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May 27, 2023

Estudio ultraestructural confirma la formación de células sincitiales únicas y heterotípicas en fluidos broncoalveolares de COVID

Revista de virología

Virology Journal volumen 20, Número de artículo: 97 (2023) Citar este artículo

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Se informó que el SARS-CoV-2 induce fusiones celulares para formar sincitios multinucleares que podrían facilitar la replicación viral, la diseminación, la evasión inmune y las respuestas inflamatorias. En este estudio, informamos los tipos de células involucradas en la formación de sincitios en diferentes etapas de la enfermedad COVID-19 a través de microscopía electrónica.

Líquidos broncoalveolares desde leve (n = 8, SpO2 > 95 %, sin hipoxia, dentro de los 2 a 8 días de la infección), moderado (n = 8, SpO2 90 % a ≤ 93 % con aire ambiente, frecuencia respiratoria ≥ 24/min , disnea, dentro de los 9 a 16 días de la infección) y pacientes con COVID-19 graves (n = 8, SpO2 < 90 %, frecuencia respiratoria > 30/min, soporte de oxígeno externo, después de los 17 días de la infección) fueron examinados por PAP ( identificación del tipo de célula), inmunofluorescencia (para el nivel de infección viral), microscopía electrónica de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) para identificar los sincitios.

Los estudios de inmunofluorescencia (anticuerpos específicos de proteína S) de cada sincitio indican un nivel de infección muy alto. No pudimos encontrar células sincitiales en pacientes levemente infectados. Sin embargo, se observó fusión inicial de la membrana plasmática idéntica (neutrófilos o neumocitos tipo 2) y heterotípica (neutrófilos-monocitos) (que indica el inicio de la fusión) bajo TEM en pacientes moderadamente infectados. Se encontraron células sincitiales completamente maduras de gran tamaño (20–100 μm) en pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (similar al SDRA) de origen de neutrófilos, monocitos y macrófagos bajo SEM.

Este estudio ultraestructural de las células sincitiales de pacientes con COVID-19 arroja luz sobre las etapas de la enfermedad y los tipos de células involucradas en las formaciones de sincitios. La formación de sincitios se indujo primero en neumocitos tipo II por fusión homotípica y luego con células hematopoyéticas (monocitos y neutrófilos) por fusión heterotípica en la etapa moderada (9-16 días) de la enfermedad. Los sincitios maduros se informaron en la fase tardía de la enfermedad y formaron grandes células gigantes de 20 a 100 μm.

Los sincitios son células multinucleadas inusualmente grandes generadas por la fusión de dos o más tipos de células similares/diferentes bajo influencias externas/internas como moléculas/infección por virus [1]. La membrana plasmática de dos o más células se fusiona para formar una sola bicapa lipídica, lo que resulta en la fusión del citoplasma pero no del núcleo [2, 3]. Naturalmente, la formación de sincitios estuvo mediada por proteínas fusógenas y se informó en las fibras musculares, las barreras placentarias y los osteoclastos óseos [3,4,5]. Sin embargo, mecánicamente, fue inducida por la fusión celular mediada por virus, donde la membrana de los virus envueltos se fusiona con las membranas plasmáticas de las células. Se informó que varios coronavirus del resfriado común, como hCoV-HKU1, hCoV-NL63 y hCoV-229E, forman sincitios en modelos de cultivo celular, pero no hay informes sobre la formación de sincitios in vivo [6, 7].

La formación de sincitios también se observa en cultivos celulares y tejidos infectados con SARS-CoV-1, MERS-CoV o SARS-CoV-2 [8,9,10,11,12,13,14,15]. Se informaron sincitios inducidos por SARS-CoV-2 en las muestras de autopsia de tejido pulmonar en pacientes gravemente infectados con COVID-19 [1, 12, 14, 16,17,18,19,20]. El SARS-CoV-2 indujo la formación de sincitios in vitro [21,22,23,24] así como in vivo [12, 16, 20, 22], con la fusión de neumocitos y linfocitos en los pulmones [12, 20 ].

