron manualmente utilizando la lista publicada de genes marcadores. Los genes marcadores se identificaron mediante la función FindAllMarkers en Seurat y mantuvieron los genes marcadores que coincidían con los criterios del filtro (only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, logfc.threshold = 0,25). Las fases del ciclo celular se predijeron utilizando una función incluida en Seurat que puntúa cada célula en función de la expresión de genes marcadores canónicos para las fases S y G2/M.

Para comparar el nivel de expresión génica entre FFPE y la muestra fresca, así como entre las dos réplicas técnicas, importamos los datos de conteo a Seurat (v3 y v4.1.1), normalizamos y escalamos los datos con la configuración predeterminada. Luego calculamos la expresión normalizada promedio utilizando la función AverageExpression de Seurat. Después de eso, trazamos el logaritmo natural de la expresión promedio con un pseudo recuento agregado y calculamos el coeficiente de variación y el valor p usando ggpubr (0.4.0) en R (4.2.1).

Los archivos de salida de los datos de snRandom-seq se procesaron con scVelo (versión 0.2.4) para etiquetar las transcripciones empalmadas y no empalmadas, y los resultados se analizaron con el paquete velocyto.R 0.6 en R.

El análisis de comunicación celular se realizó utilizando el paquete R CellChat (versión 1.6.1) con parámetros predeterminados.

Los detalles estadísticos de cada experimento se proporcionan en las leyendas de las figuras. El experimento de encapsulación de microfluidos, el experimento de aislamiento de núcleo único FFPE, el experimento de síntesis de perlas, el experimento de análisis de fragmentos de ADN, el experimento de comparación de proteinasa K y colagenasa y el experimento de comparación de calidad de ARN (DV200) se repitieron más de cinco veces de forma independiente con resultados similares. El experimento de mezcla 293T-3T3 y el experimento de bloqueo de ADN se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos snRandom-seq snRNA-seq generados en este estudio se han depositado en Genome Sequence Archive con el código de acceso "CRA010745" (mezcla 293T-3T3 y tejidos FFPE de ratón) y "HRA003712" (muestras MTM-HCC y HCC FFPE normales) . Los datos públicos de scRNA-seq de la mezcla de células 293T y 3T3 por 10X Chromium Single Cell 3′ Solution V3 utilizados en este estudio están disponibles en el archivo de lectura breve con el código de acceso "SRP073767". Los datos públicos de scRNA-seq de células 293T por VASA-drop están disponibles en Gene Expression Omnibus con el código de acceso "GSE176588". Los datos fuente se proporcionan en este documento.

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El proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32200073, YW, No. 82200977, ZX) y el Programa de Introducción al Equipo Líder Innovador y Emprendedor de Zhejiang (No. 2021R01012, YW). Gracias por el apoyo técnico de las instalaciones centrales del Centro Médico de la Universidad de Zhejiang y el Laboratorio Liangzhu. Agradecemos a Jingyao Chen y Chengcheng Zhang de Core Facilities, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang por su apoyo técnico.

Estos autores contribuyeron por igual: Ziye Xu, Tianyu Zhang, Hongyu Chen.

Departamento de Medicina de Laboratorio, Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Ziye Xu, Yu Chen y Yongcheng Wang

Laboratorio Liangzhu, Centro Médico de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Ziye Xu, Yuyi Zhu, Yuexiao Lv, Haide Chen, Guoji Guo y Yongcheng Wang

Genómica M20, Hangzhou, China

Tianyu Zhang, Shengyu Ni, Fangru Lu, Zhaolun Wang, Hao Yang, Ling Dong y Jiong Liu

Facultad de Medicina, Universidad de la ciudad de Hangzhou, Hangzhou, China

Hongyu Chen y fan de Longjiang

Instituto de Bioinformática, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Hongyu Chen y fan de Longjiang

Instituto James D. Watson de Ciencias del Genoma, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Hongyu Chen y fan de Longjiang

Facultad de Ingeniería Biomédica y Ciencias de Instrumentos, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Shunji Zhang, Hong Zhang y Yongcheng Wang

Departamento de Informática Biomédica, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, EE. UU.

Jiaye Chen

Departamento de Radiología, Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

lili yang y feng chen

Departamento de Cirugía Colorrectal, Primer Hospital Afiliado, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Weiqin-jiang

Departamento de Medicina Nuclear y Centro PET/CT, Segundo Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

hong zhang

Departamento de Patología y Departamento de Oncología Médica del Segundo Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

dandan zhang

Departamento de Patología, Laboratorio Clave de Proteómica de Enfermedades de la Provincia de Zhejiang, Escuela de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

dandan zhang

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YW y ZX concibieron el estudio y escribieron el artículo. YW, GG y JL diseñaron el proyecto. ZX, YZ, SZ, HDC, YL, HY y LD desarrollaron la química snRandom-seq. ZX, TZ, LF, HYC, JC, SN, FL, ZW, DZ e YC analizaron los datos. YW, SZ e YL construyeron la plataforma de microfluidos. LY, WJ, FC y HZ contribuyeron al experimento humano FFPE. YW, GG y LF supervisaron este proyecto. Todos los autores han revisado y aprobado el manuscrito final.

Correspondencia a Longjiang Fan, Guoji Guo o Yongcheng Wang.

YW y ZX han presentado una solicitud de patente a la oficina de patentes china relacionada con el método de este trabajo (número de solicitud: CN 114507711 A). Múltiples autores están involucrados en la comercialización de la técnica y colaboran con M20 Genomics, Inc. (LD y JL son cofundadores y empleados; YW y GG son cofundadores, accionistas y consultores; TZ y SN son empleados). los autores restantes no declaran intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a Rui Chen y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Xu, Z., Zhang, T., Chen, H. et al. Secuenciación de ARN total de núcleo único de alto rendimiento de tejidos incluidos en parafina fijados con formalina mediante snRandom-seq. Nat Comun 14, 2734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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Recibido: 10 noviembre 2022

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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