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Oct 23, 2023

una vía aérea

Naturaleza volumen 615, páginas

Nature, volumen 615, páginas 660–667 (2023)Citar este artículo

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La infección por patógenos provoca un estado de enfermedad estereotipado que implica cambios fisiológicos y de comportamiento orquestados neuronalmente1,2. En el momento de la infección, las células inmunitarias liberan una "tormenta" de citoquinas y otros mediadores, muchos de los cuales son detectados por las neuronas3,4; sin embargo, los circuitos neuronales que responden y los mecanismos de interacción neuroinmune que evocan el comportamiento de enfermedad durante las infecciones naturalistas siguen sin estar claros. Los medicamentos de venta libre, como la aspirina y el ibuprofeno, se usan ampliamente para aliviar las enfermedades y actúan bloqueando la síntesis de prostaglandina E2 (PGE2)5. Un modelo líder es que la PGE2 cruza la barrera hematoencefálica y se involucra directamente con las neuronas hipotalámicas2. Aquí, utilizando herramientas genéticas que cubren ampliamente un atlas de neuronas sensoriales periféricas, identificamos una pequeña población de neuronas sensoriales glosofaríngeas que detectan PGE2 (neuronas petrosas GABRA1) que son esenciales para el comportamiento de enfermedad inducida por influenza en ratones. La ablación de las neuronas GABRA1 petrosas o la desactivación dirigida del receptor 3 de PGE2 (EP3) en estas neuronas elimina las disminuciones inducidas por la influenza en la ingesta de alimentos, la ingesta de agua y la movilidad durante la infección en etapa temprana y mejora la supervivencia. El mapeo anatómico guiado genéticamente reveló que las neuronas petrosas GABRA1 se proyectan a las regiones mucosas de la nasofaringe con una mayor expresión de ciclooxigenasa-2 después de la infección, y también muestran un patrón de orientación axonal específico en el tronco encefálico. Juntos, estos hallazgos revelan una vía sensorial primaria de las vías respiratorias al cerebro que detecta las prostaglandinas producidas localmente y media las respuestas de enfermedad sistémica a la infección por virus respiratorios.

Las infecciones respiratorias causadas por la influenza y otros patógenos son las principales causas de muerte y hospitalización en todo el mundo6, y la reciente pandemia de COVID-19 ha perturbado ampliamente a la sociedad humana. Sentirse enfermo puede ser profundamente debilitante y la mayoría de las personas se enferman varias veces al año. La sensación de malestar representa una respuesta neuronal a la infección que puede proporcionar una estrategia altamente coordinada y adaptativa para promover la recuperación1,2. Los animales infectados con varios patógenos muestran respuestas fisiológicas y de comportamiento comunes que pueden incluir fiebre, letargo, pérdida de apetito, dolor de cabeza y dolor, cambios de humor y disminución de la socialización, lo que sugiere un estado de enfermedad común que involucra circuitos neuronales compartidos2,7. Además de los síntomas comunes, otras respuestas de enfermedad se adaptan al sitio de infección; por ejemplo, algunas infecciones respiratorias provocan tos, congestión y broncoconstricción, mientras que algunas infecciones intestinales provocan náuseas, diarrea y vómitos. Las respuestas conductuales específicas de la infección sugieren múltiples vías de comunicación cuerpo-cerebro para la detección de patógenos.

Varias citocinas y mediadores inmunitarios pueden inducir un comportamiento de enfermedad cuando se administran de forma aislada, incluidas las interleucinas, los interferones, el factor de necrosis tumoral (TNF) y los eicosanoides1,2,4,8. Estas y otras citocinas, así como factores derivados de patógenos como los lipopolisacáridos, las toxinas bacterianas y los péptidos de formilo, pueden activar una variedad de neuronas sensoriales centrales y/o periféricas4,9. Juntas, estas observaciones plantean la posibilidad de que haya muchas vías para la diafonía neuroinmune, aunque no está claro cuándo o si cada una de estas vías se activa durante las infecciones naturalistas.

Los productos químicos como el ácido salicílico de la corteza de sauce, la aspirina y el ibuprofeno bloquean la biosíntesis de mediadores lipídicos inducidos por infecciones clave a través de la inhibición de las enzimas ciclooxigenasas y han brindado un enfoque históricamente efectivo para controlar los síntomas de la enfermedad5,10. La prostaglandina E2 (PGE2) es un metabolito clave dependiente de la ciclooxigenasa que provoca un comportamiento de enfermedad, y la desactivación de otras enzimas aguas abajo de la ciclooxigenasa en la ruta de biosíntesis de PGE2 también mejora las respuestas a la enfermedad11. La PGE2 es detectada por una pequeña subfamilia de 4 receptores acoplados a proteína G (EP1–EP4)12, y se cree que algunas, pero no todas, las respuestas de enfermedad inducidas por pirógenos están mediadas por el receptor EP32. El receptor EP3 se expresa en varias regiones del cerebro, incluidos el hipotálamo y los órganos circunventriculares, así como en las neuronas periféricas, las células inmunitarias y muchos otros tipos de células12,13. La desactivación específica de la región del receptor EP3 en el núcleo preóptico mediano (MnPO) del hipotálamo disminuyó las respuestas de fiebre inducidas por lipopolisacáridos14, y los receptores PGE2 en otras áreas parecen ser relevantes para los efectos sobre la excitación y la alimentación2. Estos y otros hallazgos han llevado a varios modelos posibles en los que (1) la PGE2 puede cruzar directamente la barrera hematoencefálica debido a su hidrofobicidad, (2) la PGE2 puede detectarse o ingresar al cerebro en los órganos circunventriculares y/o (3) La PGE2 se puede sintetizar en el propio cerebro2,15,16. La PGE2 central podría entonces activar una red neuronal distribuida, con diferentes regiones receptivas del cerebro, como la MnPO, que evocan aspectos particulares de una respuesta de enfermedad característica17.

Las funciones de los receptores de prostaglandinas en las neuronas periféricas siguen sin estar claras y, además, razonamos que la aplicación exógena de pirógenos químicamente definidos puede producir una respuesta inflamatoria sistémica, mientras que las infecciones naturales en diferentes lugares y de intensidades variables pueden, en cambio, desencadenar vías de respuesta neuroinmune locales. que han permanecido inexplorados.

Desarrollamos un modelo de ratón para caracterizar los mecanismos neuronales que subyacen al comportamiento de la enfermedad inducida por la influenza. Los ratones se infectaron mediante la administración intranasal del virus de la influenza A PR/8/34 (H1N1) y se controlaron las respuestas de enfermedad características durante los 10 a 20 días posteriores. La infección por influenza disminuyó la ingesta de alimentos, la ingesta de agua, la locomoción, el peso corporal y la supervivencia en ratones de tipo salvaje. Los títulos más altos de inóculo de virus aumentaron la extensión del comportamiento de enfermedad, y los fenotipos más graves surgieron entre seis y siete días después de la infección (Fig. 1a). La infección por influenza aumentó los niveles de PGE2 tanto en plasma como en líquido de lavado broncoalveolar (BALF) durante un período de tiempo similar, según lo medido por inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) (Datos extendidos Fig. 1b). La administración de PGE2 también inhibió de forma aguda la ingesta de alimentos (datos ampliados, figura 2a), y las mediciones de fotometría de fibra mostraron una disminución de la actividad de las neuronas hipotalámicas que expresan el péptido relacionado con agutí (AGRP) (datos ampliados, figura 2c), en consonancia con una disminución de la motivación para comer, en lugar de que únicamente una incapacidad física para comer. También observamos una respuesta hipotérmica a la infección por influenza (Datos extendidos Fig. 3a), consistente con observaciones previas en ratones18. La administración de ibuprofeno (1 mg ml-1 en agua de bebida, ad libitum) o aspirina (20 mg kg-1, inyección intraperitoneal diaria) a ratones infectados con influenza disminuyó los niveles plasmáticos de PGE2, restauró la alimentación, la ingesta de agua y el peso corporal, y promovió supervivencia de la infección (Fig. 1b y Datos extendidos Figs. 1b y 3b). Los ratones tratados con ibuprofeno y aspirina retuvieron disminuciones de bajo nivel en la alimentación, la bebida y la motilidad sin niveles elevados de PGE2, lo que plantea la posibilidad de que otras vías de comunicación neuroinmune también puedan contribuir a las respuestas conductuales. Sin embargo, el ibuprofeno y la aspirina redujeron sustancialmente el comportamiento de enfermedad inducido por la influenza, lo que concuerda con el papel clave de los metabolitos de la ciclooxigenasa-2 en la diafonía neuroinmune.