La generación y el tipo de células involucradas en la fusión de células sincitiales en las diferentes etapas de la enfermedad COVID-19 se informaron con moderación. Este informe aborda estos vacíos para fortalecer la comprensión de la formación de células sincitiales en pacientes con COVID-19 mediante el empleo de enfoques basados ​​en microscopía a nivel de ultraestructura utilizando PAP (Papanicolaou), IF (inmunofluorescencia), SEM (microscopía electrónica de barrido) y TEM (transmisión). microscopía electrónica) de imágenes. Hemos informado la presencia de células sincitiales de origen único y múltiple en los fluidos de lavado broncoalveolar (BALF) de pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) inducido por COVID-19.

El fijador de Karnovsky (glutaraldehído al 0,5 % + paraformaldehído al 2,0 %), hematoxilina, eosina, naranja G., agua de Scott, xileno, DPX, PBS, poli-L-lisina, kit de inclusión de epoxi y DAPI se adquirieron de la compañía química Sigma, MO, EE.UU. BSA, el etanol era de Himedia y Triton X-100 era de Fisher Scientific. El tetróxido de osmio se obtuvo de Ted Pella, EE. UU., el acetato de uranilo de TAAB, Reino Unido y el citrato de plomo de Ladd. El anticuerpo primario policlonal específico anti-SARS-CoV-2 (n.º de cat. ab275759) y el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa fluor-594 (n.º de cat. ab150080) se adquirieron de Abcam, Plc, Reino Unido.

Las muestras de BALF se recolectaron de pacientes positivos para SARS-CoV-2 intubados en las salas de COVID-19, AIIMS, Nueva Delhi. Todas las muestras se recolectaron entre el 3 de octubre de 2020 y el 31 de enero de 2021 (Archivo adicional 1: Tabla complementaria 1). Los pacientes se clasificaron en tres grupos según la guía del Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR) [25]. Este grupo era (A) pacientes sin SDRA con infección leve (sin SDRA, n = 8; SpO2 > 95 %, sin soporte de oxígeno, solo síntomas del tracto respiratorio superior con fiebre leve y sin dificultad para respirar o hipoxia, 2 a 8 días después de los primeros síntomas), (B) infección moderada (n = 8, frecuencia respiratoria ≥ 24/min, disnea y nivel de SpO2 de 90 % a ≤ 93 % con aire ambiente, soporte de oxígeno externo, 9 a 16 días después de los primeros síntomas), y (C) Pacientes similares a ARDS severos (similares a ARDS, n = 8; frecuencia respiratoria > 30/min, dificultad para respirar, nivel de SpO2 < 90 % con aire ambiente e ingresados ​​en HDU/UCI con soporte de oxígeno externo, 17 días en adelante )[26, 27]. Hubo una variabilidad muy alta en la respuesta del paciente a la infección y el nivel de enfermedad por COVID-19 con respecto a los días posteriores a la infección. El número máximo de pacientes se registró con síntomas similares a una enfermedad leve dentro de los 2 a 8 días, síntomas similares a una enfermedad moderada dentro de los 8 a 16 días y síntomas similares a una enfermedad grave > 17 días después de la infección [26, 27]. Por lo tanto, recolectamos las muestras solo de aquellos pacientes que cumplieron con las condiciones de la enfermedad (pauta ICMR) y los criterios de los plazos para este estudio [25]. Se realizó una prueba de RT-PCR para confirmar la infección por COVID-19 para todos los pacientes reclutados en el estudio (registrados pero no incluidos).

La muestra BALF (15-20 ml) se fijó principalmente en 20 ml recién preparados, solución de Karnovsky 2X (glutaraldehído al 1 % final + formaldehído al 4,0 %) en tampón de fosfato 0,2 M y se almacenó a 4 °C en un refrigerador designado para COVID-19. Un médico de turno revisó y cotejó todos los registros médicos de los pacientes. La demografía de los pacientes, los síntomas y signos, los resultados de la RT-PCR, los hallazgos radiográficos, el tratamiento, la atención de apoyo y los datos de supervivencia se registraron, pero no se incluyeron (Archivo adicional 1: Tabla complementaria 1).

Después de la fijación primaria, la solución BALF se diluyó diez veces con una solución de NaCl 0,1 M y se filtró a través de un filtro celular de malla de nailon con un poro de 100 μm. El filtrado se centrifugó a 2500 rpm durante 3 min en un balde oscilante y el exceso de mucosidad se eliminó lavando los sedimentos celulares (2-3 veces durante 10 min) con solución de PBS. El contenido celular se enriqueció por centrifugación a 1200 g durante 5 min y se resuspendió de nuevo en el fijador primario A (glutaraldehído al 0,5 %, paraformaldehído al 2,0 % en tampón PB 0,1 M). Estas muestras se procesaron para tinción PAP, IF, SEM y TEM.

