Noticias

Oct 25, 2023

TREM2+ e intersticial

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1914 (2023) Citar este artículo

1262 Accesos

10 Altmetric

Detalles de métricas

Los mecanismos inmunopatológicos que impulsan el desarrollo de COVID-19 grave siguen estando poco definidos. Aquí, utilizamos un modelo de macaco rhesus de infección aguda por SARS-CoV-2 para delinear perturbaciones en el sistema inmunológico innato. El SARS-CoV-2 inicia una infiltración rápida de células dendríticas plasmocitoides en las vías respiratorias inferiores, acorde con la producción de IFNA, la activación de las células asesinas naturales y un aumento significativo de monocitos CD14-CD16+ en sangre. Para diseccionar la contribución de los subconjuntos de mieloides pulmonares a la inflamación de las vías respiratorias, generamos un conjunto de datos de scRNA-Seq longitudinal de células de las vías respiratorias y asignamos estos subconjuntos a las poblaciones correspondientes en el pulmón humano. La infección por SARS-CoV-2 provoca un rápido reclutamiento de dos subconjuntos de macrófagos: poblaciones CD163+MRC1- y TREM2+ que son la fuente predominante de citocinas inflamatorias. El tratamiento con baricitinib (Olumiant®), un inhibidor de JAK1/2, es efectivo para eliminar la entrada de macrófagos no alveolares, con una reducción de las citocinas inflamatorias. Este estudio delinea los principales subconjuntos de macrófagos pulmonares que provocan la inflamación de las vías respiratorias durante la infección por SARS-CoV-2.

La pandemia de COVID-19 comenzó con una serie de informes de brotes localizados de neumonía causados ​​por un nuevo coronavirus, el SARS-CoV-2, en Wuhan, China, en diciembre de 20191,2. A principios de 2023, ha habido más de 672 millones de infecciones documentadas y casi 7 millones de muertes atribuidas a las secuelas de COVID-19. El rápido desarrollo y disponibilidad de vacunas efectivas3,4,5 contra la infección por SARS-CoV-2 ha brindado el optimismo muy necesario de que las tasas de infección disminuirán y que es posible contener el virus a nivel de la población. A pesar de estos logros históricos, los esfuerzos continuos de investigación son esenciales para protegerse contra posibles variantes innovadoras, desarrollar terapias para los afectados mientras continúa el lanzamiento de la vacuna y prevenir o minimizar el impacto de futuros brotes virales. En este sentido, la investigación básica sobre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas al SARS-CoV-2 sigue siendo fundamental para informar los enfoques terapéuticos y de vacunas dirigidos a poner fin a la pandemia de COVID-19 o a disminuir la mortalidad.

Desde el surgimiento de la pandemia de COVID-19, la investigación sobre la virología, las respuestas inmunitarias y la patogenia de la infección por SARS-CoV-2 se ha acumulado a un ritmo sin precedentes, y han surgido numerosas hipótesis para explicar los mecanismos subyacentes de la COVID-19 grave. De estos, los conceptos que han acumulado más evidencia de apoyo son: (1) evasión o deterioro de las respuestas tempranas de interferón tipo I (IFN)6, (2) complicaciones vasculares derivadas de síndromes de hipercoagulabilidad7, y (3) perturbaciones de los granulocitos y mieloides. compartimentos en las vías respiratorias inferiores y la sangre que se manifiestan en la producción de citocinas inflamatorias8,9. Desde el punto de vista inmunológico, la enfermedad grave en pacientes con COVID-19 se ha asociado con un aumento generalizado de los niveles de mediadores inflamatorios (p. ej., CXCL10, IL-6 y TNFα) en plasma y líquido de lavado broncoalveolar (BAL) en lo que comúnmente se conoce como "tormenta de citocinas"10, y una expansión de macrófagos, neutrófilos y linfocitos en la vía aérea inferior8. A pesar de esta impresionante acumulación de datos, los eventos inmunológicos tempranos precisos y la infiltración de células inmunitarias que provocan la inflamación en las vías respiratorias inferiores siguen sin caracterizarse.

Los modelos de primates no humanos (NHP) de infección por SARS-CoV-2 (principalmente especies de macacos y monos verdes africanos (AGM)) han demostrado ser herramientas críticas, principalmente debido a la capacidad de examinar eventos tempranos después de la infección longitudinalmente y en tejidos no disponibles en la mayoría de los estudios humanos11. Los NHP respaldan altos niveles de replicación viral en las vías respiratorias superiores e inferiores12,13,14, comparten la distribución tisular de ACE2 y TMPRSS2 con humanos15 y han sido modelos preclínicos invaluables de vacunas16,17,18 y terapias19,20. Además, se ha demostrado que la COVID-19 de leve a moderada se recapitula en NHP11 infectados con SARS-CoV-2 que generalmente se resuelven entre 10 y 15 días después de la infección (dpi)11,20,21. Los estudios mecánicos de la infección por SARS-CoV-2 en NHP han utilizado una variedad de técnicas de alto rendimiento y han informado que (1) las respuestas de IFN tipo I se inducen de manera sólida en la sangre y en las vías respiratorias inferiores muy temprano después de la infección20,22, (2) niveles elevados las citoquinas proinflamatorias consistentes con la "tormenta de citoquinas" observada en humanos son detectables en plasma y BAL23, (3) patología vascular y expresión génica consistente con hipercoagulabilidad son evidentes en las vías respiratorias inferiores22, y (4) mayor producción de citoquinas inflamatorias por mieloide células de origen20,24.

En el estudio actual, utilizamos macacos rhesus (RM) infectados con SARS-CoV-2 para investigar los eventos inflamatorios tempranos que ocurren en la sangre y las vías respiratorias inferiores mediante citometría de flujo de alta dimensión, detección de citoquinas multianalito y ARN a granel y de una sola célula. -Seq (scRNA-Seq). Para diseccionar el papel de subconjuntos inmunes discretos dentro de la fracción mieloide en la inflamación impulsada por el SARS-CoV-2, utilizamos dos estrategias diferentes, empleando conjuntos de datos de referencia scRNA-Seq y bulk-RNA-Seq para clasificar las poblaciones de macrófagos/monocitos e identificar poblaciones análogas en conjuntos de datos de vías respiratorias humanas. Con este enfoque, identificamos los principales subconjuntos de macrófagos proinflamatorios que se expanden después de la infección por SARS-CoV-2 y son la fuente predominante de citocinas inflamatorias en las vías respiratorias. También observamos una inducción temprana de células dendríticas plasmocitoides (pDC) en sangre y en las vías respiratorias inferiores que coincidió con el pico de señalización de IFN. Finalmente, describimos que el tratamiento de los RM infectados con SARS-CoV-2 con baricitinib, un inhibidor de JAK1/2 que recientemente se demostró que reduce el tiempo de hospitalización y la mortalidad en pacientes graves con COVID-1925, suprimió la inflamación de las vías respiratorias al anular la infiltración de macrófagos proinflamatorios para el espacio alveolar. En conjunto, este estudio define la cinética temprana del reclutamiento de pDC y las respuestas de IFN tipo I, e identifica subconjuntos discretos de macrófagos infiltrantes como la fuente predominante de producción de citoquinas proinflamatorias en la infección por SARS-CoV-2.

En la figura 1a se muestra una descripción general del diseño del estudio. Analizamos tres cohortes separadas de macacos: Cohorte 1, tratados con Baricitinib y Cohorte 2. Para la Cohorte 1 y los tratados con Baricitinib, se inocularon un total de ocho RM (edad media 14 años; rango 11-17 años) por vía intranasal e intratraqueal. con 1,1 × 106 unidades formadoras de placa (PFU) de SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020). A los 2 ppp, cuatro de los ocho animales comenzaron a recibir baricitinib20. Para este estudio, los puntos de tiempo hiperagudos y de referencia previos a la infección (1–2 ppp) incluyen n = 8 RM, todos sin tratar, y los puntos de tiempo longitudinales restantes evaluados para determinar la patogenia de la infección por SARS-CoV-2 están compuestos por n = 4 de las RM que quedaron sin tratar. La inoculación con SARS-CoV-2 condujo a títulos virales reproduciblemente altos detectables en las vías respiratorias superiores e inferiores mediante ensayos de qPCR genómicos y subgenómicos (Fig. 1b). El pico de viremia en las fosas nasales, la garganta y el LBA fue de 2 a 4 ppp (fig. 1b). Para aumentar el poder de nuestros experimentos de citometría de flujo y scRNA-Seq, analizamos seis macacos adicionales infectados con la misma dosis y cepa de SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) (edad media 10,5 años). ; rango de 6 a 19,5 años), denominado Cohorte 2. Los animales de la Cohorte 2 sirvieron como controles no tratados infectados con SARS-CoV-2 en parte de un estudio más amplio que evaluó el impacto del bloqueo del interferón26.

un Diseño del estudio; Los RM se infectaron por vía intranasal e intratraqueal con SARS-CoV-2 y se rastrearon longitudinalmente (Cohorte 1: n = 4, cohorte de baricitnib: n = 4, Cohorte 2: n = 6). Baricitinib se administró diariamente a 4 RM (cohorte de baricitinib) a partir de 2 dpi. Los 4 RM de la Cohorte 1 y los 6 RM de la Cohorte 2 no recibieron tratamiento. (Creado con BioRender.com). b Después de la inoculación con SARS-CoV-2, se recolectaron lavados nasales, faríngeos y broncoalveolares (BAL) y se cuantificaron las cargas virales mediante qRT-PCR para gRNA total y sgRNA. c Niveles longitudinales de monocitos dentro del BAL y sangre representados como % de células CD45+. valores de p: CD14−CD16+ Monocitos Sangre: 1 dpi vs −5 dpi = 0,03 y 2 dpi vs −5 dpi = 0,004; CD14+CD16+ Monocitos Sangre 2 dpi vs. −5 dpi = 0,004. d Niveles longitudinales de células dendríticas plasmocitoides (pDC) dentro del BAL y sangre representados como un porcentaje de células CD45+. Valor de p para pDC Sangre 2 dpi vs. −5 dpi = 0,02. e Niveles longitudinales de células NK que expresan granzima B en BAL y sangre. Valores de p para células Granzima B+ NK 2 ppp frente a -5 ppp BAL = 0,01 y sangre = 0,008. n = 8 RM de la cohorte 1 y la cohorte de baricitinib. Las barras rojas representan la media. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una cola en Graphpad Prism v7.02 comparando cada punto de tiempo con −5 ppp. *valor de p <0,05, **valor de p <0,01. Los datos de origen (b–e) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para caracterizar la respuesta inmune innata después de la infección por SARS-CoV-2, analizamos los cambios en las poblaciones innatas mediante citometría de flujo multiparamétrica en muestras de sangre y BAL en los primeros 2 dpi, o fase "hiperaguda" de infección (Fig. 1c-e y Fig. 1 complementaria), y durante todo el curso de la infección (Fig. 2 complementaria). En sangre, no observamos un aumento significativo en la proporción de monocitos clásicos (CD14 + CD16−) a 2 ppp (Fig. 1c) ni en puntos de tiempo extendidos (Fig. 2a, d complementaria). De manera similar a los informes en humanos 9, observamos un aumento rápido, pero transitorio, en los monocitos CD14-CD16 + y CD14 + CD16 + en sangre (Fig. 1c y Fig. 2a, d complementarias). Usando estos marcadores convencionales para subconjuntos de monocitos sanguíneos, no observamos cambios significativos en CD14-CD16+, CD14+CD16+, ni CD14-CD16+ dentro del BAL (Fig. 1c y Fig. 2a complementaria).

Observamos un nivel significativamente elevado de pDC en sangre a 2 ppp y, de manera similar, una tendencia de pDC elevados en muestras de BAL (Fig. 1d y Fig. 2c, f complementarias). Esta expansión fue transitoria, ya que los números de pDC volvieron a la línea de base en 4 ppp. Si bien las frecuencias generales de las células asesinas naturales (NK) no cambiaron en la sangre o el BAL (Fig. 2b, e complementarias), la fracción y el número absoluto de células Granzyme B + NK aumentaron significativamente a los 2 ppp en la sangre, de 4 a 25 % (Fig. 1e) y permaneció elevado durante todo el curso de la infección (Fig. 2b, e complementarias). De manera similar, también se observaron aumentos en la activación de las células NK en el BAL, pasando del 12 al 33 % a los 2 ppp (Fig. 1e) y persistiendo en este nivel hasta la terminación del estudio a los 10/11 ppp (Fig. 2b, e suplementarias). ). En conjunto, estos datos indican que durante la fase hiperaguda de la infección por SARS-CoV-2, hay una movilización significativa de células inmunitarias innatas capaces de iniciar y orquestar respuestas efectoras del sistema IFN tipo I.