a, Los ratones se infectaron por vía intranasal con 25 μl de virus de influenza A en dosis baja (105 EID50 ml-1), media (106 EID50 ml-1) o alta (107 EID50 ml-1) y consumo de alimentos, consumo de agua, motilidad y Posteriormente se controló diariamente el peso corporal. EID50 es la dosis infectiva del 50% del huevo. Los datos son media ± sem; n = 6 ratones por grupo. ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett en comparación con el control del vehículo. Ingesta de alimentos: P = 0,0048 (baja), P < 0,0001 (media), P < 0,0001 (alta). Ingesta de agua: P = 0,8185 (baja), P < 0,0001 (media), P < 0,0001 (alta). Motilidad: P = 0,5231 (baja), P < 0,0001 (media), P < 0,0001 (alta). Peso corporal: P = 0,0002 (bajo), P < 0,0001 (medio), P < 0,0001 (alto). Supervivencia: P = 0,3173 (baja), P = 0,0185 (media), P = 0,0007 (alta). b, Los ratones se infectaron con el virus de la influenza A (todas las infecciones son con 106 EID50 ml-1 a ​​menos que se indique lo contrario), se les dio agua potable con o sin 1 mg ml-1 de ibuprofeno y se monitorearon según lo indicado. Los datos son media ± sem; n = 6 ratones por grupo. Ingesta de alimentos: P < 0,0001; ingesta de agua: P = 0,0001; motilidad: P = 0,0001; peso corporal: P < 0,0001; supervivencia: P = 0,0295. c, Los ratones fueron infectados con el virus de la influenza A, inyectados diariamente (inyección intraperitoneal, 1 mg kg−1) con antagonistas para EP1 (SC-51322), EP2 (PF-04418948), EP3 (DG-041) o EP4 (ONO- AE3-208), o vehículo solo, y monitoreado como se indica. Los datos son media ± sem; n = 10 ratones para grupos de vehículos; n = 8 ratones para todos los demás. Para el antagonista de EP3: ingesta de alimentos: P < 0,0001; consumo de agua: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P = 0,0002; supervivencia: P = 0,0094. b, c, prueba t no pareada de dos colas, con comparaciones entre grupos tratados con ibuprofeno o antagonista de EP3 y vehículo en c. Prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para análisis de supervivencia; para los cambios de comportamiento o fisiológicos, se obtuvo un cambio diario promedio en el comportamiento (días 1 a 10 después de la infección o la supervivencia) para cada ratón, y luego se usó para comparaciones entre grupos experimentales (para obtener más información, consulte Datos extendidos Fig. 1a). *P < 0,05, **P < 0,005, ***P<0,0005; NS, no significativo.

Datos fuente

Se han propuesto funciones para múltiples receptores de prostaglandinas en los comportamientos de enfermedad2,19. Administramos antagonistas selectivos para cada receptor de PGE2 diariamente después de la infección por influenza y medimos diferentes aspectos del comportamiento de enfermedad. El antagonista del receptor EP3 DG-041 bloqueó eficazmente la enfermedad inducida por la influenza en cada parámetro medido y también promovió la supervivencia (Fig. 1c), con una magnitud de efecto similar a la del ibuprofeno y la aspirina. Por el contrario, el antagonismo de los receptores EP1, EP2 o EP4 no tuvo efecto sobre ningún parámetro medido. El agonista selectivo de EP3, sulprostona, tuvo el efecto opuesto de inhibir la ingesta de alimentos (Datos ampliados, Fig. 2b). Por lo tanto, los ratones muestran cambios de comportamiento característicos de la infección por el virus de la influenza a través de la acción de PGE2 en los receptores EP3.

El receptor EP3 se expresa en varias clases de neuronas centrales y periféricas. Para determinar el sitio clave de acción del receptor EP3 en la enfermedad inducida por la influenza, obtuvimos ratones con un alelo (Ptger3flox) para la inactivación dependiente de Cre del gen14 Ptger3, que codifica el receptor EP3. Luego cruzamos ratones Ptger3flox con ratones Nestin-cre o Advillin-creER, que se dirigen a la recombinasa Cre en la mayoría de las neuronas centrales o periféricas20,21, respectivamente (Datos extendidos Fig. 4a), y medimos los comportamientos de enfermedad inducidos por la influenza. Advillin-creER; Los ratones Ptger3flox se trataron con tamoxifeno para inducir la recombinación mediada por Cre al menos una semana antes de la administración del virus; el tratamiento previo con tamoxifeno de los ratones de control no afectó las respuestas conductuales posteriores a la infección por influenza (Datos ampliados, Fig. 4b). Las disminuciones inducidas por la influenza en la alimentación, la bebida, el movimiento, el peso corporal y la supervivencia se atenuaron en Advillin-creER; Ratones Ptger3flox (Fig. 2b), con magnitudes de efecto similares al tratamiento con ibuprofeno, pero persistieron en Nestin-cre; Ratones Ptger3flox (Fig. 2a). Se observaron efectos similares de la eliminación del gen Ptger3 en el comportamiento de la enfermedad cuando se usaron dosis más bajas y menos letales del virus de la influenza (Datos extendidos Fig. 5). Los ratones con un comportamiento de enfermedad atenuado mostraron un tiempo de recuperación similar, ya que se observaron alimentación, bebida y motilidad normales aproximadamente dos semanas después de la infección en todos los grupos experimentales. Estas observaciones indicaron que la influenza induce respuestas de enfermedad a través de la acción de PGE2 en las neuronas sensoriales periféricas.

a,b, Nestin-cre; Ptger3flox (a), Advillin-creER; Se infectaron ratones Ptger3flox (b) o ratones Ptger3flox (a,b) con el virus de la influenza A y se monitorearon como se indica. Los datos son media ± sem; n = 8 ratones (Ptger3flox), n = 6 ratones (Nestin-cre y Advillin-creER). Prueba t no pareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para análisis de comportamiento o fisiología; prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. a, Ingesta de alimentos: P = 0,0126; ingesta de agua: P = 0,1006; motilidad: P = 0,0701; peso corporal: P = 0,9361; supervivencia: P = 0,7735. b, Ingesta de alimentos: P = 0,0004; ingesta de agua: P = 0,0004; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P = 0,0004; supervivencia: P = 0,0216. c, Los ganglios NJP de ratones Ptger3flox se inyectaron bilateralmente con AAV-cre, se expusieron al virus de la influenza A o solución salina y se monitorearon como se indica. Los datos son media ± sem; n = 8 ratones por grupo. Ptger3flox, virus: ingesta de alimentos: P < 0,0001; consumo de agua: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P < 0,0001; supervivencia: P < 0,0001. Ptger3flox; AAV-cre, virus: ingesta de alimentos: P < 0,0001; consumo de agua: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P < 0,0001; supervivencia: P = 0,0376. ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Dunnett como se detalla en la Fig. 1 para análisis de comportamiento o fisiología; prueba log-rank (Mantel-Cox) para análisis de supervivencia, con comparaciones entre Ptger3flox, virus y Ptger3flox; AAV-cre, vehículo (estrellas rojas) o entre Ptger3flox, virus y Ptger3flox; AAV-cre, virus (estrellas azules).

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El receptor EP3 se expresa en varias clases de neuronas periféricas marcadas en ratones Advillin-creER, incluidas las neuronas sensoriales vagales, las neuronas sensoriales del glosofaríngeo, las neuronas sensoriales espinales de los ganglios de la raíz dorsal y, potencialmente, en otros tipos de neuronas20,22. Las neuronas sensoriales glosofaríngeas y vagales se consideraron candidatas primarias para la detección de patógenos respiratorios, ya que representan la mayor parte de la inervación en las vías respiratorias superiores e inferiores23. En ratones, el soma de las neuronas sensoriales vagales (nudosas y yugulares) y glosofaríngeas (petrosas) se fusionan en un gran superganglio a cada lado del cuerpo23. Inyectamos un virus adenoasociado (AAV) con un alelo cre constitutivo (AAV-cre) bilateralmente en ambos ganglios nodoso-yugular-petroso (NJP) de ratones Ptger3flox. La inactivación eficaz de Ptger3 en los ganglios NJP se confirmó dos semanas después de la inyección de AAV mediante hibridación in situ de ARN (datos ampliados, figura 6). La eliminación de Ptger3 dirigida al ganglio NJP provocó una atenuación marcada del comportamiento de enfermedad inducido por la influenza (Fig. 2c). Estos hallazgos indican que la influenza induce cambios de comportamiento a través del receptor EP3 expresado en aferentes sensoriales vagales y/o glosofaríngeos.

Ptger3 se expresa en un subconjunto de neuronas sensoriales vagales y glosofaríngeas, como lo revela la hibridación in situ de ARN (datos extendidos, Fig. 6b) y el análisis de datos de transcriptomas unicelulares (Fig. 3a). Los enfoques de secuenciación de ARN de una sola célula revelaron docenas de neuronas sensoriales NJP molecularmente distintas22,24,25. La expresión más alta de Ptger3 se observó en 6 grupos de neuronas: J1, J2, J3, NP2, NP9 y NP26 (Fig. 3a), con J denotando yugular y NP denotando neuronas nodosas-petrosas. Cruzamos ratones Ptger3flox con ratones Piezo2-IRES-cre, en los que se marcan J1, J2, J3 y otras neuronas NJP, y ratones Phox2b-cre, en los que se marcan NP2, NP9, NP26 y otras neuronas NJP. Los comportamientos de enfermedad inducidos por la influenza se atenuaron en Phox2b-cre; ratones Ptger3flox en un rango de títulos virales, pero no en Piezo2-IRES-cre; Ratones Ptger3flox (Fig. 3b y Extended Data Figs. 7 y 8a), lo que sugiere un papel para las neuronas NP2, NP9 o NP26. Para distinguir estos tipos de neuronas, luego cruzamos ratones Ptger3flox con ratones Pdyn-IRES-cre, Oxtr-IRES-cre y Gabra1-IRES-cre, que muestran una orientación diferencial de las neuronas NP26, NP2 y NP9. Gabra1-IRES-cre; Los ratones Ptger3flox mostraron una marcada atenuación del comportamiento de la enfermedad inducida por la influenza similar al tratamiento con ibuprofeno, mientras que no se observó ningún efecto en Pdyn-IRES-cre; Ptger3flox o Oxtr-IRES-cre; Ratones Ptger3flox (Fig. 3b y datos extendidos Fig. 8a). Gabra1-IRES-cre; Los ratones Ptger3flox también mostraron una respuesta de hipotermia atenuada a la infección por influenza (Datos extendidos, Fig. 3a). También probamos el papel de las neuronas TRPV1, ya que su eliminación afecta la supervivencia después de infecciones pulmonares bacterianas que causan neumonía letal26. Sin embargo, el comportamiento de enfermedad inducida por influenza fue normal en Trpv1-IRES-cre; Los ratones Ptger3flox (datos extendidos, Fig. 8b, c) y, además, las neuronas GABRA1 son predominantemente negativas para Trpv1. Por lo tanto, la eliminación del receptor EP3 en un pequeño subconjunto de neuronas sensoriales periféricas que expresan Gabra1 (neuronas NP9) tiene un efecto de gran alcance en las respuestas conductuales a la infección por influenza.