Para la tinción con PAP, se prepararon citofrotis utilizando 200 µl de BALF a 800 rpm durante 5 min en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli L-lisina y se conservaron en etanol al 90 %. Los frotis se lavaron en agua durante 1 minuto y la tinción con hematoxilina se realizó durante 2 a 4 minutos con un lavado de un minuto con agua corriente del grifo, agua de Scott y nuevamente agua del grifo, respectivamente. Los frotis se deshidrataron gradualmente en etanol al 70%, 95% y 100% durante 2 min cada uno, se trataron con Orange G durante 4 min y se deshidrataron progresivamente. Los frotis se sumergieron en tinción de eosina durante 10 min y se trataron con etanol al 95 % y acetona durante 2 min cada uno. Finalmente, los frotis teñidos se trataron con xileno (3 veces, 5 min cada uno) y se montaron en DPX.

Para el estudio de inmunofluorescencia, las muestras BALF se lavaron con tampón de fosfato 0,1 M (3 veces) y se prepararon frotis con 10 µl de muestra en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina y se secaron al aire a temperatura ambiente. Los frotis se permeabilizaron con PBST (0,1 % Triton X-100 en solución salina tamponada con fosfato 1X, PBS) y se incubaron con una solución de bloqueo (BSA al 2 % en PBS) durante 30 min. Después del bloqueo, se incubó con el anticuerpo primario (Abcam ab275759, anticuerpo policlonal contra la proteína del pico S1, dilución 1:500) durante cuatro horas en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa fluor-594, Abcam, Cat No.- 150,080; dilución 1:500;) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente en el cuarto oscuro. Los frotis se lavaron con tampón fosfato y se añadió DAPI (1 µg/mL) y se incubó durante 5 min. El exceso de DAPI se eliminó lavando con PBS y los frotis se montaron con glicerol al 90%. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en un microscopio confocal de barrido láser (Leica SP8, Alemania).

Para SEM, los componentes celulares fijos primarios y enriquecidos de BALF se deshidrataron con etanol y se secaron en punto crítico (E-3100, Quorum Tech). Las muestras se montaron en cinta de doble cara en los talones de aluminio y se recubrieron por pulverización catódica con un recubridor de pulverización catódica a base de oro (HHV BT-150) durante 180 s. Las micrografías electrónicas se obtuvieron en EVO18 (Zeiss, Alemania) SEM operado a un voltaje de aceleración de 20 kV, una distancia de trabajo promedio de 8 a 10 mm con un detector de electrones secundarios (SE) y aumentos que van desde 5,000X a 30,000X.

Para las imágenes de TEM, los constituyentes celulares enriquecidos de BALF se fijaron principalmente con glutaraldehído al 2,5 % + paraformaldehído al 2,0 % en tampón de fosfato (PB) 0,1 M. Los sedimentos celulares se lavaron con PB 0,1 M (pH 7,4) y se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 1 % en PB 0,1 M (pH 7,4) durante una hora (fijación secundaria) a 4 °C. Los sedimentos se lavaron con agua destilada durante 2 h y se tiñeron en bloque con acetato de uranilo al 2 % en etanol al 50 %. Estas muestras se lavaron nuevamente con agua destilada y se deshidrataron con una serie de etanol (50%, 70%, 80%, 90% y 100%). Los gránulos deshidratados se infiltraron con tolueno/resina y se incluyeron en resina Araldite CY212. Los bloques se polimerizaron a 65°C durante 48 h. Se prepararon secciones ultrafinas (~ 70 nm) utilizando un ultramicrótomo UC7 (Leica) y se montaron en rejillas. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 5 % y citrato de plomo al 5 % y se tomaron imágenes con el microscopio electrónico de transmisión Talos F200 (Thermo Fisher Scientific).

Muestras BALF enriquecidas con células de pacientes con SDRA leve, moderado y grave (n = 8 cada uno) se fijaron con solución de Karnovsky y se tomaron imágenes para PAP (citofrotis), IF (anticuerpo específico de proteína S para el nivel de infección), SEM (superficie). ultraestructura) e imágenes TEM (información ultraestructural). No pudimos encontrar ningún sincitio en los pacientes levemente infectados (Archivo adicional 1. Figura S1). Sin embargo, se observaron células sincitiales de origen celular único y diferente con morfología y forma distintas en pacientes con SDRA moderado y grave. Hemos encontrado que la mayoría de los neumocitos tipo II, neutrófilos, monocitos y macrófagos se fusionaron para formar las células sincitiales en el BALF. La forma varía de redondeada a ovalada y los tamaños de 20 a 100 μm.