Para comprender el alcance de las perturbaciones inmunológicas inducidas por la infección por SARS-CoV-2, realizamos un extenso perfil de expresión génica de muestras de PBMC y BAL. Durante la fase hiperaguda, el LBA tuvo una inducción generalizada de vías asociadas con la inmunidad innata y la inflamación (Fig. 2a). En particular, observamos una inducción rápida y robusta de genes estimulados por interferón (ISG) en los compartimentos PBMC y BAL a partir de 1 o 2 ppp (Fig. 2b y Fig. 3a complementaria). La respuesta ISG, aunque generalizada, había regresado en gran medida a la línea de base en 10/11 ppp (Fig. 2b y Fig. 3a complementaria). También detectamos una tendencia de proteína IFNα elevada en 4/6 y 5/8 animales en BAL y plasma, respectivamente (Fig. 2c, d) y un aumento significativo en el mapeo de recuentos de lectura de RNA-Seq en genes IFNA a 2 dpi en BAL (Fig. 2e), que coincidió con la expansión de pDC en las vías respiratorias y la sangre (Fig. 1d). Se observó un enriquecimiento significativo de genes que representan la citotoxicidad de las células NK (Fig. 2a) a 2 ppp en BAL, de acuerdo con nuestra observación de células Granzyme B + NK elevadas por citometría de flujo (Fig. 1e). En conjunto, estos datos demuestran la presencia de células primarias capaces de producir IFN tipo I (es decir, pDC), coincidentes con transcritos y proteínas detectables de IFNA, y con funciones efectoras inducidas por IFN corriente abajo (ISG, activación de células NK) después de SAR-CoV -2, y que estas respuestas fueron transitorias, habiendo disminuido en gran medida en 10/11 dpi.

n = 8 RM de la Cohorte 1 y la cohorte de baricitinib para −5 dpi y 2 dpi excepto para (c) donde n = 6 (3 RM de la Cohorte 1 + 3 RM de la cohorte de baricitinib) a los 2 dpi. n = 4 RM de la Cohorte 1 a partir de 4 ppp. a Gráficos de puntos que muestran puntajes de enriquecimiento normalizados y valores p nominales para conjuntos de genes. El enriquecimiento se indica mediante el color del punto (rojo: enriquecido positivamente frente a −5 ppp; azul: enriquecido negativamente), el tamaño del punto indica la importancia. Las puntuaciones de enriquecimiento normalizadas y los valores p nominales se determinaron utilizando GSEA65. Los valores de p nominales exactos se incluyen en los Datos complementarios 1. b Mapa de calor de las respuestas longitudinales para el conjunto de genes ISG. La escala de colores indica la expresión de log2 en relación con la mediana de las muestras de −5 ppp. c Evaluación de citocinas (Mesoescala) en valores p de BALF para 2 dpi vs −5 dpi: IL6 = 0,02 e IP-10 = 0,03 y d Plasma; solo se muestran las citocinas significativas (valores de p para 2 ppp frente a -5 ppp: IP-10 = 0,008, MCP-1 = 0,008, MCP-2 = 0,004). e Suma de la expresión normalizada de todos los genes IFNA en BAL. *valor p = 0,04. f Gráfico de enriquecimiento de GSEA que muestra un enriquecimiento negativo para la firma del gen AM (derivado de SingleR) al comparar muestras de RNA-Seq de BAL a granel de 4 ppp a −5 ppp (valor de p nominal = 0). La barra roja representa la media. El análisis estadístico para (c)–(e) se realizó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una cola en R v4.2.2 comparando cada punto de tiempo con −5 ppp. *valor de p <0,05, **valor de p <0,01. Los datos de origen (c–e) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Observamos que la infección por SARS-CoV-2 indujo un enriquecimiento significativo de varias vías de señalización de citoquinas inflamatorias, a saber, IFNA, IL4, IL6, IL10, IL12, IL23 y TNF, y las vías de quimioquinas CXCR4 y CXCR3, tanto en PBMC como en BAL de RM. con mayor magnitud en el BAL (Fig. 2a y Datos complementarios 1-3). Para muchas de estas vías, pudimos cuantificar aumentos significativos en el regulador corriente arriba a nivel de proteína, ARNm o ambos: los niveles de proteína IL6 aumentaron significativamente en el líquido BAL (BALF) (Fig. 2c), al igual que Transcripciones de ARN en BAL (Fig. 3b complementaria). De manera similar, la inducción de la señalización de las vías CXCR3 fue consistente con la detección de un aumento de la proteína IP10 / CXCL10 en BALF y ARN a 2 ppp en BAL (Fig. 2c y Fig. 3b complementaria). La aparición de vías inflamatorias en la sangre y las vías respiratorias se ha informado en una multitud de estudios en humanos (revisado en la ref. 27). Sin embargo, notamos que la infección por SARS-CoV-2 también impulsó la expresión temprana de varias vías inmunorreguladoras/inmunosupresoras en el LBA, a saber: señalización de PD1 y CTLA4, y reguladores negativos de MAP quinasa y señalización de DDX58/RIG-I (Fig. 2a) . Anteriormente, informamos que la fracción mieloide en BAL era la principal responsable de la producción de mediadores proinflamatorios, sin embargo, no se definieron los inmunofenotipos específicos. Para investigar más a fondo la presencia de diferentes subconjuntos de macrófagos dentro de las vías respiratorias inferiores después de la infección por SARS-CoV-2, realizamos GSEA en datos de BAL a granel utilizando la firma del gen AM (obtenida de SingleR28) específica para macrófagos pulmonares RM. Observamos que los genes específicos para los macrófagos alveolares (AM) se enriquecieron significativamente al inicio (-5 dpi) en relación con 4 dpi, lo que indica una regulación a la baja de este conjunto de genes después de la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 2f). En conjunto, estos datos masivos de RNA-Seq indican un cambio rápido y significativo en el equilibrio de las poblaciones de macrófagos en las vías respiratorias inferiores después de la infección por SARS-CoV-2.

En nuestro trabajo anterior en RM, demostramos que las células de origen mieloide eran el subconjunto predominante responsable de la producción de citoquinas inflamatorias en las vías respiratorias inferiores después de la infección por SARS-CoV-220. Si bien nuestros análisis anteriores de scRNA-Seq determinaron que la mayoría de las células en el LBA después de la infección eran de origen monocito/macrófago, con relativamente pocos neutrófilos o granulocitos, los inmunofenotipos precisos de las células mieloides que provocan la inflamación en las vías respiratorias inferiores no se han delineado con precisión. .

La clasificación celular basada en genes marcadores de la superficie celular suele ser problemática en los datos de scRNA-Seq debido a las pérdidas de genes inherentes a la tecnología. La clasificación precisa se complica aún más en el sistema modelo rhesus, en el que las referencias genómicas tienen una anotación incompleta y es posible que los marcadores de otras especies modelo no se copien. Recientemente se han realizado varios avances significativos para dilucidar los subconjuntos de macrófagos tisulares residentes en el pulmón y su función durante la infección viral y la inflamación29,30,31,32. Sin embargo, el análisis de los datos de scRNA-Seq de suspensiones pulmonares RM y BAL durante la condición de estado estacionario indicó que varios marcadores clave utilizados para diferenciar macrófagos en el pulmón murino (p. ej., Lyve1) no se expresaron en niveles suficientes para distinguir poblaciones en el mieloide pulmonar rhesus. poblaciones (Fig. 7 complementaria). Por lo tanto, utilizamos dos estrategias alternativas superpuestas para clasificar con precisión los macrófagos tisulares y los macrófagos infiltrantes/derivados de monocitos en las vías respiratorias de RM después de la infección por SARS-CoV-2 en nuestros datos de scRNA-Seq. La primera estrategia se basó en el uso de datos existentes de scRNA-Seq de pulmón de RM no infectados como referencia para mapear y anotar las células BAL. Procesamos datos de pulmón 10X de tres RM no infectados (NCBI GEO: GSE149758)33 a través de la tubería de Seurat34 y reproducimos los cuatro subconjuntos de macrófagos/monocitos informados: CD163+MRC1+, que se asemejan a los macrófagos alveolares; macrófagos CD163+MRC1+TREM2+, similares a los monocitos infiltrantes; CD163+MRC1−, similar a los macrófagos intersticiales; y monocitos no clásicos CD16+ (Fig. 4a-d complementaria). Usamos Seurat para mapear macrófagos/monocitos de BAL de RM infectados con SARS-CoV-2 y transferir anotaciones de la referencia de pulmón. La segunda estrategia involucró el uso de RNA-Seq a granel en AM e IM clasificados de los pulmones de tres RM no infectados35, de acuerdo con el fenotipo definido por Cai et al.36, basado en la expresión de CD206/MRC1 y CD163, para anotar células usando SingleR28 Supplementary Fig. 4e, f). En total, se encontró que 2069 genes se expresaban diferencialmente entre IM y AM (FDR <0.05, cambio de pliegue> 2) (Fig. 4e complementaria). Es de destacar que CX3CR1 se reguló positivamente en los IM, de acuerdo con las definiciones murinas y humanas de este subconjunto (Fig. 4f complementaria). APOBEC3A, una citidina desaminasa que edita ARN, también se reguló positivamente en MI junto con PTGS2, una enzima ciclooxigenasa COX-2 proinflamatoria, TIMP1, que permite la migración de células a través de la descomposición del tejido conectivo, VCAN, un regulador inmunosupresor y PDE4B , que regula la expresión de TNFα (Fig. 4f complementaria). Anotamos los subconjuntos de macrófagos/monocitos de pulmón utilizando los conjuntos de datos AM e IM ordenados a granel y descubrimos que casi todo el grupo CD163 + MRC1 + y algunas células CD163 + MRC1 + TREM2 + se anotaron como AM y el resto como IM (Fig. 4g complementaria). Por lo tanto, la evaluación comparativa de nuestra referencia basada en scRNA-Seq de pulmón con firmas transcriptómicas masivas rudimentarias demostró su precisión en la resolución del fenotipo AM de no AM en condiciones de estado estable.