a, Un gráfico de proyección y aproximación múltiple uniforme (UMAP) derivado de datos publicados de transcriptomas unicelulares de ganglios sensoriales vagales y glosofaríngeos22 que muestra la expresión de los genes indicados (el color muestra la expresión relativa en una escala logarítmica natural). b, Los tipos de células, como se destaca en a, expresan el gen indicado así como Ptger3. Los ratones se infectaron con el virus de la influenza A y se monitorearon como se indica. Los datos son media ± sem; n = 8 (Piezo2-IRES-cre), n = 6–8 (Phox2b-cre; 8 control y 6 Phox2b-cre), n = 6 (Pdyn-IRES-cre), n = 6 (Oxtr-IRES-cre ) y n = 10 (Gabra1-IRES-cre) ratones por grupo. Prueba t no pareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para análisis de comportamiento o fisiología; prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. Piezo2-IRES-cre: ingesta de alimentos: P = 0,2631; motilidad: P = 0,2680; peso corporal: P = 0,7925; supervivencia: P = 0,4736. Phox2b-cre: ingesta de alimentos: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P = 0,0002; supervivencia: P = 0,0181. Pdyn-IRES-cre: ingesta de alimentos: P = 0,4539; motilidad: P = 0,4946; peso corporal: P = 0,2675; supervivencia: P = 0,7937; Oxtr-IRES-cre: ingesta de alimentos: P = 0,4786; motilidad: P = 0,6333; peso corporal: P = 0,3297; supervivencia: P = 0,7121; Gabra1-IRES-cre: ingesta de alimentos: P = 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P = 0,0004; supervivencia: P = 0,0263.

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A continuación, examinamos cómo las manipulaciones de las neuronas sensoriales afectaron los niveles de transcripción viral y la producción de citoquinas. La infección por influenza indujo PGE2 a niveles similares en plasma y BALF de Gabra1-IRES-cre; Ptger3flox, Phox2b-cre; Ptger3flox, Advillin-creER; Ratones Ptger3flox y Ptger3flox (Datos extendidos Fig. 9a), consistentes con los cambios en la detección de PGE2 en lugar de la síntesis de PGE2 que subyace a las diferencias de comportamiento observadas. En los ratones de control, los niveles de transcripción viral alcanzaron su punto máximo tres días después de la infección en las vías respiratorias superiores y cinco días después de la infección en los pulmones. En Gabra1-IRES-cre; En ratones Ptger3flox, los niveles de transcritos virales se redujeron parcialmente en las vías respiratorias superiores y se redujeron, retrasaron y persistieron en los pulmones (Datos ampliados, Fig. 9b). Los niveles de interferón-gamma (IFNγ), TNF e interleucina 6 (IL-6) alcanzaron un máximo similar en BALF de ratones de control 5 días después de la infección, y también disminuyeron y retrasaron en Gabra1-IRES-cre; Ratones Ptger3flox (Datos extendidos Fig. 9c). Estos hallazgos indican que la desactivación del receptor EP3 en las neuronas sensoriales no solo afecta el comportamiento de enfermedad, sino también la respuesta inmune y la transición de la infección del tracto respiratorio superior al inferior.

Utilizamos un enfoque complementario que involucra la ablación celular guiada por la toxina de la difteria para aclarar el papel de las neuronas sensoriales vagales-glosofaríngeas que expresan Gabra1 en la enfermedad inducida por la influenza, y descartar un papel para otros sitios de expresión de Gabra1. Las células de ratón son normalmente resistentes a la toxina diftérica, pero pueden volverse sensibles por la expresión del receptor de la toxina diftérica humana (DTR). ganglios NJP de Gabra1-IRES-cre; A los ratones lsl-DTR se les inyectó bilateralmente toxina diftérica (los denominamos ratones Gabra1-ABLATE), lo que resultó en una ablación altamente eficiente de las neuronas GABRA1 vagales y glosofaríngeas (Fig. 4c). Anteriormente demostramos que este enfoque no afecta a las neuronas Cre-negativas en los ganglios NJP, ni a las neuronas Cre-positivas ubicadas remotamente27. Los ratones Gabra1-ABLATE mostraron respuestas de enfermedad atenuadas a la infección por influenza que fueron similares a las de Gabra1-IRES-cre; Ratones Ptger3flox o ratones tratados con ibuprofeno (Fig. 4a).

a, Gabra1-IRES-cre; Se inyectaron ratones lsl-DTR bilateralmente en ganglios NJP con o sin toxina diftérica (DT) y luego se infectaron con el virus de la influenza A y se monitorearon como se indica. Los datos son media ± sem; n = 8 ratones por grupo. Ingesta de alimentos: P < 0,0001; consumo de agua: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P = 0,0004; supervivencia: P = 0,049. b, Se infectaron ratones de tipo salvaje con cirugía de transección del nervio glosofaríngeo bilateral o cirugía simulada con el virus de la influenza A y se controlaron según se indica. Los datos son media ± sem; n = 8 ratones por grupo. Ingesta de alimentos: P < 0,0001; consumo de agua: P < 0,0001; motilidad: P < 0,0001; peso corporal: P < 0,0001; P = 0,036. Prueba t no pareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para análisis de comportamiento o fisiología; prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. c, inmunotinción para DTR en preparaciones completas de ganglios NJP cuatro semanas después de la inyección. Barras de escala, 200 μm. d, se tomaron imágenes de los transitorios de calcio evocados por PGE2 (1 μM) o KCl (150 mM) usando Calbryte 520 AM en neuronas positivas para tdTomato recolectadas de forma aguda de los ganglios NJP de Gabra1-IRES-cre; Ratones lsl-tdTomato. Barra de escala, 10 μm. Las imágenes son representativas de tres réplicas técnicas. AU, unidades arbitrarias.

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Las neuronas NP9 carecen de expresión de Hoxb4 (ref. 22), y las neuronas GABRA1 a menudo se agrupan dentro de los ganglios NJP cerca de la rama glosofaríngea (Datos ampliados Fig. 10a), lo que sugiere que forman parte del nervio glosofaríngeo en lugar del nervio vago. Dado que la inyección de toxina diftérica afectó de manera similar a las neuronas vagales y glosofaríngeas, distinguimos las contribuciones de estos nervios al seccionar el nervio glosofaríngeo bilateralmente mientras se preserva el nervio vago. Los ratones con transección bilateral del nervio glosofaríngeo mostraron una atenuación similar a la enfermedad inducida por la influenza (Fig. 4b). Se demostró previamente que PGE2 activa y/o induce cambios transcripcionales en aferentes espinales y vagales28,29,30,31, por lo que probamos si las neuronas GABRA1 también se activan directamente. Observamos que PGE2 evocó directamente transitorios de calcio en neuronas GABRA1 cultivadas de forma aguda a partir de ganglios sensoriales NJP de Gabra1-IRES-cre; Ratones lsl-tdTomato (Fig. 4d, 16 de 26 o 61,5% de neuronas sensibles a KCl positivas para tdTomato). Por lo tanto, las neuronas NP9 glosofaríngeas raras detectan la presencia de una infección viral respiratoria indirectamente a través del receptor EP3 y, en respuesta, evocan un programa múltiple de comportamiento de enfermedad.