Hemos identificado células sincitiales multinucleadas generadas por neumocitos tipo II en pacientes moderadamente infectados. Las imágenes de PAP mostraron cambios celulares reactivos con agrandamiento nuclear y condensación citoplásmica en sincitios originados en neumocitos tipo II. El citoplasma de células multinucleadas, densas y vacuolares confirma las células sincitiales con origen en neumocitos tipo II. Estas células mostraron una inmunofluorescencia moderada con el anticuerpo específico de la proteína del pico del SARS-CoV-2, lo que indica la presencia del virus. Las imágenes SEM revelaron una morfología superficial con pequeñas microvellosidades, un rasgo característico de las células de neumocito tipo II (Fig. 1). No pudimos encontrar tales sincitios bajo TEM que podrían haber revelado una mejor comprensión de los cambios ultraestructurales después de la formación de sincitios.

Células sincitiales generadas a partir de la fusión homotípica de neumocitos tipo II de pacientes con COVID-19 en la etapa moderada de la enfermedad (entre 9-16 días después de los primeros síntomas). (A) El citoplasma de células vacuolares y nucleadas densas multinucleadas confirma los neumocitos tipo II bajo imágenes de PAP. (B) La fusión completa de la membrana de los neumocitos de tipo II (dos) con inmunofluorescencia moderada usando el anticuerpo primario específico de la proteína del pico del SARS-CoV-2 indica la presencia del virus. (C) La imagen SEM (ultraestructura superficial) de los neumocitos tipo II mostró una estructura similar a microvellosidades pequeñas, características de los neumocitos tipo II. N, núcleo; flecha blanca, virus SARS-CoV-2; flecha naranja, microvellosidades.

También hemos observado las células sincitiales de origen neutrófilo bajo PAP, IF, SEM y TEM en una condición de enfermedad moderada. Las imágenes de PAP identificaron la formación sincitial de dos neutrófilos con múltiples núcleos (núcleos no multilobulados) (Fig. 2A). Los estudios de inmunofluorescencia confirman la infección celular severa y la presencia del virus SARS-CoV-2. Las células multinucleadas con firmas típicas de neutrófilos confirman su origen (Fig. 2B). Las imágenes SEM revelaron una célula sincitial de ~ 40 μm con el rasgo característico (superficie rugosa con protuberancia de membrana) de origen neutrófilo (Fig. 2C). La imaginación TEM mostró el inicio de la fusión de la membrana plasmática con dos neutrófilos adyacentes (Fig. 2D). Estos puntos de iniciación de fusiones de membrana fueron claramente visibles a mayor aumento, lo que puede ser un paso inicial esencial para la formación de células sincitiales después de la infección por el virus (Fig. 2E-F). Se observaron múltiples partículas virales inmaduras y maduras en el citoplasma de estas células (flechas).

Las células sincitiales de origen neutrófilo mostraron el inicio de la fusión de la membrana plasmática. (A) Imagen de PAP de sincitios con núcleo denso y citoplasma granular que confirma el origen de los neutrófilos. (B) Célula sincitial de origen neutrófilo con múltiples núcleos e inmunofluorescencia que confirma la infección por SARS-CoV-2 C. Imagen SEM de célula sincitial de origen neutrófilo de tamaño 40 μm. La superficie rugosa con protuberancias de la membrana plasmática con abundantes partículas similares a virus (flecha blanca) confirmó el origen de los neutrófilos. (D, E y F) imágenes TEM de bajo y alto aumento que muestran el inicio de la formación de sincitios (fusión de membrana). N, núcleo; M, mitocondrias; P, fagosomas; RB, cuerpo residual; B, bacterias; Pse, pseudópodos; flecha blanca, virus SARS-CoV-2; punta de flecha negra, el sitio de la fusión de la membrana.