A continuación, analizamos los cambios en las poblaciones mieloides dentro del BAL de RM después de la infección por SARS-CoV-2 aplicando estas firmas a dos conjuntos de datos independientes de scRNA-Seq de macacos rhesus infectados por vía intranasal e intratraqueal con 1,1 × 106 PFU de USA-WA1/2020 cepa de SARS-CoV-2: Cohorte 1, compuesta por un conjunto de datos de n = 3 (línea de base y 4 ppp)20 y Cohorte 2, compuesta por n = 5 (línea de base) y n = 6 (4 ppp)26. Usando la referencia de pulmón/scRNA-Seq, encontramos que la mayoría de los macrófagos/monocitos del BAL pertenecían al subconjunto de macrófagos CD163+MRC1+ similar a AM a −5 dpi junto con algunas células del subconjunto de macrófagos CD163+MRC1+TREM2+ (Fig. 3a, b y Fig. 5a complementaria). A los 4 ppp, hubo una afluencia tanto de macrófagos CD163+MRC1+TREM2+ como de macrófagos CD163+MRC1− similares a IM con pocas células anotadas como monocitos no clásicos CD16+. La expresión de marcadores genéticos como MARCO, FABP4 y CHIT1 apoyó aún más las anotaciones de subconjuntos de células (Fig. 3c). También observamos un aumento similar en APOBEC3A y disminuciones en la expresión de genes MARCO y CHIT1 asociados a macrófagos alveolares en muestras de BAL analizadas por RNA-Seq a granel, lo que indica una pérdida de células CD163+MRC1+ (Fig. 3d). Al analizar los conjuntos de datos de sc-RNA-Seq, el porcentaje total de macrófagos CD163+MRC1+ al inicio en comparación con 4 ppp se redujo del 93,3 % al 55 % y del 89,3 % al 63,1 % de todos los macrófagos/monocitos en el LBA en las cohortes 1 y 2 , respectivamente (Fig. 3e, f). Las estimaciones de frecuencias celulares en conjuntos de datos agrupados de scRNA-Seq pueden basarse en recuentos de células desequilibrados de muestras individuales. Para dar cuenta de este sesgo potencial, examinamos los cambios en las poblaciones mieloides por animales individuales. Observamos que en la Cohorte 1, las células CD163+MRC+ disminuyeron de una media de 90,2 % (sd = 5,2 %) a una media de 65,4 % (sd = 32 %), p = ns, y en la Cohorte 2, disminuyeron significativamente de una media de 92 % (sd = 5,1%) a media 65,7% (sd = 16,4%) p = 0,0087 (Fig. 3g, h). Por el contrario, vimos un aumento general en el porcentaje de macrófagos CD163+MRC1+TREM2+ del 6,5 al 36,8 % (Cohorte 1) y del 10,3 al 19,8 % (Cohorte 2) (Fig. 3e, f). A nivel individual, observamos que los niveles de células CD163+MRC1+TREM2+ aumentaron de una media del 9,7 % (sd = 5,3 %) a una media del 28,6 % (sd = 25,2 %) en la Cohorte 1 (p = ns), y una media del 7,7 % (sd = 4,9%) a una media de 20,0% (sd = 10,4%) (p = 0,03) (Fig. 3g, h). Además, observamos aumentos en los macrófagos CD163+MRC1− similares a IM: en los datos agrupados de scRNA-Seq de 0,2 a 8 % en la Cohorte 1 y de 0,4 a 17 % en la Cohorte 2 (Fig. 3e, f). Considerando animales individuales, las células CD163+MRC1- aumentaron de una media de 0,15 % (sd = 0,19 %) a una media de 5,9 % (sd = 6,9 %) en la Cohorte 1 y significativamente de una media de 0,28 % (sd = 0,18 %) a una media de 14,2 %. (dt = 9,1%) (p = 0,004) (Fig. 3g, h). Por lo tanto, la infección por SARS-CoV-2 resultó en una afluencia de macrófagos similares a IM y derivados de monocitos en BAL a 4 ppp.

a Proyección de macrófagos/monocitos unicelulares de muestras de BAL 10X de −5 ppp (verde) y 4 ppp (magenta) obtenidas de tres macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 (Cohorte 1) en el UMAP de referencia de macrófagos/monocitos de pulmón de macacos rhesus no infectados (NCBI GEO: GSE14975833). b Proyecciones UMAP que muestran las anotaciones de tipos de células predichas basadas en la referencia de pulmón no infectado dividida por el momento de la recolección de la muestra (cohorte 1). c Diagramas de puntos que muestran la expresión de genes marcadores para los diferentes subconjuntos de macrófagos/monocitos en muestras de LBA infectadas con SARS-CoV-2 (cohorte 1). d Log2 veces los cambios en comparación con −5 ppp para APOBEC3A, CHIT1 y MARCO en datos de RNA-Seq de BAL a granel (cohorte 1). La importancia se determinó utilizando DESeq2. Se utilizaron los valores de p corregidos por el método predeterminado de Benjamini y Hochberg *valor de p adj <0,05, ***valor de p adj <0,001. Los valores de p exactos se incluyen en los Datos complementarios 2. Porcentaje de un subconjunto determinado de todos los subconjuntos de macrófagos/monocitos a -5 ppp y 4 ppp de los tres animales agrupados (cohorte 1) (e) y a -7 ppp y 4 ppp de los seis animales agrupados (cohorte 2) (f). Porcentaje de un subconjunto dado de todos los subconjuntos de macrófagos/monocitos para cada animal a −5 dpi y 4 dpi de la cohorte 1 (n = 3) (g) y a −7 dpi (n = 5) y 4 dpi (n = 6 ) para la cohorte 2 (h). Las líneas negras indican la mediana. Valores de p para la cohorte 2 (f) para 4 ppp frente a −7 ppp: CD163+MRC1+ = 0,009, CD163+MRC1+TREM2+ = 0,03 y CD163+MRC1− = 0,004. Contribución de cada subconjunto de macrófagos/monocitos hacia la producción de genes proinflamatorios e ISG: grupo 1 de cohorte (i), grupo 2 de cohorte (j), individuo de cohorte 1 (k) y individuo de cohorte 2 (l). Valores de p para (l): * = 0,03. La contribución porcentual se calculó dividiendo la suma de la expresión normalizada de un gen dado en un subconjunto de macrófagos/monocitos por la suma de la expresión normalizada del gen en todos los subconjuntos de macrófagos/monocitos. a–c, e, g, i, k Cohorte 1: n = 3 para −5 ppp y 4 ppp, d Cohorte 1: n = 8 para 2 ppp y n = 4 para 4 ppp, f, h, j, l Cohorte 2: n = 5 para −7 ppp y n = 6 para 4 ppp. Las líneas negras indican la mediana. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de rangos unidos de Wilcoxon de dos colas para (g, k, l) y la prueba U de Mann-Whitney de dos colas para (h) en R v4.2.2. *valor de p <0,05, **valor de p <0,01. Los datos de origen (d–l) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para validar aún más nuestra clasificación celular y respaldar la observación de que son las células infiltrantes las que aumentan en número y producen predominantemente mediadores inflamatorios, usamos la segunda estrategia de usar la expresión génica de células AM e IM clasificadas a granel para clasificar los macrófagos / monocitos BAL. Usando esta definición, confirmamos que hay un aumento en el porcentaje de población que no es AM con una disminución correspondiente en la población AM (Figura complementaria 5b, d). También se encontró que la población no AM mostraba una mayor expresión de citocinas proinflamatorias (Fig. 5e complementaria).

El análisis de expresión diferencial de macrófagos/monocitos de BAL de 4 dpi y -5 dpi mostró que CHIT1, MARCO y MRC1 se encontraban entre los genes de mayor rango que mostraban regulación a la baja en el BAL, mientras que genes como ADAMDEC137 y S100A838 que están asociados con macrófagos derivados de monocitos fueron entre los más regulados (Datos complementarios 4). Estos datos demuestran que nuestra observación de una afluencia de macrófagos infiltrados en el BAL a los 4 ppp fue consistente en múltiples definiciones de este fenotipo.

Dada nuestra observación de la dinámica de los macrófagos pulmonares dentro del espacio alveolar durante la infección temprana por SARS-CoV-2, caracterizamos los cambios transcripcionales en cada población de macrófagos/monocitos (Fig. 3), y también en las células dendríticas mieloides convencionales. Las DC mieloides estaban presentes a muy bajas frecuencias (<2 %), y no se detectaron más de 70 células en total que albergaban ARNm de TNF, IL6 o IL10 después de la infección. La expresión de IL1B fue ligeramente mayor, pero representó <2.5% de las células que expresan IL1B en el BAL a 4 ppp (Fig. 6a-e complementaria). Varias quimiocinas (CCL4L1, CCL3, CXCL3, CCL2), múltiples ISG, NFKB1A, S100A8 y GZMB se encontraban entre los genes más regulados a 4 ppp en poblaciones de BAL (Datos complementarios 4). Se observó una expresión elevada de múltiples genes inflamatorios, incluidos IL6, TNF, IL10 e IL1B, en los subconjuntos CD163+MRC1+TREM2 Mac y CD163+MRC1− en las Cohortes 1 y 2 (Fig. 3i–l y Fig. 7 complementaria). ) después de la infección. También se observó que los macrófagos infiltrados regulan al alza múltiples quimiocinas, incluidas las específicas para reclutar neutrófilos (CXCL3, CXCL8), macrófagos (CCL2, CCL3, CCL5, CCL4L1) y células T activadas (CXCL10), así como múltiples ISG (Figs. 7 y 8). Cuando examinamos los macrófagos CD163+MRC1+, muchas de las mismas citocinas inflamatorias y conjuntos de genes observados en los macrófagos infiltrados se elevaron a 4 ppp, aunque en una magnitud mucho menor (Figs. 7 y 8 complementarias). Habiendo observado una expresión promedio significativamente más alta de citocinas inflamatorias en macrófagos infiltrantes en comparación con macrófagos CD163+MRC1+, comparamos las fracciones de lecturas de secuenciación detectadas de cada uno de los subconjuntos para evaluar la contribución general a la producción de citocinas inflamatorias (Fig. 3i). En la Cohorte 1, a los 4 ppp, observamos que los macrófagos CD163+MRC1+TREM2+ representaban el 55 % de la expresión de IL6, el 57 % de TNF y el 86 % de la expresión de IL10, mientras que los macrófagos CD163+MRC1− representaban el 20 % de IL6, 21% de TNF y 6% de expresión de IL10 (Fig. 3i). En la Cohorte 2, también observamos que los macrófagos infiltrantes contribuyeron más a la expresión de la mayoría de las citocinas inflamatorias que los macrófagos alveolares: la expresión en células CD163+MRC1+TREM2+ y CD163+MRC1− fue del 39,2% y del 47% para IL10, 17,4% y 74,9% para IL6 y 22,4% y 46,6% para TNF, respectivamente (fig. 3j). Para tener en cuenta el posible sesgo en los recuentos de células en nuestros datos agrupados, también examinamos las contribuciones de las citoquinas a la expresión de BAL en animales individuales (Fig. 3k, l). En la Cohorte 1, la tendencia general de mayor contribución a la expresión inflamatoria en las poblaciones de macrófagos infiltrantes que se observa en los datos agrupados solo se observó para IL10 y CCL4L1, en gran parte debido a los desequilibrios en los recuentos de células y el bajo poder estadístico (Fig. 3k). Sin embargo, en la Cohorte 2, observamos niveles constantemente elevados en las poblaciones de macrófagos CD163+MRC1+TREM2+ y CD163+MRC1− infiltrantes (Fig. 3l). Para IL10, la expresión media ± sd en CD163+MRC1+ fue de 17,3 ± 12,4 %, en comparación con 40,4 ± 12,1 % en células CD163+MRC1+TREM2+ (p = 0,03) y 42,3 ± 21,2 % para CD163+MRC1− (ns) ( Figura 3l). Para IL6, la expresión media ± sd en CD163+MRC1+ fue de 9,4 ± 12,2 %, en comparación con 12,2 ± 24,5 % en células CD163+MRC1+TREM2+ (ns) y 78,4 ± 28,8 % para CD163+MRC1− (p = 0,065). Además, aunque nuestra observación de IL6 tendió a ser significativa, encontramos una amplia variabilidad en los porcentajes en las células CD163+MRC1−; Para abordar esto, analizamos otro conjunto de datos26 en el que obtuvimos la expresión de scRNA-Seq del macrófago BAL después de 2 ppp de infección por SARS-CoV-2; estos datos también tendieron a una expresión mucho mayor de IL6 en las células CD163+MRC1− ( 67,1 ± 32,4 %) en comparación con los macrófagos CD163+MRC1+ (27,7 ± 29,5 %) (Fig. 9 complementaria). Para CCL4L1, CD163+MRC1+ contribuyó con el 9,6 ± 6,3 % de la expresión, en comparación con el 23,7 ± 13,5 % de las células CD163+MRC1+TREM2+ (p = 0,03) y el 66,7 ± 18,2 % de las células CD163+MRC1− (p = 0,03). La contribución de diferentes subconjuntos a la expresión de CXCL10 fue del 19,2 ± 16,7 % de las poblaciones de CD163+MRC1+ en comparación con el 15,3 ± 9,3 % de las poblaciones de CD163+MRC1+TREM2+ y el 65,4 ± 15,2 % de las poblaciones de CD163+MRC1−. En general, estos datos indican que las poblaciones de macrófagos infiltrantes son responsables de la mayor parte de la producción de citocinas inflamatorias de las vías respiratorias inferiores durante la infección aguda por SARS-CoV-2.