Los ratones Gabra1-IRES-cre proporcionan una herramienta valiosa para visualizar las escasas neuronas sensoriales glosofaríngeas involucradas en la diafonía neuroinmune, por lo que utilizamos enfoques de mapeo genético para marcar las proyecciones periféricas y centrales de las neuronas GABRA1 (Fig. 5a). Se inyectaron ganglios NJP de ratones Gabra1-IRES-cre con un AAV que contenía un gen informador dependiente de Cre que codifica tdTomato (AAV-flex-tdTomato) o fosfatasa alcalina (AAV-flex-AP), así como un AAV que contenía un Cre -gen reportero independiente que codifica GFP (AAV-GFP) para visualizar el campo de proyección global de NJP. Luego se visualizaron las fibras en las vías respiratorias y el cerebro.

a, se inyectaron bilateralmente ganglios NJP de ratones Gabra1-IRES-cre con AAV-GFP independiente de Cre y AAV-flex-tdTomato dependiente de Cre, y se visualizaron axones fluorescentes (verde: todos los axones sensoriales NJP; rojo: axones GABRA1 NJP) por inmunohistoquímica para tdTomato y GFP en criosecciones coronales fijas de tronco encefálico de ratón. Barra de escala, 200 μm. b, los ganglios NJP de ratones Gabra1-IRES-cre se inyectaron bilateralmente con AAV-flex-tdTomato, y los axones se visualizaron mediante inmunotinción para tdTomato en criosecciones coronales fijas de nasofaringe. Barras de escala, 100 μm (arriba), 50 μm (abajo). c, Arriba, inmunohistoquímica de COX2 en criosecciones fijas de nasofaringe en ratones no infectados (control) o ratones infectados durante cinco días con el virus de la influenza A. Barras de escala, 100 μm. Abajo, cuantificación de la inmunofluorescencia de COX2 en la nasofaringe de los ratones indicados. Los datos son media ± sem; n = 29 secciones de 5 ratones por grupo en 3 experimentos independientes. Prueba t no pareada de dos colas, P < 0,0001. Panel izquierdo en parte a adaptado con permiso de la ref. 35, Elsevier. Panel superior en la parte b creado con BioRender.com.

Datos fuente

Centralmente, las neuronas sensoriales de los ganglios nodosos y petrosos cruzan el cráneo e inervan regiones del tronco encefálico que incluyen el núcleo del tracto solitario (NTS) y el área postrema32, mientras que las neuronas sensoriales yugulares inervan el núcleo paratrigeminal33. Varios aferentes vagales definidos por Cre se dirigen a subregiones espacialmente restringidas del NTS, con algunos pero no todos los tipos de aferentes que también acceden al área postrema24,34,35. Los axones de las neuronas NJP GABRA1 estaban muy restringidos en el NTS lateral (Fig. 5a), no se observaron en el área postrema y estaban alejados de las ubicaciones del NTS objetivo de los axones de algunas otras neuronas NJP definidas por Cre, como las neuronas que inervan el intestino marcadas por expresión de Gpr65 o Glp1r35. Estos hallazgos respaldan aún más un modelo para la organización topográfica en el tronco encefálico36, con neuronas que transmiten la presencia de una infección de las vías respiratorias espacialmente restringida de al menos algunas otras entradas interoceptivas.

En la periferia, se observaron axones GABRA1 marcados en solo unos pocos órganos internos que se sabe que reciben inervación vagal y glosofaríngea. Observamos la inervación más densa en la nasofaringe y la cavidad oral, incluidas las papilas gustativas, cierta inervación de los músculos traqueales y faríngeos, y escasa inervación del músculo del estómago (Datos ampliados, Fig. 10b). No se observó inervación en muchos otros órganos internos, incluidos el corazón, el esófago, la aorta y el seno carotídeo. La nasofaringe es un sitio rico para la vigilancia inmunológica, ya que conecta la cavidad nasal con el resto del sistema respiratorio y proporciona una línea temprana de defensa inmunológica mucosa37. La infección por influenza aumenta los niveles de PGE2 localmente dentro de la nasofaringe38, y en los humanos conduce a la inflamación de las amígdalas nasofaríngeas39. Los ratones tienen un sistema ortólogo conocido como tejido linfoide asociado a la nasofaringe40, por lo que probamos si los axones GABRA1 estaban ubicados cerca de los mediadores inmunitarios relevantes. Los axones GABRA1 se enriquecieron dorsalmente en las capas epiteliales y subepiteliales de la nasofaringe (Fig. 5b) y, en particular, la expresión de ciclooxigenasa-2 también se detectó en el epitelio dorsal de la nasofaringe (Fig. 5c). Además, la expresión de ciclooxigenasa-2 aumentó notablemente en la nasofaringe dorsal después de la infección por influenza en ratones (Fig. 5c). Así, las neuronas GABRA1 ocupan una posición estratégica y privilegiada para la detección de los niveles elevados de PGE2 que se producen durante la infección viral.

A pesar de la vacunación estacional y la terapia antiviral, la infección viral por influenza A sigue siendo una de las amenazas humanas más graves y afecta a millones de personas en todo el mundo cada año. Los inhibidores de la ciclooxigenasa-2 se encuentran entre los medicamentos contra la enfermedad y el dolor más prevalentes, con alrededor de 30 mil millones de dosis de medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) consumidos anualmente solo en los EE. UU.41. El bloqueo de la producción de PGE2 alivia la enfermedad y se han propuesto varios modelos sobre cómo el cerebro recibe información sobre una infección periférica a través de PGE2 (ref. 2). Aquí, observamos que los comportamientos de enfermedad inducidos por la influenza se atenuaron de manera similar por 1) el ibuprofeno, la aspirina y el antagonismo del receptor EP3, 2) la desactivación del gen dirigido a Ptger3 usando ratones Advillin-creER, Phox2b-cre y Gabra1-IRES-cre, y AAV directo -inyección de cre en ganglios NJP, 3) ablación de neuronas GABRA1 NJP, y 4) y transección del nervio glosofaríngeo. A partir de estos resultados combinados, concluimos que un pequeño grupo de neuronas sensoriales glosofaríngeas que expresan Gabra1 detecta PGE2 e induce un estado de enfermedad orquestado neuronalmente asociado con un conjunto de respuestas conductuales a la infección viral respiratoria.

Las prostaglandinas y muchas otras citocinas pueden activar aferentes periféricos vagales y otros in vitro8,29,31, pero sus funciones fisiológicas en las infecciones naturalistas han sido difíciles de analizar. La vagotomía bloquea las respuestas de la enfermedad a las citocinas y los lipopolisacáridos en algunos estudios, pero no en otros42,43, y esta variabilidad puede deberse a la ubicación o la dosis de administración de pirógenos. Nuestros hallazgos indican un papel claro para las escasas neuronas sensoriales del glosofaríngeo que están preparadas anatómicamente para detectar la PGE2 inducida por la influenza. La PGE2 tiene una estabilidad limitada in vivo44, por lo que las neuronas sensoriales periféricas que detectan directamente la PGE2 en el sitio de la infección aparentemente proporcionarían un conducto rápido y sólido para la transferencia de información al cerebro.

Se han propuesto comportamientos de enfermedad para ayudar a conservar energía para combatir infecciones1. Sin embargo, eliminar la vía de detección de influenza del nervio glosofaríngeo no solo atenúa el comportamiento de enfermedad, sino que también promueve la supervivencia. El golpe de gracia de EP3 de un pequeño grupo de neuronas glosofaríngeas es suficiente para imitar el fenotipo de supervivencia profunda observado en los golpes de gracia de cuerpo completo. Un modelo es que la anorexia inducida por patógenos es beneficiosa en algunos modelos de infección pero dañina en otros. Por ejemplo, bloquear la producción de PGE2 es dañino durante la infección por mycobacterium 345, pero promueve la supervivencia durante la infección por influenza19,46. Además, la sonda de glucosa es perjudicial durante la sepsis bacteriana, donde la glucosa en sangre puede proporcionar combustible directo para el patógeno, pero protege durante la infección por influenza47. Por lo tanto, la interrupción de las respuestas neuronales a la infección puede disminuir la mortalidad al atenuar los cambios en el comportamiento alimentario. Además, una vía neural que promueve la anorexia activada por infección puede proporcionar un beneficio neto de supervivencia durante ciertas infecciones bacterianas y, por lo tanto, se mantiene a lo largo de la evolución, pero es dañina durante la infección viral, como se observa aquí. Además, el comportamiento de enfermedad puede proporcionar un beneficio separado a nivel de población, ya que los animales enfermos buscan aislamiento y, por lo tanto, limitan la transmisión de patógenos a sus parientes48.

Estos hallazgos indican que la desactivación del receptor EP3 en las neuronas sensoriales no solo afecta el comportamiento de enfermedad, sino también la respuesta inmune y la transición viral del tracto respiratorio superior al inferior. Una interpretación parsimoniosa de estos hallazgos es que las neuronas GABRA1 petrosas, al detectar PGE2, activan circuitos neuronales que evocan respuestas coordinadas que incluyen comportamientos de enfermedad, así como reflejos motores que afectan la función inmunológica. Además, los cambios en el comportamiento de alimentación pueden afectar de manera secundaria la función inmunológica47,48 y la activación de las neuronas GABRA1 petrosas puede afectar los niveles de citocinas distintas de PGE2 (Datos ampliados, Fig. 9c), lo que potencialmente puede provocar una mayor retroalimentación neuronal y mejorar el comportamiento de enfermedad. Todas estas respuestas a la infección dependerían críticamente del receptor EP3 en las neuronas petrosas GABRA1, que desempeña un papel esencial en transmitir primero la presencia de una infección de las vías respiratorias superiores al cerebro y, en última instancia, provocar un comportamiento de enfermedad.