En las etapas moderadas de la enfermedad, se observaron varios sincitios heterotípicos de fusión de neutrófilos-monocitos. Estas células se observaron en imágenes de PAP, IF y TEM. Las imágenes de IF confirman la formación de células sincitiales con neutrófilos y monocitos con infección por SARS-CoV-2 de moderada a grave (Fig. 3B-C). TEM reveló el inicio de la fusión de la membrana plasmática con células adyacentes (puntas de flecha negras) en múltiples lugares. Las células de origen monocítico (células intermedias) mostraban rasgos ultraestructurales característicos, como un núcleo bilobulado, la presencia de un cuerpo lipídico y gránulos fagocíticos (Fig. 3D-G). Las características de la ultraestructura incluyen numerosos gránulos azurófilos primarios (grandes y densos en electrones), gránulos específicos secundarios (pequeños, con tinción ligera), pseudópodos en la membrana plasmática, membrana celular muy plegada y una gran cantidad de fagocitos de las células adyacentes a los monocitos que las confirman. como granulocitos neutrofílicos. Estas células mostraron un número relativamente mayor de virus maduros en el citoplasma (flecha blanca).

Células sincitiales formadas por múltiples orígenes de células de pacientes con ARDS inducido por COVID-19. (A) Imagen de PAP de origen de monocitos y neutrófilos con núcleo multilobulado y en forma de herradura. (B) Los núcleos multilobulados y la nucleína céntrica confirman las células de neutrófilos y monocitos, respectivamente, con un nivel moderado de infección por SARS-CoV-2 en IF. (CF) Fusión de membrana entre monocitos y dos neutrófilos adyacentes bajo imágenes TEM con diferentes aumentos. Se identificó monocitos debido a la presencia de cuerpos lipídicos activos y un núcleo central. Los gránulos de neutrófilos y los fagocitos confirman el origen de los neutrófilos de las células adyacentes. N, núcleo; M, mitocondrias; RB, cuerpo residual; L, cuerpo lipídico; flecha blanca, virus SARS-CoV-2; punta de flecha negra, el sitio de fusión de la membrana plasmática.

No se observaron células sincitiales maduras en el BALF de pacientes leve y moderadamente infectados. Sin embargo, bajo imágenes SEM, se observaron células sincitiales de gran tamaño (hasta 100 μm) con morfología ovalada en los pacientes con SDRA grave. La morfología de la superficie ultraestructural indica origen de neutrófilos (Fig. 4A), monocíticos (Fig. 4B) y macrófagos (Fig. 4C). La presencia de pseudópodos en la membrana plasmática y membrana celular muy plegada confirma el origen neutrofílico (fig. 4A). Se identificaron otras células sincitiales maduras de origen monocítico por su superficie lisa y la presencia de muchas estructuras de tipo bacteriano, un indicativo de células fagocíticas (Fig. 4B). La morfología de la superficie, como las proyecciones citoplasmáticas y la estructura ondulada, se asemejan a los macrófagos (Fig. 4C). Este tipo de sincitios maduros no se observó bajo TEM.

Células sincitiales maduras bajo imágenes SEM. Las células sincitiales se generaron mediante la fusión de múltiples células de (A) origen de neutrófilos (confirmado por proyección de superficie), (B) monocitos (identificados por superficie lisa) y (C) origen de macrófagos (proyección citoplásmica). Pacientes con COVID-19 similares a ARDS Se observaron células sincitiales maduras en pacientes similares a ARDS graves, pero no en la etapa leve o moderada de la enfermedad. Flecha blanca, virus SARS-CoV-2; B, bacterias (flecha naranja).

La enfermedad COVID-19, causada por la infección por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), se ha convertido en una gran amenaza para la salud pública mundial [28, 29]. En muchos pacientes, los síntomas siguen siendo leves (solo infecciones de las vías respiratorias superiores con fiebre leve y sin dificultad para respirar ni hipoxia, SpO2 > 95%) y se resuelven automáticamente en un plazo de cuatro a siete días con medicación basada en los síntomas. Algunos pacientes que desarrollaron condiciones similares a ARDS primarias necesitan hospitalización de gravedad moderada (frecuencia respiratoria ≥ 24/min, dificultad para respirar y nivel de SpO2 de 90 % a ≤ 93 % en aire ambiente). Un número máximo de pacientes mostró síntomas similares a la enfermedad moderados entre 8 y 15 días después de los primeros síntomas. Sin embargo, entre el 2% y el 5% de los pacientes con COVID-19 desarrollaron condiciones similares a las del SDRA con problemas respiratorios frecuentes, SpO2 baja (< 90%) y puntajes CT altos (> 16) [30, 31]. Se informó un mayor número de pacientes después del día 17 de la enfermedad. La formación de sincitios está asociada con la gravedad de COVID-19. Sin embargo, es posible que la formación de sincitios también esté relacionada con la duración de la infección, así como con otros factores como la respuesta inmune del paciente y la carga viral. Todavía no se comprende completamente cómo la formación de sincitios contribuye a la patogénesis de COVID-19. Así, hemos tomado como parámetros tanto la gravedad de la enfermedad como el día de la toma de muestra tras la infección para igualar las condiciones del paciente.