Para validar el aumento de las poblaciones mieloides infiltrantes, cuantificamos mediante citometría de flujo la frecuencia de las poblaciones mieloides CCR2+ en sangre periférica y BAL de seis macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 adicionales (Fig. 10 complementaria). Se ha demostrado que CCR2 regula la infiltración de monocitos en el parénquima pulmonar de ratones infectados con SARS-CoV-239 y su expresión aumenta en el BAL de macrófagos infiltrantes en NHP infectados con el virus de la influenza35. De acuerdo con nuestra observación de células mieloides infiltrantes elevadas por scRNA-Seq, encontramos que hubo un aumento concomitante en la frecuencia de monocitos CCR2+ CD14-CD16+ y CD14+CD16+ a 2 ppp. Estos resultados respaldan aún más la infiltración de monocitos inflamatorios en BAL después de la infección por SARS-CoV-2.

Para traducir nuestros hallazgos en el modelo NHP a la infección humana por SARS-CoV-2, utilizamos un enfoque bioinformático similar al empleado para definir el mieloide rhesus. Utilizamos macrófagos/monocitos del conjunto de datos de scRNA-Seq disponible públicamente de pulmones de seis donantes humanos sanos (GEO: GSE13589340) y los clasificamos según una clasificación reciente en FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi y macrófagos en proliferación41 (Fig. 4a). Cuando se compararon los genes marcadores canónicos entre los macrófagos/monocitos pulmonares sanos de humanos y macacos rhesus, encontramos que había poblaciones comparables entre los dos (Fig. 4a-c). Es decir, el subconjunto rhesus CD163+MRC1+ era muy similar al subconjunto humano FABP4hi; el subconjunto CD163+MRC1+TREM2+ rhesus era congruente con el subconjunto humano SPP1hi; y los macrófagos CD163+MRC1− y los monocitos CD16+ rhesus fueron transcripcionalmente similares al subconjunto humano FCN1hi. A continuación, combinamos los datos de todas las células de macrófagos/monocitos de las seis muestras humanas sanas con las tres muestras de rhesus sanos y aplicamos la integración basada en referencias en Seurat usando las muestras humanas como referencia (Fig. 11a, b complementarias). Observamos la distribución de diferentes tipos de células humanas y rhesus en cada grupo y descubrimos que las observaciones anteriores con respecto a la similitud de los subconjuntos basados ​​​​en marcadores canónicos fueron respaldadas por la expresión génica global de estas células (Fig. 11c complementaria). Finalmente, para probar la solidez de nuestras clasificaciones celulares para identificar con precisión subconjuntos de macrófagos entre especies, generamos firmas genéticas para cada combinación de subconjunto/especie y probamos el enriquecimiento en las especies opuestas; para todas las comparaciones, una firma obtuvo la puntuación más alta con su correspondiente subconjunto opuesto (Figura complementaria 11d).

un UMAP de subconjuntos de macrófagos en pulmones de seis donantes humanos sanos (GEO: GSE135893). b UMAP de subconjuntos de macrófagos en pulmones de tres macacos rhesus sanos (GEO: GSE149758). c Diagramas de puntos que muestran la expresión de genes marcadores. El gradiente de color representa el nivel de expresión y el tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan un gen determinado. d UMAP de muestras de LBA de donantes humanos que están sanos (n = 3) o que padecen COVID-19 moderado (n = 3) o grave (n = 6) (GEO: GSE145926) asignados a la referencia de pulmón sano utilizando Seurat Función MapQuery. e Porcentaje de tipos de células pronosticados de todos los macrófagos/monocitos en cada muestra de BAL humano. La barra negra indica la mediana. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos colas por pares en R v4.2.2. valor de p* = 0,02. Contribución de cada subconjunto predicho de macrófagos/monocitos en el BAL humano hacia la producción de genes proinflamatorios e ISG: agrupados (f) e individuales (g). La contribución porcentual se calculó dividiendo la suma de la expresión normalizada de un gen dado en un subconjunto de macrófagos/monocitos por la suma de la expresión normalizada del gen en todos los subconjuntos de macrófagos/monocitos. Las barras negras representan la mediana. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos colas en R v4.2.2. *valor de p 0,03 para todos excepto FABP4 frente a proliferación para IL6, IL1B, TNF, CXCL3, CXCL8 y SPP1hi frente a proliferación para CCR2: valor de p = 0,04. Los datos de origen (e–g) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Utilizando el conjunto de datos de humanos sanos como referencia, clasificamos los macrófagos/monocitos del grupo mieloide (Fig. 11e, f complementaria) en un conjunto de datos de scRNA-Seq disponible públicamente de muestras de BAL humano de donantes sanos o sujetos con infección por COVID-19 moderada o grave8 (Fig. 4d y Fig. 11g complementaria). Como se informó en el estudio original8, encontramos que hubo un aumento significativo en los subconjuntos SPP1hi y FCN1hi con infección por COVID-19, mientras que se encontró que la población FABP4hi que es en gran medida representativa de los macrófagos alveolares residentes se redujo significativamente en ambos casos. Infección por COVID-19 (Fig. 4d, e). Además, también analizamos la contribución de estas diferentes poblaciones a la inflamación y descubrimos que los subconjuntos SPP1hi y FCN1hi no residentes eran en gran parte responsables de la expresión de mediadores proinflamatorios en pacientes con COVID-19 grave (Fig. 4f y Suplementario). Figura 12). Respectivamente, (FABP4hi, SPP1hi y FCN1hi) la contribución de cada población a la expresión global fue: IL10 (1,3 %, 56,7 %, 42 %), IL1B (6,6 %, 37 %, 56 %), IL6 (2,4 %, 40,8 %). %, 56,7 %), TNF (1,6 %, 44,1 %, 54,1 %), CXCL10 (1,8 %, 36,5 %, 61,7 %) y CXCL8 (2,6 %, 48,1 %, 49,1 %) (fig. 4f). Es de destacar que la expresión de ISG (IFI27, ISG15, ISG20, MX2) aumentó significativamente en las poblaciones SPP1hi y FCN1hi en relación con FABP4hi en la enfermedad grave, pero no en los casos moderados. Por último, cuando examinamos la contribución de la expresión de citoquinas en pacientes individuales en este conjunto de datos, notamos que para COVID-19 grave, observamos que las poblaciones infiltrantes tenían una expresión significativamente mayor de IL10 (media ± sd SPP1hi 50.9 ± 8.7%, p = 0,03; FCN1hi 46,9 ± 8,3 %, p = 0,03), IL1B (media ± sd SPP1hi 31,7 ± 14,9 %, p = 0,03; FCN1hi 63,3 ± 20,1 %, p = 0,03), TNF (media ± sd SPP1hi 43,4 ± 9,3 % , p = 0,03; FCN1hi 53,7 ± 13,7 %, p = 0,03), CXCL10 (media ± sd SPP1hi 27,3 ± 9,5 %, p = 0,03; FCN1hi 69,8 ± 11,1 %, p = 0,03), CXCL3 (media ± sd SPP1hi 55,9 ± 9,6 %, p = 0,03; FCN1hi 37,6 ± 13 %, p = 0,06) y CXCL8 (media ± sd SPP1hi 42,7 ± 14 %, p = 0,03; FCN1hi 53,4 ± 17,4 %, p = 0,03) en comparación con la población FABP4hi (media ± sd para IL10 2,2 ± 2,8%, IL1B 4,7 ± 8,2%, TNF 2,7 ± 4,5%, CXCL10 2,6 ± 2,9%, CXCL3 6,4 ± 9,5% y CXCL8 3,8 ± 5,9%) (Fig. 4g). En conjunto, estos análisis demuestran que los subconjuntos mieloides definidos transcripcionalmente en los RM tienen poblaciones análogas en el pulmón humano y una concordancia general en su expansión y contribución a la inflamación inducida por SARS-CoV-2 en las vías respiratorias inferiores.

Baricitinib es un inhibidor de JAK1/2 aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide activa que fue aprobado recientemente por la FDA para el tratamiento de COVID-19 en ciertos adultos hospitalizados42 y se informó que reduce la mortalidad cuando se administra como monoterapia43 o en combinación con remdesivir25. En nuestro estudio anterior, utilizando datos de la Cohorte 1 y animales tratados con baricitinib (Fig. 1a), encontramos que baricitinib pudo suprimir la expresión de citoquinas proinflamatorias en BAL de RM infectados con SARS-CoV-220. Aquí, ampliamos este estudio para caracterizar aún más el impacto de baricitinib en las poblaciones mieloides en las vías respiratorias de cinco RM antes de la infección (−5 dpi) y a los 4 dpi, con tres RM que permanecieron sin tratamiento y dos que recibieron baricitinib. Descubrimos que 2 días de administración de baricitinib prácticamente anularon la entrada de macrófagos infiltrantes en el espacio alveolar a 4 ppp, ya que no detectamos ningún aumento en las poblaciones de CD163+MRC1− o CD163+MRC1+TREM2+ en animales tratados con baricitinib (Fig. 5a–d). Esta observación fue consistente al usar clasificaciones de macrófagos basadas en el mapeo de referencia de pulmón 10X o usando células AM / IM clasificadas a granel (Fig. 5a-d y Fig. 5a-d complementaria). Además de prevenir la entrada de macrófagos infiltrantes, el tratamiento con baricitinib también resultó en una expresión significativamente menor de citocinas y quimiocinas inflamatorias, pero la expresión de ISG permaneció comparable a la de los animales no tratados (Fig. 5e-g y Fig. 5e complementaria). En resumen, estos datos aclaran aún más el mecanismo de acción por el cual el tratamiento con baricitinib anula la inflamación de las vías respiratorias en la infección por SARS-CoV-220, al demostrar su capacidad para bloquear la infiltración de poblaciones discretas de macrófagos proinflamatorios en el compartimento alveolar. Similar a nuestras observaciones usando citometría de flujo, hubo un aumento en la abundancia de pDC a 4 ppp en el BAL detectado por datos de scRNA-Seq, sin embargo, este aumento se anuló en animales tratados con baricitinib (Fig. 5h, i).

a Proyección de macrófagos/monocitos de muestras de BAL 10X de -5 ppp y 4 ppp de tres macacos rhesus no tratados y dos tratados con baricitinib en el UMAP de referencia de macrófagos/monocitos de pulmón no infectados (NCBI GEO: GSE149758). b UMAP dividido por tratamiento y punto de tiempo que muestra anotaciones de celdas previstas basadas en el mapeo de los macrófagos/monocitos pulmonares de referencia. Porcentaje de un subconjunto dado de macrófagos/monocitos de todos los macrófagos/monocitos en las muestras de BAL: agrupadas (c) e individuales (d). Gráficos de violín que muestran la expresión de citocinas proinflamatorias (e), quimiocinas (f) e ISG (g) en los diferentes subconjuntos de macrófagos/monocitos en muestras BAL 10X de muestras tratadas y no tratadas con baricitinib. h Número absoluto de pDC en muestras de BAL de scRNA-Seq e i Porcentaje de pDC de todas las células en las muestras de BAL de scRNA-Seq. Los datos de origen (c, d, h, i) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los mecanismos por los cuales la infección por SARS-CoV-2 establece una enfermedad grave siguen siendo en gran parte desconocidos, pero siguen siendo una prioridad clave para reducir el número de víctimas de la pandemia de COVID-19. Dado que la aparición de los síntomas varía de 2 a 14 días después de la infección por SARS-CoV-2, la caracterización de los eventos inmunológicos tempranos utilizando muestras clínicas es un desafío. Aquí, utilizamos el modelo RM de infección por SARS-CoV-2 y un análisis de sistemas integrados para diseccionar la respuesta inmune durante la infección hiperaguda. Nuestros hallazgos fueron: (1) la infección por SARS-CoV-2 inició una respuesta robusta de IFN de tipo I en la sangre y en las vías respiratorias inferiores aparente a los 1-2 ppp; (2) el SARS-CoV-2 indujo una entrada rápida de dos poblaciones de macrófagos infiltrantes en el espacio broncoalveolar, lo que produjo la mayor parte de la producción de citoquinas inflamatorias; y (3) el mecanismo de acción de baricitinib, un fármaco recientemente autorizado por la FDA para su uso en el tratamiento de COVID-19 para ciertos adultos hospitalizados42, es anular la infiltración de estas células inflamatorias en las vías respiratorias. Nuestros datos presentan, hasta la fecha, el análisis más completo de los eventos inmunopatológicos que ocurren durante la infección hiperaguda por SARS-CoV-2.