El comportamiento de enfermedad inducido por la infección de influenza se atenuó, pero no se eliminó, después del tratamiento con AINE, la eliminación del receptor EP3 dirigido, la ablación neuronal dirigida y la sección del nervio glosofaríngeo, lo que sugiere otras rutas hacia la enfermedad. Es de destacar que la cinética del comportamiento residual de la enfermedad después de la manipulación de las neuronas petrosas GABRA1 coincide con el curso temporal de la acumulación del virus en los pulmones, lo que indica que probablemente hay dos fases del comportamiento de la enfermedad inducida por la influenza. La primera fase ocurre cuando el virus es más frecuente en el tracto respiratorio superior, y la enfermedad está mediada principalmente por neuronas sensoriales glosofaríngeas que detectan PGE2 marcadas por GABRA1, que se proyectan a la nasofaringe. La segunda fase de la enfermedad ocurre cuando el virus es más frecuente en el tracto respiratorio inferior y el pulmón está inervado principalmente por neuronas sensoriales vagales en lugar de glosofaríngeas. Nuestros datos plantean la posibilidad de que esta segunda fase de la enfermedad involucre otra vía neuronal independiente de las neuronas sensoriales PGE2, EP3 y glosofaríngeas. Los inhibidores de las vías de interacción neuroinmune residuales, una vez identificados, podrían brindar un alivio mejorado del malestar inducido por la influenza cuando se usan en combinación con AINE. También notamos que los receptores PGE2 se expresan en múltiples tipos de neuronas sensoriales NJP, así como en el cerebro y los ganglios de la raíz dorsal. Es probable que el sistema nervioso utilice múltiples vías sensoriales para detectar infecciones periféricas, con diferentes sensores tal vez especializados para tipos de patógenos particulares o ubicaciones de infección en el cuerpo. De esta manera, las neuronas sensoriales intestinales y respiratorias podrían comprometer diferentes circuitos neuronales que provocan, por ejemplo, tos o náuseas31,49. De acuerdo con esta noción, varias rutas hacia la enfermedad son diferencialmente sensibles a la inhibición farmacológica; por ejemplo, el malestar intestinal se trata clínicamente con antagonistas del receptor de serotonina HTR3A50. Comprender la diversidad de las vías sensoriales hacia la enfermedad y cuándo están involucradas en diferentes infecciones por patógenos proporcionará un marco esencial para descifrar este estado fisiológico complejo y poco conocido, y puede permitir intervenciones terapéuticas mejoradas.

Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas éticas descritas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y todos los protocolos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) en la Escuela de Medicina de Harvard. Los ratones se mantuvieron a temperatura constante (23 ± 1 °C) y humedad relativa (46 ± 5 %) con un ciclo de luz:oscuridad de 12 h. C57BL/6J de tipo salvaje (000664), Nestin-cre (003771), Phox2b-cre (016223), Advillin-creER (032027), Trpv1-IRES-cre (017769), Pdyn-IRES-cre (027958), Piezo2 -EGFP-IRES-cre (027719), Oxtr-IRES-cre (031303), Agrp-cre (012899), lsl-DTR (007900), lsl-tdTomato (Ai14, 007914) se adquirieron de Jackson Laboratories. Previamente se generaron ratones Gabra1-IRES-cre, lsl-L10-GFP y Ptger3flox14,22,51.

La gripe A/PR/8/34 (H1N1) se adquirió de Charles River Avian Vaccine Services (10100374) con una EID50 de 1012 ml−1. El virus se diluyó en solución salina estéril para la dosis administrada, que fue EID50 106 ml−1 a menos que se indique lo contrario. La administración viral se adaptó de estudios previos52. Los ratones despiertos se sujetaron manualmente y el virus de la influenza A se administró a través de cada fosa nasal (25 μl de volumen total) lentamente usando una pipeta P200 para evitar el derrame o la administración a la boca. Después de la administración, los ratones se mantuvieron con las fosas nasales en posición vertical durante 10 a 15 s y se devolvieron a su jaula.

Para el análisis de los cambios de comportamiento inducidos por la infección por el virus de la influenza A, se alojaron individualmente ratones de seis a ocho semanas de edad sin sesgo sexual con acceso libre a alimentos y agua. Los valores de referencia se obtuvieron midiendo la ingesta diaria de alimentos, la ingesta diaria de agua, el peso corporal y la motilidad durante tres días antes de la inoculación. Después de la infección viral, todas las medidas se expresaron como un cambio porcentual con respecto a los valores iniciales. La ingesta de comida y agua se calculó diariamente midiendo el cambio en el peso de la comida y el agua restantes en la jaula. Se registró el movimiento de los animales (C922x Pro Stream Webcam, Logitech) en la jaula de la casa durante 30 minutos diarios y la motilidad se expresó como la distancia total recorrida, según lo determinado por el complemento MTrack2 disponible en ImageJ (1.53q, NIH). Para la medición de la ingesta aguda de alimentos, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 24 h y, al comienzo de la oscuridad, se les administró PGE2 o sulprostona (agonista de EP3, 14765, Cayman Chemical Company) a través de la vía de exposición y las dosis indicadas en las leyendas de las figuras. Luego, los animales se alojaron individualmente en jaulas limpias con acceso ad libitum a comida y agua, y se determinó la cantidad de comida consumida durante 1 h midiendo la comida en la jaula antes y después del período de prueba.

La temperatura corporal central se controló mediante una sonda rectal o radiotelemetría. Las mediciones de la sonda rectal se realizaron cada hora todos los días desde el mediodía hasta la medianoche utilizando una sonda de temperatura rectal de ratón (Kent Scientific, RET-3, diámetro de punta de 0,16 mm) conectada a un termómetro (Kent Scientific WD-20250-9). Las sondas se esterilizaron (70 % de etanol), se lubricaron (gel lubricante Aquagel, ParkerLabs, 57-05) y se insertaron entre 5 y 7 mm en el recto de ratones sujetos físicamente y se registró la temperatura durante 30 s. Para la radiotelemetría, se implantó quirúrgicamente en la cavidad abdominal un dispositivo de radiotelemetría que informa la temperatura corporal (HD-X11, DSI). La cirugía se realizó bajo anestesia con avertin (200 mg kg−1, inyección intraperitoneal) y se desinfectó y rasuró el área abdominal. Se realizó una incisión de ~1 cm y se expuso suavemente el peritoneo abdominal en la línea alba para insertar el dispositivo de radiotelemetría estéril. El sitio de la cirugía se selló con suturas VICRYL (J392H, Ethicon). Los animales recibieron buprenorfina SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg−1 por vía subcutánea en la nuca) y se les permitió recuperarse durante al menos una semana. Los datos de temperatura corporal se recopilaron en intervalos de 15 minutos con un receptor (easyTEL, Emka Technologies) conectado a una computadora con el software iox v.2.10.8. Se promediaron todos los puntos de datos de un ratón en un día determinado.

El ibuprofeno (I4883) y la aspirina (ácido acetilsalicílico, A5376) se adquirieron de Sigma, y ​​los antagonistas del receptor de PGE2 SC-51322 (2791), PF-04418948 (4818), DG-041 (6240) y ONO-AE3-208 (3565 ) fueron adquiridos de Tocris. Se añadió ibuprofeno (1 mg ml-1, solución salina) al agua de bebida ad libitum, y se inyectaron (intraperitonealmente) diariamente aspirina (20 mg kg-1, solución salina) y antagonistas de los receptores de PGE2 (1 mg kg-1, solución salina). La administración de inhibidores de ciclooxigenasa-2 y antagonistas del receptor de PGE2 comenzó 3 días antes de la inoculación del virus y continuó hasta el final del período de seguimiento. El tamoxifeno se administró diariamente durante 5 días (inyección intraperitoneal, 70 mg kg-1) al menos una semana antes de la infección por el virus de la influenza.

Los ganglios NJP se inyectaron con AAV o toxina diftérica como se describió previamente34, con modificaciones menores. Los ratones se anestesiaron (200 mg kg-1 de avertin, inyección intraperitoneal) y se aseguró la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento por la falta de una respuesta de pellizco del dedo del pie. Los ganglios NJP se expusieron y se inyectaron en serie (10 × 13,8 nl) con solución salina que contenía VAA (título > 6,7 × 1012 vg ml-1) o toxina diftérica (5 μg ml-1, Sigma) complementada con 0,05 % de colorante Fast Green FCF (Sigma) con una pipeta de vidrio tirada con fuerza unida a un inyector Nanoject (Drummond). AAV-cre (AAV-Syn-Cre-GFP, SignaGen Laboratories, SL100892, AAV9), AAV-flex-tdTomato (AAV9.CAG.Flex.tdTomato.WPRE.BGH, Addgene, 51503, AAV9), AAV-GFP (pENN .AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG, Addgene, 105542, AAV9) y AAV-flex-AP (AAV9.CAG.flex.PLAP.WPRE.bgH, virus personalizado, Boston Children's Hospital Viral Core, Boston, MA, AAV9) fueron adquiridos. La inyección exitosa se verificó mediante Fast Green FCF Dye llenando lentamente todo el ganglio sin fugas. Las heridas quirúrgicas se cerraron con suturas VICRYL recubiertas (J392H, Ethicon) y los animales recibieron buprenorfina SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg−1 por vía subcutánea en la parte posterior del cuello) como analgésico. Los animales se recuperaron durante al menos dos semanas para el análisis de comportamiento o cuatro semanas para el análisis histológico.

Los ratones se anestesiaron (200 mg kg-1 de avertin, inyección intraperitoneal) y se aseguró la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento por la falta de una respuesta de pellizco del dedo del pie. Los ganglios NJP se expusieron quirúrgicamente, y el nervio glosofaríngeo se identificó y seccionó inmediatamente adyacente a los ganglios usando microtijeras. Las cirugías simuladas implicaron la exposición de los ganglios NJP sin la sección del nervio. Las heridas quirúrgicas se cerraron con suturas VICRYL recubiertas (J392H, Ethicon) y los animales recibieron 20 mg kg−1 de buprenorfina SR (BupSR-LAB, ZooPharm, por vía subcutánea en la parte posterior del cuello) como analgésico. Los animales se recuperaron durante al menos dos semanas antes del análisis de comportamiento.