Las imágenes histológicas de muestras de autopsia de pulmón (muerte debido a COVID-19) mostraron células sincitiales gigantes multinucleadas [12, 15, 16, 20]. Sin embargo, es difícil explorar el inicio de la formación de sincitios y su correlación con el estadio de la enfermedad a partir de estas muestras de autopsia. Esto se debe a que las técnicas histológicas basadas en microscopía óptica no son adecuadas para identificar las células respiratorias y hematopoyéticas involucradas en la formación de sincitios. Nuestro estudio ultraestructural basado en microscopía electrónica de muestras BALF de pacientes con COVID-19 levemente infectados no encontró sincitios (Archivo adicional 1. Figura S1). Esto indica que los virus SARS-CoV-2 podrían no iniciar la fusión de membranas en la etapa inicial de la enfermedad. Esto puede deberse a que el virus tiende a multiplicarse, tropismo e infecta el máximo número de células para propagarse, incluido el epitelio bucal y respiratorio, en la fase inicial de la enfermedad [32, 33]. En esta etapa, el virus no necesita una facilitación especial para su replicación, diseminación, evasión inmune y respuestas inflamatorias porque la respuesta inmunológica del huésped aún no se activó de manera eficiente. Sin embargo, en la etapa moderada de la enfermedad, se creó una presión negativa sobre la replicación y diseminación del virus SARS-CoV-2 al activar respuestas inmunológicas humorales y celulares [34]. La activación de macrófagos y la infiltración de granulocitos en el tejido pulmonar (neutropenia) obligan al virus a activar su mecanismo de salvaguarda para facilitar su replicación y diseminación a través de la fusión de la membrana plasmática de las células respiratorias y hematopoyéticas [20, 35, 36]. Esta podría ser una razón para la fusión de la membrana plasmática con células idénticas y heterotípicas en la etapa moderada de la enfermedad (Figs. 1, 2 y 3). En esta etapa de la enfermedad se observaron células sincitiales de neumocitos tipo II binucleadas completamente fusionadas (Fig. 1). Sin embargo, en una etapa similar de la enfermedad, se observó una fusión incompleta de la membrana plasmática (inicio de la fusión de la membrana) en células de origen hematopoyético como monocitos y neutrófilos (Figs. 2 y 3). Esto indica que los neumocitos tipo II fueron la primera opción del virus para inducir la formación de células sincitiales, lo que puede ayudar en la replicación y protección del virus de la respuesta inmune [21]. Esta podría ser la razón de la alta fluorescencia (indicativa de alta infección y multiplicación) en las células sincitiales de origen neumocito tipo II (Fig. 1). Un estudio reciente también apoyó esto, que proporcionó información crítica y las consecuencias de la formación de células gigantes multinucleadas después de las infecciones por SARS-CoV-2 [16, 20]. Además, también se informó la formación de sincitios homólogos en células Vero in vitro (ACE2+) que expresan la proteína de punta del SARS-CoV-2 [21].

Se plantea la hipótesis de que los sincitios también pueden contribuir a la diseminación viral y la evasión inmunitaria al proteger al virus de las células inmunitarias y de los anticuerpos neutralizantes [1, 12]. En nuestro estudio, el inicio de la fusión de células idénticas (en neutrófilos) y heterotípicas (con neutrófilos y monocitos) en la etapa moderada de la enfermedad indica la hiperactivación de proteínas fusógenas virales para iniciar la formación de sincitios en estas células hematopoyéticas (Figs. 2 y 3). Se informó que la proteína del pico viral (S) funcionaba como un fusógeno en la superficie de una célula infectada que interactúa con los receptores de las células vecinas para formar células sincitiales [37]. Además de su capacidad para impulsar la fusión de las membranas virales y celulares, la proteína S puede impulsar aún más la fusión de las células vecinas, lo que resulta en la formación de células gigantes multinucleadas [12, 14, 15]. Este hallazgo también fue respaldado por un estudio reciente en el que los sincitios inducidos por SARS-CoV-2 se dirigieron a los linfocitos para la internalización y la eliminación mediada por célula en célula, lo que podría contribuir a la linfopenia y la patogénesis en pacientes con COVID-19 [20].