Usando nuestros conjuntos de datos de referencia de macrófagos pulmonares RM, identificamos dos subconjuntos de células mieloides, ambos claramente distintos de los macrófagos alveolares, que se infiltran en las vías respiratorias después de la infección por SARS-CoV-2, que fueron los principales productores de quimiocinas y citocinas inflamatorias de las vías respiratorias inferiores. Una población, definida como células CD163+MRC1+TREM2+, era muy similar a las definiciones murinas de monocitos CCR2+ infiltrantes. El segundo, CD163+MRC1−, se parecía en gran medida a los macrófagos intersticiales. Nuestros datos son consistentes con una observación reciente de un aumento rápido (3 ppp) de IM en el BAL de RM usando citometría de flujo21. De manera similar, se ha observado una acumulación de no AM (definidos como CD16+CD206-HLA-DR+/CD11b+) y una reducción recíproca de AM en el LBA y los pulmones de RM y AGM infectados23. Descubrimos que estos subconjuntos mieloides, definidos transcripcionalmente en NHP, tenían poblaciones análogas en el pulmón humano. Por último, nuestros datos son consistentes con nuestros hallazgos recientes en el modelo murino, en el que el SARS-CoV-2 provocó el reclutamiento de monocitos circulantes en el parénquima pulmonar, pero se anuló significativamente en ratones con deficiencia de CCR239. El subconjunto similar a CD163+MRC1+Mac/AM también contribuyó al medio inflamatorio, produciendo IL6, TNF e IL10, aunque en cantidades significativamente menores.

Es importante tener en cuenta que nuestras observaciones se realizaron durante una infección hiperaguda y que nuestros animales no desarrollaron una enfermedad grave, por lo que, aunque nuestros datos indican que estas poblaciones infiltrantes orquestan una inflamación temprana y pueden contribuir a la patogenia de las vías respiratorias, no podemos establecer formalmente este vínculo. Sin embargo, este modelo es consistente con datos recientes de Ren et al.44, quienes observaron una pérdida significativa de la expresión de MARCO en poblaciones mieloides residentes en BAL de pacientes con COVID-19 grave en relación con aquellos con enfermedad moderada, similar a nuestras observaciones, en que la aparición de macrófagos infiltrantes diluyó la población de macrófagos MARCO+. Esas observaciones, junto con nuestros datos, sugieren que el fenotipo de macrófago inflamatorio que identificamos aquí puede retenerse preferentemente en las vías respiratorias inferiores de pacientes con COVID-19 grave. Además, demostramos que el tratamiento in vivo con el inhibidor de JAK1/2 baricitinib, que ha demostrado eficacia en la reducción de la enfermedad grave, pudo anular virtualmente el reclutamiento de estos macrófagos inflamatorios en las vías respiratorias, proporcionando un vínculo mecánico adicional con el desarrollo de COVID Patogénesis relacionada con -19.

Además de las citoquinas inflamatorias, observamos que los subconjuntos de macrófagos infiltrantes produjeron altos niveles de IL10 y se enriquecieron en las vías de señalización de IL10. Los IM de pulmón se consideran una "célula productora de IL10 profesional" que produce IL10 tanto en estado estacionario como en respuesta a estímulos innatos (LPS, CpG no metilados)45. La mayoría de los datos hasta la fecha han demostrado un papel inmunorregulador y protector para los MI en modelos murinos de asma, fibrosis pulmonar e inflamación inducida por alérgenos30. Sin embargo, aunque el potencial proinflamatorio de los IM ha sido relativamente poco estudiado, se ha demostrado que son eficientes en la producción de IL6 y TNF en respuesta a los ligandos TLR46. Dadas nuestras observaciones de alta producción de IL10 en macrófagos infiltrantes, no podemos excluir un papel inmunorregulador potencial para este subconjunto y, de hecho, presenta una hipótesis interesante en la que el equilibrio de macrófagos infiltrantes IM vs. TREM2+ en el espacio broncoalveolar determina el resultado patogénico de Infección por SARS-CoV-2. Por último, publicaciones recientes informaron que los IM de pulmón pueden estar compuestos por dos o incluso tres poblaciones funcionalmente distintas, definidas por un eje de expresión de Lyve1, MHC, CD169 y CD11c29,30,31,32. No observamos agrupaciones separadas entre BAL IM, ni expresión diferencial entre estos marcadores, y se necesita más trabajo para comprender la congruencia de los subconjuntos de macrófagos macacos con los identificados en el modelo murino.

Observamos una inducción muy rápida y robusta de la vía del IFN tipo I a 1-2 ppp, caracterizada por pDC elevados en las vías respiratorias y la sangre, transcritos y proteínas de IFNA e IFNB, ISG regulados al alza y aumento de granzima B en las células NK. La respuesta de IFN tipo I en la infección por SARS-CoV-2 se ha estudiado intensamente: la infección in vitro de las células epiteliales de las vías respiratorias ha dado como resultado una respuesta ISG silenciada47, y se ha informado que los pacientes que desarrollan COVID-19 grave tienen una mayor incidencia de mutaciones en Genes de respuesta a IFN, o niveles elevados de autoanticuerpos contra genes de respuesta a IFN (revisado en las referencias 6, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55). Nuestros datos, en los que la respuesta de IFN alcanzó su punto máximo a los 2 ppp y disminuyó en gran medida a los 10/11 ppp, proporcionan una cinética bien definida de la respuesta ISG, y se informaron observaciones similares en otros estudios de NHP21,22. La naturaleza rápida y de corta duración de la respuesta de IFN subraya la dificultad de interpretar la respuesta de IFN en muestras clínicas.

Nuestros análisis multiparamétricos demostraron un aumento de pDC a 2 ppp que coincidió con el pico de producción de ISG, detección de IFNA/B y activación de células NK, lo que implica que las pDC son la célula principal que organiza la respuesta de IFN en las vías respiratorias inferiores. Anteriormente habíamos observado una reducción en las frecuencias y la actividad de las pDC en sangre periférica en la infección humana por SARS-CoV-256, y otros informaron firmas de apoptosis de las pDC que predijeron respuestas más bajas de IFN-I57. En el contexto de estos hallazgos clínicos, nuestra observación de la acumulación de pDC en el BAL indica que se movilizan rápidamente desde la sangre hasta las vías respiratorias inferiores, y esto sugiere que probablemente impulsen respuestas inmunitarias innatas protectoras tempranas. Sin embargo, las pDC también pueden contribuir a la inflamación patológica; y futuros estudios de intervención dirigidos al eje pDC/IFN en modelos animales serán necesarios para probar estas hipótesis.

En nuestro estudio anterior, demostramos la capacidad de baricitinib para bloquear la producción de citoquinas proinflamatorias en las vías respiratorias en RM infectados con SARS-CoV-2 mientras se preservan las respuestas de IFN tipo I20. La eficacia de baricitinib para tratar la COVID-19 grave se probó recientemente en dos ensayos clínicos de fase 3 (ACTT-2 y COV-BARRIER) y recientemente recibió la aprobación como monoterapia para tratar la COVID-19 en pacientes que requieren oxígeno suplementario o ventilación mecánica42. Hasta la fecha, casi 1 millón de pacientes han recibido baricitinib para tratar la enfermedad grave por COVID-19, lo que subraya la importancia de comprender su mecanismo de acción. Aquí, ampliamos nuestros hallazgos originales para demostrar que baricitinib bloqueó la entrada de macrófagos inflamatorios en el espacio broncoalveolar. Estos datos se suman a nuestra comprensión mecánica de la acción de baricitinib y proporcionan una posible explicación de la disparidad del impacto de baricitinib en la señalización de IFN frente a IL6/TNF al considerar el momento de la administración del fármaco. Administramos baricitinib a los 2 dpi, después de la entrada máxima de pDC, pero antes de la probable aparición de los macrófagos inflamatorios a los 3-4 dpi. La respuesta ISG en curso y la respuesta suprimida de TNF/IL6 sugieren que el mecanismo principal por el cual baricitinib protege las vías respiratorias es bloqueando el reclutamiento de células inflamatorias en el espacio broncoalveolar. Cabe destacar que, en presencia de baricitinib y la eliminación concomitante de monocitos/macrófagos infiltrantes, la carga viral en el BAL no cambió en comparación con los controles, lo que sugiere que estas poblaciones ejercen un control mínimo de los niveles de virus. Sin embargo, dado que el modelo rhesus del SARS-CoV-2 tiende a ser compatible con la COVID-19 leve en la mayoría de los estudios, será fundamental examinar el mecanismo de baricitinib en un modelo de enfermedad grave. Con respecto a guiar las aplicaciones clínicas futuras de baricitinib, nuestros datos sugieren que el momento es fundamental y favorecería la administración temprana del fármaco. Además, dada la omnipresencia del SARS-CoV-2 y la creciente capacidad de reinfección, sería beneficioso realizar estudios futuros sobre la aplicación de baricitinib para el tratamiento de segundas infecciones.

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones; En primer lugar, si bien varios grupos han adoptado rápidamente el modelo RM/SARS-CoV-2 para las pruebas preclínicas de medicamentos y vacunas contra la COVID, ningún grupo ha demostrado una enfermedad sintomática reproducible manifiesta11. Por lo tanto, vincular los eventos inmunológicos tempranos con el desarrollo de COVID-19 grave requiere validación en estudios en humanos, como las observaciones de expresión reducida de MARCO en las poblaciones mieloides de las vías respiratorias de pacientes con COVID-19 grave mencionadas anteriormente44. Además, para estimar la contribución general a la producción de citocinas inflamatorias en los macrófagos, calculamos la fracción de lecturas de secuenciación para un transcrito de ARNm determinado asignado a un subconjunto; sin embargo, no medimos las cantidades de proteína a nivel de una sola célula y, en cambio, nos limitamos a evaluar los niveles generales en BALF. Estudios previos han intentado estimar la correlación del ARNm de citoquina con los niveles de proteína secretada y han informado una buena concordancia para TNF, IL6, CXCL10 y CXCL8, pero una concordancia más pobre para IL10 e IL1B58. Otro inconveniente fue el poder relativamente bajo de nuestro estudio. Si bien nuestras observaciones a 0, 1 y 2 ppp fueron n = 8, estábamos limitados a n = 4 para las observaciones del día 4–10. Para nuestro experimento de scRNA-Seq, abordamos los problemas de potencia al realizar nuestro análisis en dos cohortes independientes para un total de nueve animales. En general, no hubo falta de poder estadístico para nuestras observaciones clave.

Si bien el lanzamiento mundial de vacunas ha logrado grandes avances para reducir la transmisión y la gravedad de la infección por SARS-CoV-2, millones de personas siguen siendo vulnerables. Comprender los eventos tempranos de la infección por SARS-CoV-2 y los mecanismos por los cuales los medicamentos aprobados clínicamente brindan protección sigue siendo una prioridad mundial. En este estudio, identificamos dos poblaciones de células mieloides inflamatorias que son responsables de la preponderancia de la inflamación de las vías respiratorias en la infección aguda por SARS-CoV-2. También demostramos que el tratamiento con baricitinib, recomendado por la Organización Mundial de la Salud para el tratamiento de la COVID-19 grave en enero de 2022, bloqueó la infiltración de estas células inflamatorias en el espacio alveolar. Estos datos identifican tanto un objetivo farmacológico clave (macrófagos que se infiltran en las vías respiratorias) como un mecanismo eficaz para reducir la inflamación de las vías respiratorias, y deberían resultar útiles para identificar fármacos adicionales para reducir la incidencia y la mortalidad de la enfermedad grave por COVID-19.

Las instalaciones de cuidado de animales en ENPRC están acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC), así como por el Departamento de Agricultura de EE. UU. (USDA). El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC) revisó y aprobó todos los experimentos con animales bajo el permiso PROTO202000035. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las normas institucionales y las pautas establecidas por la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los NIH (8.ª edición) y se realizaron bajo anestesia y un control adecuado del dolor de seguimiento para minimizar el sufrimiento de los animales. Ocho (4 hembras, 4 machos, mayores de 11 años) macacos rhesus de origen indio libres de patógenos específicos se infectaron por vía intranasal e intratraqueal con 1,1 × 106 unidades formadoras de placa (PFU) SARS-CoV-2 como se describió previamente20 y se mantuvieron en el ABSL3 en YNPRC (permiso IACUC PROTO202000035). El procesamiento de hisopados nasofaríngeos, LBA y células mononucleares se realizó como se describió anteriormente20. Se agregaron al estudio seis (2 hembras, 4 machos, mayores de 6 años) macacos rhesus de origen indio libres de patógenos específicos adicionales (permiso IACUC PROTO202100003) y también se infectaron por vía intranasal e intratraqueal con 1,1 × 106 células formadoras de placa. unidades (PFU) SARS-CoV-2 para la caracterización de la expresión de CCR2 en sangre entera y BAL.