La inmunohistoquímica y el análisis de la fluorescencia del tejido nativo se realizaron después de la perfusión intracardíaca del fijador (10 ml de PBS, luego 10 ml de paraformaldehído al 4% en PBS). Para la inmunotinción DTR de montaje completo, se recolectaron y permeabilizaron ganglios NJP (11,5 g de glicina, 400 ml de PBS con Triton X-100 al 0,2 %, 100 ml de DMSO) a 37 °C durante 1 semana. Luego se bloquearon los ganglios (1 h, temperatura ambiente) en tampón de bloqueo (suero de burro normal al 5 %, 017-000-121, Jackson en Tween-20 al 0,05 %/PBS) y se incubaron (durante la noche, 4 °C) con 1:200 anti-DTR (HB-EGF, Cabra, AF259NA, Fisher Scientific) en tampón de bloqueo. Las muestras se lavaron (4 × 10 min, 0,05 % Tween-20 en PBS, temperatura ambiente) y se incubaron (2 h, temperatura ambiente) con solución anti-cabra Alexa 488 (Jackson Immunoresearch, 705-545-147, 1:500 in). PBS con 0,05 % de Tween-20). Los tejidos se lavaron nuevamente (4 × 10 min, Tween-20 al 0,05 % en PBS, temperatura ambiente), se montaron (medio Fluoromount G, SouthernBiotech) en portaobjetos de microscopio (Fisher Scientific), se visualizaron con un microscopio confocal Leica SP5 II y se analizaron con ImagenJ (1.53q). Para la inmunotinción con ciclooxigenasa-2, el tejido nasofaríngeo se seccionó criogénicamente (15 μm), se bloqueó (1 h, temperatura ambiente) con una solución de bloqueo (5 % de suero de burro normal, PBS con 0,01 % de Triton X-100) y se incubó (durante la noche, 4 °C). C) con anticuerpo anti-COX2 (conejo, ab179800, Abcam, 1:500 en PBS con 0,01% Triton X-100). Las secciones se lavaron (3 × 10 min, temperatura ambiente, PBS con Triton X-100 al 0,01 %) y se incubaron (2 h, temperatura ambiente) con solución anti-conejo Alexa 488 (Jackson Immunoresearch, 711-545-152, 1:1000). en PBS con 0,01% Triton X-100). Las secciones se lavaron nuevamente (3 × 10 min, temperatura ambiente, PBS con Triton X-100 al 0,01 %), se montaron con medio Fluoromount G y se visualizaron con un microscopio confocal Leica SP5 II. Para visualizar los axones del tronco encefálico, se obtuvieron criosecciones del tronco encefálico (20 μm) de ratones inyectados con AAV y se procesaron como se describió anteriormente para la inmunotinción de ciclooxigenasa-2 en tejido nasofaríngeo, excepto que los anticuerpos eran anti-GFP 1:1000 (pollo, GFP-1020, Aves Labs), 1:1000 anti-RFP (conejo, 600-401-379, Rockland), anti-pollo Alexa 647 (Jackson Immunoresearch, 703-605-155, 1:300) y anti-conejo Cy3 (Jackson Immunoresearch, 111 -165-144, 1:300). Para visualizar los axones en la nasofaringe, se tiñeron secciones nasofaríngeas fijas (15 μm) como se indicó anteriormente para inmunotinción con ciclooxigenasa-2, pero con anticuerpo primario anti-RFP seguido de anticuerpo secundario Cy3 anti-conejo. Para la inervación de la neurona GABRA1 en la tráquea y los músculos constrictores de la faringe inferior, se recogieron tejidos frescos, se cortaron a lo largo del eje ventral para visualización en libro abierto, se fijaron (paraformaldehído al 4 %/PBS, ya sea 1 h, temperatura ambiente o durante la noche, 4 °C), y teñido para tdTomato como se indicó anteriormente para la visualización de tdTomato en la nasofaringe, excepto que la incubación del anticuerpo primario (36 h, 4 ° C) y los lavados posteriores (3 × 12 h, 4 ° C) fueron más largos. Para visualizar la fosfatasa alcalina, los animales se perfundieron con PBS y los tejidos se recolectaron, se fijaron (paraformaldehído al 4%, 1 h, temperatura ambiente) y se lavaron en PBS frío. A continuación, los tejidos se incubaron (70 °C, 2 h) en tampón de fosfatasa alcalina (Tris HCl 0,1 M, pH 9,5, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, Tween-20 al 0,1 %, levamisol 5 mM) y se lavaron dos veces en tampón de fosfatasa alcalina. La actividad de la fosfatasa alcalina se visualizó con solución NCT/BCIP (34042, ThermoFisher Scientific) según los protocolos del fabricante. Las muestras teñidas se posfijaron (paraformaldehído al 4 %, durante la noche, 4 °C), se deshidrataron mediante una serie de lavados con etanol y se aclararon con una mezcla 1:2 de alcohol bencílico (Sigma-Aldrich 402834-500ML): benzoato de bencilo (Sigma -Aldrich B6630-1L). A continuación, se cortó el tejido a lo largo del eje ventral para visualización de libro abierto. Las tinciones de montaje completo se capturaron mediante microscopía con un AxioZoom (Zeiss) y se analizaron con ImageJ (1.53q).

Las sondas de reacción en cadena de hibridación (HCR) basadas en ADN contra Ptger3 (n.º de lote PRH698) y Phox2b (n.º de lote PRF341) se adquirieron de Molecular Instruments. Solución de hibridación (formamida al 30 %, SSC 5x, ácido cítrico 9 mM (pH 6), Tween-20 al 0,1 %, heparina 50 μg ml−1, solución de Denhardt 1x, sulfato de dextrano al 10 %), tampón de lavado de sonda (30 % formamida, SSC 5x, ácido cítrico 9 mM pH 6,0, Tween-20 al 0,1 %, 50 μg ml−1 de heparina), tampón de amplificación (SSC 5x, Tween-20 al 0,1 %, sulfato de dextrano al 10 %) y marcado con fluoróforo. Los amplificadores HCR se adquirieron de Molecular Instruments. Los ganglios NJP se recolectaron recientemente, se montaron en OCT (Sakura Finetek) y se crioseccionaron (10 μm). El tejido se fijó posteriormente (4% PFA, PBS, temperatura ambiente, 20 min), se lavó (3 × 10 min, PBS, temperatura ambiente), se trató con peróxido de hidrógeno al 1% (PBS, temperatura ambiente, 20 min) y se incubó. con sondas Ptger3 y Phox2b HCR (0,4 pmol, tampón de hibridación en una cámara humidificada, 37 °C, durante la noche). A continuación, se lavó el tejido (15 min, 37 °C) con (1) tampón de lavado de sonda 3:1: 5x SSCT (5x SSC, 0,1% Tween-20), (2) tampón de lavado de sonda 1:1: 5x SSCT, (3) tampón de lavado de sonda 1:3: 5x SSCT y (4) 5x SSCT. Luego, el tejido se incubó con tampón de amplificación (30 min, temperatura ambiente) y luego con amplificadores HCR fluorescentes (6 pmol, Alexa594 para la sonda Ptger3 y Alexa 488 para la sonda Phox2b) en tampón de amplificación (cámara humidificada, temperatura ambiente, durante la noche). Luego se lavó el tejido (5 × SSCT, 2 × 30 min, 1 × 5 min, temperatura ambiente), se montó en medio Fluoromount G y se visualizó mediante microscopía confocal (Leica SP5 II).

Todos los gráficos UMAP de este manuscrito se realizaron a partir de datos transcriptómicos unicelulares publicados (GEO Accession ID: GSE145216)22 utilizando Seurat (4.1.0) y R Studio (4.1.2).

Los niveles de Ptger3 de ratón, transcripción de Gapdh y nucleoproteína (NP) del virus de la influenza se midieron en ADNc obtenido de hipotálamo, ganglios NJP, lavado nasal (para análisis del tracto respiratorio superior) y/o BALF (para análisis del tracto respiratorio inferior). La BALF se recolectó abriendo quirúrgicamente el cuello y canulando un catéter 21G en la tráquea. En total, se inyectaron lentamente 3 × 1 ml de PBS en los pulmones, luego la solución se aspiró suavemente de nuevo a la jeringa y se recogió. El BALF recolectado se centrifugó (7 min, 400 g, 4 °C) y los sobrenadantes se almacenaron (-80 °C) hasta el análisis. El lavado nasal se realizó insertando una aguja (26G) en la tráquea superior en ángulo hacia la nariz. Se administró PBS estéril (1 ml) a través de la aguja a través de una jeringa canulada (cánula de polietileno PE20, diámetro interno de 0,38 mm), y se recogió después de la expulsión de la nariz. El ARN se recolectó y el ADNc se sintetizó a partir de BALF, líquido de lavado nasal y tejido homogeneizado usando Trizol (15596026, ThermoFisher) y el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (4368813, ThermoFisher) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El análisis de qPCR se realizó en cDNA utilizando cebadores específicos de genes, PowerTrack SYBR Green Master Mix (A46012, ThermoFisher) en el instrumento QuantStudio 7 qPCR (ThermoFisher). Los cebadores Gapdh fueron GGGTGTGAACCACGAGAAATATG y TGTGAGGGAGATGCTCAGTGTTG; Los cebadores de Ptger3 fueron CAACCTTTTCTTCGCCCTCTG y TTTCTGCTTCTCCGTGTGTG; y los cebadores de nucleoproteínas del virus de la influenza fueron GACGATGCAACGGCTGGTCTG y ACCATTGTTCCAACTCCTTT. Los niveles de expresión de Ptger3 y nucleoproteína se normalizaron a niveles de Gapdh. La normalización se realizó mediante el método 2–ΔCT para Extended Data Fig. 4a, y el método 2–ΔΔCT53 para Extended Data Fig. 9b, con normalización adicional utilizando valores de controles no infectados.