El hallazgo de células sincitiales maduras y de gran tamaño (20-100 μm) de origen neutrófilo y monocitos en estadios muy tardíos y graves (SDRA-like) de las enfermedades indicó el papel de las células sincitiales en la diseminación viral y la evasión inmune. Estas células sincitiales gigantes pueden ayudar en la multiplicación y protección de la respuesta inmune del cuerpo, lo que puede ser la razón de la activación de los macrófagos alveolares y, en última instancia, de la tormenta de citocinas [20]. Las células sincitiales maduras no se identificaron en nuestras imágenes de TEM, aunque se informó en las muestras de autopsia. Esto podría atribuirse a la liberación de menos tipos de células del tejido pulmonar infectado al BALF de los pacientes.

La formación de sincitios es un paso importante para proteger y ayudar en la multiplicación del virus SARS-CoV-2 después de una activación inmunológica eficiente de los pacientes. El estudio actual mostró que la formación de sincitios se indujo primero en neumocitos tipo II por fusión homotípica y luego con células hematopoyéticas (monocitos y neutrófilos) por fusión heterotípica en la etapa moderada (9-16 días) de la enfermedad. Los sincitios maduraron en la fase tardía de la enfermedad y formaron grandes células gigantes de 20 a 100 μm. Este estudio ultraestructural detallado sobre los orígenes de sincitios de células individuales y diferentes puede explorar el grado en que las células sincitiales contribuyen a la patología y proporcionar información sobre la biología de la enfermedad de COVID-19.

Los números de muestras biológicas y los detalles de los pacientes se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla complementaria 1.

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Agradecemos a todos los familiares de los pacientes por permitirnos recolectar BALF de los pacientes. SAIF-AIIMS Nueva Delhi es reconocida por la instalación de imágenes proporcionada para SEM y TEM. La instalación de microscopio confocal DST-FIST también es reconocida para el estudio de inmunofluorescencia. Se reconoce la financiación de ICMR, SERB y AIIMS Intramural.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de IUSSTF Indo-US Virtual Network for the COVID-19 program (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) y DBT-SAHAJ Program (BT/INF/22/SP44285/2021).

Instalación de Microscopio Electrónico, Departamento de Anatomía, Instituto de Ciencias Médicas de la India, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Shikha Chaudhary, Ravi P. Yadav y Subhash Chandra Yadav

Departamento de Anestesiología, Medicina del Dolor y Cuidados Intensivos, All India Institute of Medical Sciences, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Shailendra Kumar

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SC realizó los experimentos de procesamiento de muestras, estandarización de imágenes de PAP e IF, microscopía electrónica, interpretación de datos, manejo de historias clínicas y generación de figuras de microscopía. SK recogió la muestra de las salas de la UCI. SK participó en el diseño del estudio y la estandarización de las estrategias de recolección de muestras. RPY ayudó en la preparación y experimentación del manuscrito. SCY diseñó el estudio, realizó y supervisó los experimentos con pacientes de COVID-19, analizó los datos, generó las cifras, escribió el manuscrito y dirigió el proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el borrador final de este manuscrito.

Correspondencia a Subhash Chandra Yadav.

Se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética Institucional (IEC), All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Nueva Delhi, India (Ref. No. IEC-307/27.04.2020, RP-10/202) para el presente estudio. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los representantes de los pacientes para la recolección de muestras BALF de pacientes infectados e intubados con SARS-CoV-2.

Todos los autores aprobaron este manuscrito para su publicación. Los intereses contrapuestos no son aplicables.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chaudhary, S., Yadav, RP, Kumar, S. et al. El estudio ultraestructural confirma la formación de células sincitiales únicas y heterotípicas en los fluidos broncoalveolares de pacientes con COVID-19. Virol J 20, 97 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

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Recibido: 23 noviembre 2022

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 19 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

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