Los ocho animales bajo el permiso PROTO202000035 de IACUC tenían la misma edad y sexo entre los brazos experimentales tratados con baricitinib y control sin tratar, con dos hembras y dos machos asignados a cada brazo respectivo. La cohorte 2 (permiso IACUC PROTO202100003) estaba compuesta por dos mujeres y cuatro hombres, todos los cuales sirvieron como controles sin tratamiento. Se hicieron esfuerzos para incluir el mismo número de mujeres y hombres en la Cohorte 2. Sin embargo, los macacos hembras estaban limitados en el momento de la asignación de animales de la Cohorte 2 debido a las demandas de reproducción. En total, entre las cohortes 1 y 2, se incluyeron en este estudio cuatro controles femeninos y seis masculinos sin tratar.

Los stocks virales utilizados para infectar las 8 RM del permiso IACUC PROTO202000035 fueron previamente descritos20. SARS-CoV-2 (NR-52281: BEI Resources, Manassas, VA; USA-WA1/2020, Lote n.º 70033175) se pasó en la línea celular Vero E6 (línea celular African Green Monkey Kidney; CRL-1586, ATCC) en un MOI de 0,01. El método TCID50 se utilizó para propagar y titular el SARS-CoV-2, seguido del almacenamiento de alícuotas a -80 °C. La dosis infecciosa administrada se determinó mediante valoración por retroceso de las reservas virales mediante un ensayo de placas. El stock de virus se secuenció para confirmar la presencia del motivo de escisión de furina. Las cepas virales utilizadas tenían menos del 6% de los genomas con una mutación que puede anular la escisión de furina. Los 6 RM en el permiso IACUC PROTO202100003 fueron infectados con el stock viral NR-53899: BEI Resources, Manassas, VA; EE. UU.-WA1/2020.

El ARN genómico y subgenómico del SARS-CoV-2 se cuantificó en hisopos nasofaríngeos, hisopos faríngeos y LBA como se describió anteriormente18,20. Los hisopos se mantuvieron en 1 ml de medio de transporte viral (VTM-1L, Labscoop, LLC). El ARN viral se extrajo manualmente de muestras frescas de hisopos nasofaríngeos (NP), hisopos faríngeos y LBA utilizando el kit QiaAmp Viral RNA mini según el protocolo del fabricante. Para el ARN genómico, los CDC diseñaron un conjunto de cebadores y sondas N2: CoV2-N2-F: 5'-TTACAAACATTGGCCGCAAA-3', CoV2-N2-R: 5'-GGCCGACATTCCGAAGAA-3' y CoV2-N2-Pr: 5'- FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ-3'59 se utilizaron para la PCR cuantitativa (qPCR). Para el ARN subgenómico, se usaron las secuencias de cebador y sonda para el transcrito de ARNm subgenómico del gen E60: SGMRNA-EF: 5'-CGATCTCTTGTGATCGTTCTC-3', SGMRNA-ER: 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' y SGMRNA-E -Pr: 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'. Las reacciones de qPCR se realizaron con la mezcla maestra de 1 paso TaqMan Fast Virus utilizando las condiciones de ciclo del fabricante, 200 nM de cada cebador y 125 nM de la sonda por duplicado. En total, 257 copias/ml VTM/plasma/BAL fue el límite de detección para este ensayo. La qPCR de la subunidad p30 de la RNasa P de los CDC, modificada para polimorfismos específicos del macaco rhesus, se utilizó para verificar la calidad de la muestra utilizando las siguientes secuencias de cebador y sonda: RM-RPP30-F 5'-AGACTTGGACGTGCGAGCG-3', RM-RPP30-R 5'- GAGCCGCTGTCTCCACAAGT-3' y RPP30-Pr 5'-FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3'. La integridad del ARN y la calidad de la muestra se verificaron ejecutando un solo pozo de cada extracción.

Los hisopos NP se recogieron bajo anestesia utilizando un hisopo limpio con punta de rayón (Thermo Fischer Scientific, BactiSwab NPG, R12300) colocado ~2–3 cm en las fosas nasales. Se recolectaron hisopos orofaríngeos bajo anestesia utilizando hisopos con punta de poliéster (aplicador con punta de poliéster estándar Puritan, mango de poliestireno, 25-806 2PD, VWR International) para rayar las amígdalas y la parte posterior de la garganta bilateralmente (garganta/faringe). Los hisopos se sumergieron en 1 ml de medios de transporte viral (Viral transport Media, VTM-1L, Labscoop, LLC) y se agitaron durante 30 s, y se recogió el eluato.

Para recolectar el LBA, se manipuló un broncoscopio de fibra óptica (Olympus BF-XP190 EVIS EXERA III ULTRA SLM BRNCH y BF-P190 EVIS EXERA 4.1 mm) en la tráquea, se dirigió hacia el bronquio principal y se fijó en un bronquio subsegmentario distal sobre el cual se colocaron 35– Se administraron 50 ml de solución salina normal (0,9% NaCl) en el bronquio y se volvió a aspirar para obtener un mínimo de 20 ml de líquido de lavado. El BAL se filtró a través de un filtro de células de 70 μm y se recolectaron múltiples alícuotas para las cargas virales. A continuación, el BAL restante se centrifugó a 2200 rpm durante 5 min y el líquido sobrenadante del BAL se recogió para el análisis de mesoescala. Las células BAL sedimentadas se resuspendieron en R10 y se usaron para análisis posteriores.

Se contó la viabilidad de las células mononucleares utilizando un contador de células automatizado Countess II (Thermo Fisher) con tinción de azul de tripán y se crioconservaron en alícuotas de hasta 2 × 107 células en DMSO al 10 % en FBS inactivado por calor. Los segmentos de tejido completos (0,5 cm3) se congelaron rápidamente o se almacenaron en RNAlater (Qiagen) o tampón de lisis Nuclisens (Biomerieux) para análisis de distribución de compuestos, ARN-seq y cuantificación viral de tejido, respectivamente.

En total, se realizó un análisis de citometría de flujo de 23 parámetros en sangre entera fresca con EDTA61 y células mononucleares BAL de RM infectados con SARS-CoV-2 como se describió anteriormente20 utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) antihumanos, que nosotros y otros20,62,63, incluidas las bases de datos mantenidas por NHP Reagent Resource (MassBiologics), han mostrado reacciones cruzadas en los RM.

Se utilizó un panel de los siguientes mAb para el fenotipado longitudinal de células inmunitarias innatas en sangre total (500 μl) y células mononucleares (106 células) derivadas de BAL de la Cohorte 1 y animales tratados con baricitinib: anti-CD20-BB700 (clon 2H7; 2,5 ul; cat. n.º 745889), anti-Ki-67-BV480 (clon B56; 5 ul; cat. n.º 566109), anti-CD14-BV605 (clon M5E2; 2,5 ul; cat. n.º 564054), anti -CD56-BV711 (clon B159; 2,5 ul; nº de catálogo 740781), anti-CD115-BV750 (clon 9-4D2-1E4; 2,5 ul; nº de catálogo 747093), anti-CD3-BUV395 (clon SP34-2; 2,5 ul; cat. n.º 564117), anti-CD8-BUV496 (clon RPA-T8; 2,5 ul; cat. n.º 612942), anti-CD45-BUV563 (clon D058-1283; 2,5 ul; cat. n.º 741414), anti -CCR2-BUV661 (clon LS132.1D9; 2,5 ul; cat. n.° 750472), anti-CD16-BUV737 (clon 3G8; 2,5 ul; cat. n.° 564434), anti-CD69-BUV805 (clon FN50; 5 ul; cat. . n.° 748763) y Fixable Viability Stain 700 (2 ul; n.° de cat. 564997), todos de BD Biosciences; anti-CD38-FITC (clon AT1; 5 ul; nº de cat. 60131FI) de STEMCELL Technologies; anti-CD161-BV421 (clon HP-3G10; 5 ul; cat. # 339914), anti-HLA-DR-BV650 (clon L243; 5 ul; cat. # 307650), anti-CD11c-BV785 (clon 3.9; 5 ul; cat. n.º 301644), anti-CD11b-PE (clon ICRF44; 2,5 ul; cat. n.º 301306) y anti-CD123-APC-Fire750 (clon 315; 2,5 ul; cat. n.º 306042), todos de Biolegend; anti-GranzymeB-PE-TexasRed (clon GB11; 2,5 ul; nº de cat. GRB17) de Thermo Fisher; anti-CD66abce-PE-Vio770 (clon TET2; 1 ul; nº de cat. 130-119-849) de Miltenyi Biotec; y anti-CD27-PE-Cy5 (clon 1A4CD27; 2,5 ul; n.° de cat. 6607107) y anti-NKG2A-APC (clon Z199; 5 ul; n.° de cat. A60797) de Beckman Coulter (Fig. 4 complementaria).

Para los animales de la Cohorte 2, se usó un panel diferente de los siguientes mAbs para el fenotipado longitudinal de células inmunitarias innatas en sangre completa (500 μl), como se describe en la ref. 26 y células mononucleares (2 × 106 células) derivadas de BAL: anti-CD20-BB700 (clon 2H7; 2,5 μl; n.° de cat. 745889), anti-CD11b-BV421 (clon ICRFF44; 2,5 μl; n.° de cat. 562632) , anti-Ki-67-BV480 (clon B56; 5 μl; n.° de cat. 566109), anti-CD14-BV605 (clon M5E2; 2,5 μl; n.° de cat. 564054), anti-CD56-BV711 (clon B159; 2,5 μl ; n.° de cat. 740781), anti-CD163-BV750 (clon GHI/61; 2,5 μl; n.° de cat. 747185), anti-CD3-BUV395 (clon SP34-2; 2,5 μl; n.° de cat. 564117), anti-CD8 -BUV496 (clon RPA-T8; 2,5 μl; n.° de cat. 612942), anti-CD45-BUV563 (clon D058-1283; 2,5 μl; n.° de cat. 741414), anti-CCR2-BUV661 (clon LS132.1D9; 2,5 μl ; n.° de cat. 750472), anti-CD16-BUV737 (clon 3G8; 2,5 μl; n.° de cat. 564434), anti-CD101-BUV805 (clon V7.1; 2,5 μl; n.° de cat. 749163), anti-CD169-PE todos de BD Biociencias; anti-ACE2-AF488 (clon policlonal; 5 μl; n.° de cat. FAB9332G-100UG) de I+D; anti-HLA-DR-BV650 (clon L243; 5 μl; n.° de cat. 307650), anti-CD11c-BV785 (clon 3.9; 5 μl; n.° de cat. 301644) y anti-CD123-APC-Fire750 (clon 315; 2,5 μl, nº de catálogo 306042), todos de Biolegend; anti-GranzymeB-PE-TexasRed (clon GB11; 2,5 µl; nº de cat. GRB17) de Thermo Fisher; anti-CD66abce-PE-Vio770 (clon TET2; 1 μl; nº de cat. 130-119-849) de Miltenyi Biotec; anti-NKG2A-APC (clon Z199; 5 µl; nº de cat. A60797) de Beckman Coulter. Los mAbs para los receptores de quimiocinas (es decir, CCR2) se incubaron a 37 °C durante 15 min y las células se fijaron y permeabilizaron a temperatura ambiente durante 15 min con el kit de solución de fijación/permeabilización (BD Biosciences; nº de catálogo 554714). Para cada muestra, se registraron un mínimo de 1,2 × 105 eventos de puerta de parada (células T CD3+ vivas). Todas las muestras se fijaron con paraformaldehído al 4% y se adquirieron dentro de las 24 h posteriores a la fijación. La adquisición de datos se realizó en un FACSymphony A5 (BD Biosciences) con el software FACS DiVa versión 8.0 y se analizó con FlowJo (versión 10.7; Becton, Dickinson y Company). La estrategia de activación se muestra en la figura complementaria 1.