Los ratones fueron sacrificados en diferentes puntos de tiempo después de la infección con el virus de la influenza A. Se recogió sangre total mediante punción cardíaca utilizando una aguja y una jeringa recubiertas con EDTA 0,5 M y se mezcló inmediatamente con EDTA 0,5 M (50 µl). El plasma se aisló por centrifugación (3000 rpm, 10 min, 4 °C) y el sobrenadante se almacenó (-80 °C) hasta el análisis ELISA. BALF se recogió como se describe anteriormente. Los niveles de PGE2 y citoquinas se midieron en plasma y/o BALF por ELISA (R&D Systems, PGE2: KGE004B, TNF: DY410-5, IFNγ: DY485-05, IL-6: DY406-05) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los ganglios NJP se recolectaron de forma aguda de Gabra1-IRES-cre; Ratones lsl-tdTomato e incubados (37 °C, 90 min, con rotación) en solución de disociación (Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene liberasa (55 mg ml−1, Roche, 05401135001), ADNasa (0,004 %, Worthington, LS002007 )). A continuación, las células se sedimentaron (3 min, 300 g, 4 °C) y se resuspendieron en ovomucoide al 0,2 %, DNasa al 0,004 %, DMEM, 200 µl. Con una pipeta P200, las células se trituraron al menos 10 veces hasta que no se observaron grumos, se filtraron a través de un colador de células de malla de 40 μm y se sedimentaron nuevamente (3 min, 300 g, 4 °C). A continuación, las células se resuspendieron en medio de cultivo que contenía Calbryte 520 AM 5 µM (20651, AAT Bioquest); el medio de cultivo contiene 1x B27 (Gibco, 17504044), 1x N2 (Gibco, 17502048), 1x penicilina y estreptomicina (Gibco, 15140122) en medio Neurobasal sin rojo fenol (Gibco, 12348017). A continuación, las células resuspendidas se sembraron en placas de vidrio recubiertas con laminina y se incubaron (37 °C, al menos 30 minutos antes de la toma de imágenes) en una incubadora de CO2 humidificada. A continuación, el cubreobjetos se transfirió a una cámara con perfusión de entrada y salida (Warner Instruments, RC-24N) con flujo continuo de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Luego se tomaron imágenes de las respuestas de calcio (488 nm) en perfusión de prostaglandina E2 (1 μM en HBSS, 2 min) y KCl (150 mM, al final de la serie). Las neuronas positivas para GABRA1 se identificaron mediante fluorescencia tdTomato (568 nm). Las células se identificaron como sensibles si la fluorescencia media de Calbryte 520 AM durante el período de estimulación superaba las tres desviaciones estándar por encima de la media de referencia.

La fotometría de fibra de las neuronas AGRP se realizó como se describe54 con PGE2 (inyección intraperitoneal, 0,5 mg kg−1) o PBS inyectado de forma aguda durante una breve restricción manual utilizando el software Synapses (compilación: 94-42329P, Tucker-Davis Technology). Los datos se analizaron utilizando Matlab (R2020a).

Los datos en los gráficos se representan como media ± sem, con todos los tamaños de muestra y valores de P proporcionados en las leyendas de las figuras. El análisis estadístico para los experimentos de comportamiento implicó promediar los cambios diarios en los parámetros indicados por ratón (días 1 a 10 después de la infección o durante la supervivencia). La significancia estadística se calculó con el software Prism 8.4.3 (GraphPad) e involucró pruebas estadísticas descritas en las leyendas de las figuras. El análisis probit en Extended Data Fig. 5b se realizó con SPSS, 21 (IBM). Los tamaños de las muestras se eligieron en base a la experiencia previa y las publicaciones en nuestro campo26,55 y se describen en las leyendas de las figuras. Los grupos de animales se asignaron al azar y los animales de control se emparejaron por edad con los animales experimentales. El mismo investigador realizó el genotipado y el análisis de las respuestas a la enfermedad, por lo que los datos no se generaron de forma ciega al genotipo o al grupo experimental.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos utilizados para generar figuras, incluidos los puntos de datos de comportamiento de cada ratón individual, se proporcionan como datos de origen. Todos los reactivos que pueden no estar disponibles comercialmente, incluidos ciertos ratones transgénicos y AAV, estarán disponibles gratuitamente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a C. Saper por ratones Ptger3flox y comentarios sobre el manuscrito. Los dibujos animados se crearon utilizando BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (DP1 AT009497 y R01 HL132255) y la Iniciativa Chan Zuckerberg para SDL, una beca posdoctoral de Banting para N.-RB y una beca Goldberg de la Escuela de Medicina de Harvard para NHSLP. Fue un erudito distinguido de Warren Alperts y SDL. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Sara L. Prescott

Dirección actual: Departamento de Biología, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Instituto Médico Howard Hughes, Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Na-Ryum Bin, Sarah L. Prescott, Nao Horio, Yandan Wang y Stephen D. Liberles

Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Isaac M. Chiu

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Experimentos diseñados por N.-RB, SLP, NH, IMC y SDL. N.-RB, NH, SLP y YW realizaron experimentos. N.-RB, SLP, NH, IMC y SDL datos analizados. N.-RB y SDL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Stephen D. Liberles.

SDL es consultor de Kallyope, Inc. Los otros autores declaran no tener intereses en conflicto.

Nature agradece a Alice McGovern, Ruslan Medzhitov y Kevin Tracey por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, El análisis estadístico para experimentos de comportamiento implicó promediar los cambios diarios en los parámetros indicados por ratón (días 1 a 10 después de la infección o durante la supervivencia), como se representa aquí en gráficos de barras. Los valores estadísticos son idénticos a los de la Fig. 1a. b, los niveles de PGE2 en plasma (izquierda, centro) y BALF (derecha) se midieron mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados después de la exposición al virus de la influenza A (rojo, azul) o control del vehículo (negro). A algunos ratones infectados por el virus (azul) se les proporcionó además acceso ad libitum a ibuprofeno (1 mg/ml) en agua potable desde 3 días antes de la infección (izquierda) o recibieron administración diaria de aspirina (IP, 20 mg/kg), media ± sem, n: 3 ratones por grupo, ***p < 0,0005 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni con comparaciones realizadas entre curvas rojas y negras (estrellas rojas) o curvas rojas y azules (estrellas azules). Los valores de p en b son <0,0001 para todas las estrellas indicadas.

Datos fuente

a, Ingesta de alimentos por ratones en ayunas administrados con PGE2 (izquierda: IP, derecha: intranasal) en las dosis indicadas (mg/kg) y con acceso ad libitum a los alimentos (1 h), media ± sem, n: 9 (izquierda) ratones por grupo, 28 (vehículo), 10 (0,0625, 0,125, 0,25), 20 (0,5) en (derecha), ***p < 0,0005, **p < 0,005, *p < 0,05, ns: no significativo por Prueba de comparación múltiple de dos vías ANOVA Tukey. b, Ingesta de alimentos por ratones en ayunas a los que se administró el agonista del receptor EP3 sulprostona (izquierda: IP, derecha: intranasal) en las dosis indicadas (mg/kg) y con acceso ad libitum a los alimentos (1 h), media ± sem, n: 8 ratones por grupo, ***p < 0,0005, *p < 0,05 mediante la prueba de comparación múltiple de ANOVA Tukey bidireccional (izquierda) o la prueba t no apareada de dos colas (derecha). c, se midió la fluorescencia de GCaMP6s (ΔF/F) en neuronas AGRP del núcleo arqueado mediante fotometría de fibra antes y después de la inyección IP de PGE2 (0,5 mg/kg en PBS) o vehículo solo (PBS). (arriba) Las respuestas se representan como la media de las mediciones realizadas en intervalos de tiempo de 10 minutos (por ejemplo, 10 se refiere a la media de las mediciones realizadas entre 0 y 10 min), media ± sem, n: 12 ratones por grupo, ** p < 0,01, ***p < 0,001 por ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni, (abajo) trazas de registro representativas con una barra roja que indica el momento de la inyección. valores de p de izquierda a derecha en a: IP: <0,0001, 0,0005, <0,0001, intranasal: <0,0001, 0,0455, 0,0008, 0,6630; b, IP: <0,0001, 0,0312, 0,0187, intranasal: <0,0001; c: <0,0001, <0,0001, 0,0045.

Datos fuente

a, temperatura corporal central en flox-Ptger3 y Gabra1-ires-Cre; Los ratones flox-Ptger3 se midieron diariamente después de la administración del virus de la influenza (rojo, azul) o solución salina (negra) usando una sonda rectal (izquierda) o radiotelemetría (derecha), media ± sem, n: 6 (izquierda) y 3 (derecha) ratones por grupo, ***p < 0,0005 mediante la prueba de comparación múltiple de ANOVA de Dunnett unidireccional (izquierda); ***p < 0,0005 mediante la prueba t no pareada de dos colas para la derecha como se detalla en la Fig. 1 para el análisis de comportamiento/fisiología (derecha), comparaciones entre curvas rojas y negras (estrellas rojas) o entre curvas rojas y azules (estrellas azules ). Para los datos de la derecha, dos de los tres ratones flox-Ptger3 de control murieron el día 5, por lo que los datos posteriores se representan como una línea discontinua y el análisis estadístico se realizó solo en los datos de los días 1-4. b, Los ratones recibieron inyecciones diarias de aspirina (IP, 20 mg/kg), rojo o vehículo solo (negro) durante todo el paradigma. Después de tres días, los ratones se infectaron con el virus de la influenza A y posteriormente se controlaron como se indica, media ± sem, n: 6 ratones por grupo, ***p < 0,0005 mediante la prueba t no apareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para el comportamiento /análisis fisiológico, *p < 0,05 mediante una prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. valores de p en a, izquierda: rojo <0,0001, azul 0,0003, derecha: <0,0001; b, de izquierda a derecha: <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0243.

Datos fuente

a, análisis qPCR de la expresión de Ptger3 en hipotálamo (izquierda) o ganglios NJP (derecha) de flox-Ptger3 (blanco), Nestin-Cre; flox-Ptger3 (rojo) y Phox2b-Cre; Ratones flox-Ptger3 (azul). Los ratones Phox2b-Cre muestran expresión de Cre en las neuronas nodosas y petrosas, pero no en las yugulares56. Los niveles de transcripción de Ptger3 se expresaron después de la normalización a los niveles de expresión de Gapdh, media ± sem, n: 6 ratones para flox-Ptger3 y 3 para otros grupos, ***p < 0,0005, ns: no significativo mediante la prueba de comparación múltiple de ANOVA de Dunnett unidireccional . b, los ratones de control flox-Ptger3 se trataron con (derecha) o sin (izquierda) tamoxifeno durante 5 días consecutivos (IP, 70 mg/kg) como se hizo con Advillin-CreER; ratones flox-Ptger3. Al menos una semana más tarde, los ratones fueron expuestos al virus de la influenza A (rojo) o solución salina (negra) y monitoreados como se indica, media ± sem, n: 6 ratones por grupo, ***p < 0.0005 por t no apareada de dos colas. -prueba como se detalla en la Fig. 1 para análisis de comportamiento/fisiología, *p < 0,05 mediante una prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para análisis de supervivencia. valores de p en a, izquierda: <0,0001, 0,7506, derecha: 0,8680, <0,0001; b de arriba a abajo, izquierda: <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0179, derecha: <0,0001, 0,0003, <0,0001, 0,0179.

Datos fuente

a, los ratones de tipo salvaje se infectaron con el virus de la gripe A en los títulos indicados y la supervivencia subsiguiente se controló diariamente, n: 10 por grupo. b, una curva dosis-respuesta del título viral (log10) frente a las tasas de supervivencia con un ajuste no lineal de R2 = 0,926. c, Una tabla que indica las tasas de supervivencia a varias dosis de inoculación del virus de la influenza A, con el % de letalidad estimado determinado por el análisis de regresión Probit (Soluciones estadísticas de productos y servicios). d, Advillin-CreeR; Los ratones flox-Ptger3 (rojos, previamente inyectados con tamoxifeno) o ratones flox-Ptger3 (negros) indicados fueron infectados con dosis subletales del virus de la influenza A (arriba: 105 EID50 o LD21, abajo: 105,5 EID50 o LD39) y monitoreados diariamente como se indica , media ± sem, n: 6 ratones por grupo, ***p < 0,0005 mediante la prueba t no pareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para el análisis de comportamiento/fisiología, *p < 0,05, ns: no significativo por un logaritmo -Prueba de rango (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. valores p de izquierda a derecha en d, arriba: <0,0001, <0,0001, 0,0002, <0,0001, 0,4788; abajo: <0.0001, <0.0001, 0.0004, 0.0004, 0.0078.

Datos fuente

a, Caricatura que representa la inyección bilateral de AAV-Cre en los ganglios NJP de ratones flox-Ptger3. b, Los ganglios NJP de ratones flox-Ptger3 se inyectaron bilateralmente con AAV-Cre (abajo) o solución salina (control, arriba), y las criosecciones de los ganglios NJP se examinaron posteriormente mediante hibridación in situ de ARN de dos colores para detectar Phox2b (verde) y Ptger3 (rojo), barra de escala: 100 μm. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes. Parte a creada con BioRender.com.

Phox2b-Cre; Se infectaron ratones flox-Ptger3 (rojo) o ratones flox-Ptger3 (negro) con dosis subletales del virus de la influenza A (arriba: 105 EID50 o LD21, abajo: 105,5 EID50 o LD39) y se monitorearon diariamente como se indica, media ± sem, n : 6 ratones por grupo, **p < 0,005, ***p < 0,0005 mediante la prueba t no pareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para el análisis de comportamiento/fisiología, *p < 0,05, ns: no significativo por un logaritmo -Prueba de rango (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. valores p de arriba a abajo a la izquierda: <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,4524; derecha: <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,0155.

Datos fuente

a, Cambios en la ingesta de agua después de la infección por gripe en ratones de la Fig. 3, media ± sem, n: 8 (Piezo2-ires-Cre), 6-8 (Phox2b-Cre; 8 control y 6 Phox2b-Cre), 6 (Pdyn -ires-Cre), 6 (Oxtr-ires-Cre) y 10 (Gabra1-ires-Cre) ratones por grupo, ***p < 0,0005, ns: no significativo mediante la prueba t no apareada de dos colas como se detalla en Fig. 1 para análisis de comportamiento/fisiología. b, Un diagrama de Proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP) derivado de datos transcriptómicos unicelulares publicados de ganglios sensoriales vagales y glosofaríngeos22 que indican la expresión de Trpv1 (sombreado rojo: escala logarítmica natural). c, Trpv1-ires-Cre; Ratones flox-Ptger3 (azul) o ratones flox-Ptger3 (negro) fueron infectados con el virus de la influenza A y monitoreados diariamente como se indica, media ± sem, n: 6 ratones por grupo, ns: no significativo por prueba t no apareada de dos colas como se detalla en la Fig. 1 para el análisis de comportamiento/fisiología, ns: no significativo mediante una prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para el análisis de supervivencia. valores de p de arriba a abajo en a: 0,9101, 0,0004, 0,0534, 0,9544, <0,0001 y c: 0,2485, 0,0705, 0,0888, 0,1801, 0,8412.

Datos fuente

a, los niveles de PGE2 en plasma (izquierda) y BALF (derecha) se midieron mediante ELISA en ratones indicados en varios puntos de tiempo después de la exposición al virus de la influenza A o al control PBS, media ± sem, n: 5 ratones por grupo, ns: no significativo por ANOVA de dos vías que involucra el análisis de grupos infectados por el virus de la influenza. b, análisis qPCR de los niveles de transcripción de nucleoproteína viral (NP) en el tracto respiratorio superior e inferior de flox-Ptger3 y Gabra1-ires-Cre; Ratones flox-Ptger3 después de la infección por el virus de la influenza, normalizados a Gapdh y controles no infectados, media ± sem, n: 5 ratones por grupo, ***p < 0,0005 por ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni con comparaciones realizadas entre rojo y curvas azules (estrellas azules) o curvas negras y verdes (estrellas verdes). c, los niveles de IFNγ, TNFα e IL-6 en BALF se midieron mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados después de la exposición al virus de la influenza A en flox-Ptger3 (negro) o Gabra1-ires-Cre; flox-Ptger3 (rojo), media ± sem, n: 3 ratones por grupo, ***p < 0,0005 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni con comparaciones realizadas entre curvas rojas y negras (estrellas rojas). Valores de p en a: 0.1591, 0.0662, b y c: <0.0001 para todas las estrellas indicadas.

Datos fuente

a, señales fluorescentes GFP nativas en preparaciones de montaje completo de ganglios NJP de Gabra1-ires-cre; lsl-L10 GFP, barra de escala: 200 μm. b, los ganglios NJP de ratones Gabra1-ires-Cre se inyectaron bilateralmente con AAV-flex-AP o AAV-flex-tdTomato dependiente de Cre y los axones se visualizaron en preparaciones fijas de tejido completo utilizando un sustrato colorimétrico de fosfatasa alcalina (dos filas superiores, imágenes de la izquierda en las dos filas inferiores) o inmunotinción tdTomato (dos imágenes de la derecha en las dos filas inferiores). Barras de escala (de izquierda a derecha) fila superior: 500, 1000, 1000 (recuadro: 250) μm; 2ª fila: 500, 1000, 500 μm; 3ª fila: 200, 50 μm; fila inferior: 200, 100 μm. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes que involucran GFP y tdTomato y dos experimentos independientes que involucran fosfatasa alcalina.

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Reimpresiones y permisos

Bin, NR., Prescott, SL, Horio, N. et al. Una vía sensorial de las vías respiratorias al cerebro media la enfermedad inducida por la influenza. Naturaleza 615, 660–667 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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Recibido: 13 Abril 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 08 marzo 2023

Fecha de emisión: 23 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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