Los datos de −5 dpi, 2 dpi y 4 dpi para muestras de LBA a granel se obtuvieron de nuestro estudio anterior20. Aquí ampliamos nuestro estudio para incluir muestras de 7 ppp y 10 ppp/11 ppp para BAL y −5 ppp, 1 ppp, 2 ppp, 4 ppp, 6 ppp, 7 ppp, 8 ppp y 10/11 ppp para PBMC. Se prepararon suspensiones celulares en BSL3, para RNA-Seq a granel, se lisaron 250 000 células (PBMC) o 100 000 células (BAL) directamente en 700 ul de reactivo QIAzol. Se utilizaron los kits RNeasy Mini o Micro (QIAGEN) con digestión con ADNasa en columna para aislar el ARN. La calidad del ARN se determinó utilizando un Agilent Bioanalyzer y la síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando el ARN total con el kit Clontech SMARTSeq v4 Ultra Low Input RNA (Takara Bio) según las instrucciones del fabricante. Se agregaron códigos de barras de doble índice al ADNc amplificado después de la fragmentación con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NexteraXT (Illumina). Se utilizó Agilent 4200 TapeStation para validar las bibliotecas mediante electroforesis capilar y las bibliotecas se agruparon en concentraciones equimolares. Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina NovaSeq6000 a 100SR, lo que produjo entre 20 y 25 millones de lecturas por muestra.

Los archivos BCL se convirtieron a Fastq usando bcl2fastq v2.20.0.422. Las secuencias del genoma de Macaca mulatta (Mmul10 Ensembl versión 100), SARS-CoV-2 (cepa MN985325.1—NCBI) y secuencias ERCC se combinaron para construir un índice STAR (v2.7.3a) como se describió anteriormente y las lecturas se alinearon a esta referencia20. Los archivos ReadsPerGene se convirtieron al formato htseq y luego se importaron en DESeq2 v1.24.064 usando la función DESeqDataSetFromHTSeqCount. El diseño utilizado fue: ∼ Sujeto + Grupo * Punto de tiempo donde el Grupo distinguió entre muestras que no fueron tratadas o tratadas con baricitinib durante el transcurso del tiempo. Los genes expresados ​​diferencialmente para BAL y PBMC se determinaron usando un umbral de padj <0.05, cambio de pliegue >2 y filtrando genes de baja expresión donde se requería que todas las muestras en un punto de tiempo particular tuvieran una expresión detectable mediante lecturas normalizadas >0 para ese gene.

La entrada para GSEA v4.1.065 fueron los valores de expresión de registro regularizados obtenidos de DESeq2. Se usaron los siguientes conjuntos de genes para el análisis GSEA: Hallmark y vías canónicas (MsigDB), NHP ISGs66 y artritis reumatoide (KEGG map05323). Dado que los nombres de los genes son en gran medida consistentes entre las referencias del genoma humano y del mono rhesus, se usaron sin alterar con conjuntos de genes MsigDB humanos. Los parámetros predeterminados se usaron para ejecutar GSEA con el tipo de permutación gene_set. Se generaron gráficos de volcán de expresión diferencial en cada punto de tiempo con EnhancedVolcano (v1.8.0) R library67. Los valores de expresión de registro regularizados de DESeq2 se usaron para generar mapas de calor usando la biblioteca ComplexHeatmap (v2.0.0) R68.

Las matrices de recuento filtradas para BAL se obtuvieron de GEO GSE15921420. Para cada muestra de BAL de macaco rhesus infectado con SARS-CoV-2, la matriz de recuento se filtró para incluir solo los genes codificadores de proteínas. Se filtraron los genes codificados en el cromosoma Y, los genes mitocondriales, los genes RPS y RPL, los genes del receptor de células B y del receptor de células T y HBB. Se utilizó la biblioteca Seurat v4.0.434 para realizar el análisis. Se usaron los siguientes parámetros para filtrar las células: (1) nFeature_RNA ≥ 200 y ≤4000, (2) % del gen HBB <10, (3) % de genes mitocondriales <20, (4) % de genes RPS/RPL <30 y (5) log10(nFeature_RNA)/log10(nCount_RNA) ≥ 0,8. El número de células de cada muestra que pasó las métricas de control de calidad se incluye en los Datos complementarios 5. Todas las muestras de BAL de cada animal a −5 dpi y 4 dpi se integraron luego según el proceso de integración de Seurat69 utilizando el método CCA predeterminado después de normalizar las muestras. utilizando el método SCTransform. Las primeras 30 dimensiones se usaron con las funciones RunUMAP y FindNeighbors.

Para la identificación de DC, todas las muestras de BAL de −5 dpi y 4 dpi para macacos rhesus tratados y no tratados se integraron usando CCA. Los grupos se determinaron usando la función FindClusters en Seurat y las celdas se anotaron usando SingleR (v1.4.0) (Figura complementaria 10a, b). El grupo 11 de seurat se clasificó como pDC en función de la expresión de marcadores canónicos (Fig. 10c complementaria). Los grupos 17 y 22 se clasificaron como mDC y mDC activados en función de la expresión de los genes marcadores informados anteriormente70.

Para obtener el subconjunto de macrófagos/monocitos, se seleccionó el grupo más grande compuesto principalmente por macrófagos/monocitos anotados por SingleR (base de datos BluePrintEncode). Las celdas que se anotaron como otro tipo de celda en este grupo se filtraron. Los macrófagos/monocitos de todas las muestras de BAL se dividieron luego en muestras individuales, se normalizaron mediante el método SCTransform y luego se integraron de nuevo mediante 30 dimensiones. Usamos la función FindMarkers en Seurat para probar la expresión diferencial usando el método MAST (v1.16.0)71.

Los macrófagos/monocitos de las muestras de BAL se anotaron en subconjuntos utilizando dos enfoques: (1) mapeo de macrófagos/monocitos de referencia pulmonar utilizando Seurat y (2) utilizando células clasificadas a granel como referencia con SingleR28. Los datos de scRNA-seq de pulmón 10X de tres macacos no infectados se obtuvieron de un estudio publicado (NCBI GEO: GSE149758)33. Se usaron los siguientes parámetros para filtrar las células: (1) nFeature_RNA ≥ 200 y ≤4000, (2)% de genes mitocondriales <20, (3)% de genes RPS/RPL <50 y (4) log10(nFeature_RNA)/log10 (nCuenta_ARN) ≥ 0,8. Las muestras se normalizaron usando SCTransform y se integraron. Las primeras 40 dimensiones se utilizaron para el agrupamiento inicial. A continuación, se seleccionaron las células de macrófagos/monocitos anotadas por SingleR, se dividieron en muestras individuales y se integraron de nuevo utilizando 30 dimensiones. El agrupamiento de Louvain dio como resultado cuatro grupos que se anotaron en función de la expresión de genes marcadores. Este conjunto de datos integrado sirvió como referencia para mapear los macrófagos/monocitos del BAL infectado con SARS-CoV-2 utilizando FindTransferAnchors y MapQuery con reference.reduction establecido en pca y umap como modelo de reducción.

Las muestras de BAL también se anotaron utilizando la biblioteca SingleR con las celdas ordenadas a granel IM y AM como referencia. Con el fin de obtener referencias para la asignación de tipos de células en datos de una sola célula, se analizaron datos de RNA-Seq a granel de macrófagos intersticiales (IM) y alveolares (AM) de tres macacos cynomolgus35 no infectados utilizando DESeq2. Los valores de expresión logarítmica regularizados se obtuvieron utilizando la función rlog con los parámetros blind = FALSE y filtType = "parametric". Los genes significativos se filtraron según los siguientes criterios: padj <0,05; cambio de pliegue >2 y expresión media normalizada >5000 para muestras IM o AM.

Para el análisis de datos de pulmones humanos, obtuvimos el objeto rds para GEO GSE13589340 y filtramos todas las células excepto las anotadas como macrófagos, monocitos y macrófagos en proliferación de las muestras de control. Hubo un total de diez muestras de control de dos sitios diferentes. Observamos algunos efectos de lotes potenciales en UMAP y seleccionamos solo siete muestras del sitio "Vanderbilt". Además, eliminamos una muestra porque el número de macrófagos/monocitos era bajo, lo que dio como resultado un total de seis muestras sanas. El objeto se dividió en función de Sample_Name y se reintegró mediante el método CCA en Seurat. Sobre la base de la expresión de los genes marcadores descritos en Morse et al.41, los cuatro grupos de seurat obtenidos mediante el uso de 15 dimensiones y una resolución de 0,1 se anotaron como FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi y macrófagos en proliferación. El rhesus y los macrófagos/monocitos humanos de individuos sanos se integraron luego utilizando el enfoque basado en referencia con muestras humanas como referencia utilizando genes que se clasificaron como ortólogos uno a uno según ENSEMBL entre GRCh38 y Mmul10 y compartían el mismo nombre de gen. . El paquete UCell (v1.3.1)72 se usó para obtener puntajes de enriquecimiento para la expresión de genes marcadores entre los subconjuntos de macrófagos/monocitos humanos y rhesus. Los marcadores para cada subconjunto se obtuvieron mediante la función FindMarkers en Seurat para cada especie mediante el método MAST y se filtraron para incluir aquellos con un valor de p ajustado <0,05 y un cambio de pliegue de >1,5. Estos se filtraron aún más para incluir solo genes que se clasificaron como ortólogos uno a uno y compartían el mismo nombre de gen entre GRCh38 y Mmul10 (Datos complementarios 6).

Para el BAL humano, usamos las muestras disponibles como parte de GEO: GSE1459268. Las células se filtraron según los siguientes criterios: nFeature_RNA > 100, nFeature_RNA < 3500 y percent.mito <10 y las muestras se integraron utilizando PCA recíproco. Las células se anotaron utilizando la base de datos BPEncode en SingleR y solo las células anotadas como macrófagos/monocitos en el grupo más grande que comprende macrófagos/monocitos se usaron para un análisis adicional (Fig. 8d, e complementarias). Luego, estas células se anotaron utilizando el macrófago/monocitos de pulmón sano como referencia utilizando las funciones FindTransferAnchors y MapQuery en seurat. La expresión de genes marcadores se utilizó para evaluar la precisión de las predicciones (Fig. 8f complementaria).

Para calcular la contribución de cada tipo de célula hacia la expresión de un gen, los valores de CPM se obtuvieron utilizando el método de normalización RC con un factor de escala de 1e6. El valor total de CPM se calculó por gen y la suma de los valores de CPM para un tipo de célula determinado se dividió por el total para obtener un valor porcentual.

Se usaron ensayos U-PLEX (tecnología MULTI-ARRAY de escala meso) para la detección de citoquinas en plasma y BALF de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando 25 microlitros como entrada.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. El tamaño de la muestra estuvo determinado en gran medida por (1) la disponibilidad de NHP que, en el momento del estudio (marzo de 2020), podría estar infectado con SARS-CoV-2 y alojado en BSL-3 y (2) el fuerte impacto anticipado de baricitinib en el bloqueo de la inflamación inducida por SARS-CoV-2. Los 8 RM de la Cohorte 1 se aleatorizaron 2 días después de la infección en un grupo tratado y no tratado, cada uno de los cuales constaba de cuatro RM. La cohorte 2 estaba compuesta por 6 RM26 infectados con SARS-CoV-2. Las cargas virales de ARNsg nasal a los 2 ppp no ​​se midieron en 4 animales (n = 2 cohortes 1 y n = 2 cohortes de baricitinib) y las cargas virales de ARNsg en la garganta a los 6 y 8 ppp no ​​se midieron en un animal de la cohorte 1 debido al ARN limitado. La sangre completa no se tiñó para la citometría de flujo a 1 ppp para un animal de la Cohorte 1 y dos animales con baricitinib y 6 ppp para un animal de la Cohorte 1. El líquido sobrenadante de BAL no se recolectó para un animal de la Cohorte 1 y un animal con baricitinib a 2 ppp y, posteriormente, no se analizó a mesoescala. Se eliminó una muestra de referencia de scRNA-Seq de la cohorte 2 debido a la gran fracción de células epiteliales. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados. Las pruebas estadísticas se realizaron con R (versión 4.2.2) o GraphPad Prism v7.02 y se han enumerado en consecuencia. Las pruebas específicas que se utilizaron: una cola/dos colas, prueba de rango con signo de Mann-Whitney U/Wilcoxon se han indicado para cada comparación. Para el análisis de expresión génica diferencial de datos de RNA-Seq a granel y de una sola célula, se usaron los valores de p ajustados después de la corrección de múltiples pruebas, determinados como parte de los análisis DESeq2 y MAST.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-Seq a granel generados en este estudio para muestras de 7 dpi y 10 dpi/11 dpi para BAL y -5 dpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi y 10/11 dpi para PBMC se ha depositado en NCBI GEO (GSE198882). Los datos de scRNA-Seq para BAL de macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 y los datos de RNA-Seq a granel para −5 dpi, 2 dpi y 4 dpi para granel se obtuvieron de GEO GSE15921420. Las muestras de pulmón de macaco rhesus no infectado de una sola célula 10X se obtuvieron de GEO GSE14975833. Los datos de RNA-Seq a granel para macrófagos intersticiales y alveolares clasificados del macaco cynomolgus se obtuvieron de GEO GSE22531635. Las muestras de pulmón humano no infectado de una sola célula y las muestras de LBA humano se obtuvieron de GEO GSE13589340 y GSE1459268 respectivamente. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts utilizados para el análisis están disponibles en https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_273.

Zhou, P. et al. Un brote de neumonía asociado a un nuevo coronavirus de probable origen murciélago. Naturaleza 579, 270–273 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Un nuevo coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019. N. Engl. J.Med. 382, 727–733 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baden, LR et al. Eficacia y seguridad de la vacuna mRNA-1273 SARS-CoV-2. N. ingl. J.Med. https://doi.org/10.1056/nejmoa2035389 (2020).

Mulligan, MJ et al. Estudio de fase I/II de la vacuna de ARN COVID-19 BNT162b1 en adultos. Naturaleza 586, 589–593 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Polack, FP et al. Seguridad y eficacia de la vacuna Covid-19 de ARNm BNT162b2. N. ingl. J.Med. 383, 2603–2615 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carvalho, T., Krammer, F. & Iwasaki, A. Los primeros 12 meses de COVID-19: una línea de tiempo de conocimientos inmunológicos. Nat. Rev. Inmunol. 21, 245–256 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wichmann, D. et al. Hallazgos de autopsia y tromboembolismo venoso en pacientes con COVID-19: un estudio de cohorte prospectivo. Ana. Interno. Medicina. 173, 268–277 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Liao, M. et al. Panorama unicelular de células inmunitarias broncoalveolares en pacientes con COVID-19. Nat. Medicina. 26, 842–844 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Silvin, A. et al. La calprotectina elevada y los subconjuntos anormales de células mieloides discriminan la COVID-19 grave de la leve. Celda 182, 1401–1418.e18 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, JB & June, CH Síndrome de liberación de citocinas en casos graves de COVID-19. Ciencia 368, 473–474 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Muñoz-Fontela, C. et al. Animal modelos for COVID-19. Nature 586, 509-515 (2020).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Munster, VJ et al. Enfermedad respiratoria en macacos rhesus inoculados con SARS-CoV-2. Naturaleza 585, 268–272 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rockx, B. et al. Patogenia comparativa de COVID-19, MERS y SARS en un modelo de primate no humano. Ciencia 368, 1012–1015 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandrashekar, A. et al. La infección por SARS-CoV-2 protege contra la reexposición en macacos rhesus. Ciencia 369, 812–817 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ziegler, CGK et al. El receptor ACE2 del SARS-CoV-2 es un gen estimulado por interferón en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas y se detecta en subconjuntos celulares específicos en todos los tejidos. Celda 181, 1016–1035.e19 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corbett, KS y col. Evaluación de la vacuna mRNA-1273 contra SARS-CoV-2 en primates no humanos. N. ingl. J.Med. 383, 1544–1555 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mercado, NB et al. La vacuna Ad26 de inyección única protege contra el SARS-CoV-2 en macacos rhesus. Naturaleza 586, 583–588 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Routhu, NK et al. La vacuna modificada basada en el vector vaccinia Ankara protege a los macacos de la infección por SARS-CoV-2, la patología inmune y la disfunción en el pulmón. Inmunidad 54, 542–556 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williamson, BN et al. Beneficio clínico de remdesivir en macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2. Naturaleza 585, 273–276 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoang, TN et al. El tratamiento con baricitinib resuelve la inflamación de los macrófagos de las vías respiratorias inferiores y el reclutamiento de neutrófilos en macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2. Celda 184, 460–475.21 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Singh, DK et al. Respuestas a la infección aguda por SARS-CoV-2 en los pulmones de macacos rhesus, babuinos y titíes. Nat. Microbiol. 6, 73–86 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ayuda, M. et al. Enfermedad vascular y trombosis en macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2. Celda 183, 1354–1366.e13 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fahlberg, MD y col. Eventos celulares de COVID-19 agudo, en resolución o progresivo en primates no humanos infectados con SARS-CoV-2. Nat Comun. 11, 6078 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Esperanza, E. et al. La secuenciación del ARN de una sola célula revela la dinámica de la infección por SARS-CoV-2 en los pulmones de los monos verdes africanos. ciencia Traducir Medicina. 13, eabe8146 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalil, AC et al. Baricitinib más remdesivir para adultos hospitalizados con Covid-19. N. ingl. J.Med. 384, 795–807 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hoang, TN et al. La modulación de las respuestas de interferón tipo I inhibe potentemente la replicación y la inflamación del SARS-CoV-2 en los macacos rhesus. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.21.512606 (2022).

Schultze, JL & Aschenbrenner, AC COVID-19 y el sistema inmunológico innato humano. Celda 184, 1671–1692 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arán, D. et al. El análisis basado en referencias de la secuenciación de células individuales de pulmón revela un macrófago profibrótico de transición. Nat. inmunol. 20, 163–172 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibbings, SL et al. Tres macrófagos intersticiales únicos en el pulmón murino en estado estacionario. Soy. J. Respir. Mol celular. Biol. 57, 66–76 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chakarov, S. et al. Dos poblaciones distintas de macrófagos intersticiales coexisten entre tejidos en nichos subtisulares específicos. Ciencia 363, eaau0964 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ural, BB et al. Identificación de un subconjunto de macrófagos intersticiales residentes en los pulmones y asociados a los nervios con distintas propiedades inmunorreguladoras y de localización. ciencia inmunol. 5, eaax8756 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schyns, J. et al. Los monocitos tisulares no clásicos y dos poblaciones funcionalmente distintas de macrófagos intersticiales pueblan el pulmón del ratón. Nat. común 10, 3964 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Esaulova, E. et al. El panorama inmunológico en la tuberculosis revela poblaciones vinculadas a la enfermedad y la latencia. Microbio huésped celular 29, 165–178.e8 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hao, Y. et al. Análisis integrado de datos unicelulares multimodales. bioRxiv 184, 3573–3587.e29 (2020).

Google Académico

Corry, J. et al. La infiltración de macrófagos y neutrófilos inflamatorios y la piroptosis generalizada en la letalidad de la gripe por impulso pulmonar en primates no humanos. Patog de PLoS. 18, e1010395 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai, Y. et al. Caracterización in vivo de macrófagos pulmonares alveolares e intersticiales en macacos rhesus: implicaciones para comprender la enfermedad pulmonar en humanos. J. Immunol. 192, 2821–2829 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kumagai, T., Fan, S. & Smith, AM ADAMDEC1 y su papel en las enfermedades inflamatorias y el cáncer. Metaloproteinasas Med. 7, 15–28 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Coillard, A. & Segura, E. Diferenciación in vivo de monocitos humanos. Frente. inmunol. 10, 1907 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanderheiden, A. et al. Las células derivadas de monocitos dependientes de CCR2 restringen la infección por SARS-CoV-2. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.03.442538 (2021).

Habermann, AC et al. La secuenciación de ARN de una sola célula revela funciones profibróticas de distintos linajes epiteliales y mesenquimales en la fibrosis pulmonar. ciencia Adv. 6, eaba1972 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morse, C. et al. Proliferación de macrófagos que expresan SPP1/MERTK en la fibrosis pulmonar idiopática. EUR. Respirar J. 54, 1802441 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubin, R. Baricitinib es el primer tratamiento inmunomodulador aprobado para COVID-19. JAMA 327, 2281 (2022).

CAS PubMed Google Académico

Bronte, V. et al. Baricitinib frena la desregulación inmune en pacientes graves con COVID-19. J. Clin. Invertir. 130, 6409–6416 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, X. et al. Características inmunes de COVID-19 reveladas por un atlas de transcriptoma unicelular a gran escala. Celda 184, 1895–1913 e1819 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, CJ, Marichal, T. & Bureau, F. El macrófago intersticial: una pieza descuidada durante mucho tiempo en el rompecabezas de la inmunidad pulmonar. Celúla. inmunol. 330, 91–96 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hoppstädter, J. et al. Reacción celular diferencial tras la activación del receptor tipo Toll 4 y 9 en macrófagos intersticiales alveolares y pulmonares humanos. Respirar Res. 11, 124 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Blanco-Melo, D. et al. La respuesta desequilibrada del huésped al SARS-CoV-2 impulsa el desarrollo de COVID-19. Celda 181, 1036–1045.e9 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Asano, T. et al. Deficiencia de TLR7 recesiva ligada al cromosoma X en ~1 % de los hombres menores de 60 años con COVID-19 potencialmente mortal. ciencia inmunol. 6, eabl4348 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bastardo, P. et al. Los autoanticuerpos que neutralizan los IFN tipo I están presentes en ~4 % de las personas no infectadas mayores de 70 años y representan ~20 % de las muertes por COVID-19. ciencia inmunol. 6, eabl4340 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bastardo, P. et al. Los autoanticuerpos preexistentes contra IFN tipo I subyacen a la neumonía crítica por COVID-19 en pacientes con APS-1. Exp. J. Medicina. 218, e20210554 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bastardo, P. et al. Autoanticuerpos contra IFN tipo I en pacientes con COVID-19 potencialmente mortal. Ciencia 370, eabd4585 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

López, J. et al. La inmunidad temprana del IFN tipo I nasal contra el SARS-CoV-2 está comprometida en pacientes con autoanticuerpos contra los IFN tipo I. Exp. J. Medicina. 218, e20211211 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solanich, X. et al. Autoanticuerpos preexistentes que neutralizan altas concentraciones de interferones tipo I en casi el 10% de los pacientes con COVID-19 ingresados ​​en cuidados intensivos en Barcelona. J. Clin. inmunol. 41, 1733-1744 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Wijst, MGP et al. Los autoanticuerpos interferón tipo I están asociados con alteraciones inmunológicas sistémicas en pacientes con COVID-19. ciencia Traducir Medicina. 13, eabh2624 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, Q. et al. Errores congénitos de la inmunidad IFN tipo I en pacientes con COVID-19 potencialmente mortal. Ciencia 370, eabd4570 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arunachalam, PS et al. Evaluación biológica de sistemas de inmunidad a la infección leve versus grave por COVID-19 en humanos. Ciencia 369, eabc6261 (2020).

Artículo Google Académico

Liu, C. et al. La inmunología de sistemas resueltos en el tiempo revela una coyuntura tardía relacionada con el fatal COVID-19. Celda 184, 1836–1857.e22 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shebl, FM et al. Comparación de las medidas de ARNm y proteínas de las citocinas después de la vacunación con partículas similares al virus L1 del virus del papiloma humano-16. Epidemiología del cáncer. Biomarcadores ant. 19, 978–981 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waggoner, JJ et al. Triplex RT-PCR en tiempo real para el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2. Emerg. Infectar. Dis. 26, 1633-1635 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolfel, R. et al. Evaluación virológica de pacientes hospitalizados con COVID-2019. Naturaleza 581, 465–469 (2020).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Kuri-Cervantes, L. et al. Mapeo integral de perturbaciones inmunes asociadas con COVID-19 severo. ciencia inmunol. 5, eabd7114 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGary, CS et al. Las células T CD4 (+) de memoria CTLA-4 (+) PD-1 (-) contribuyen de manera crítica a la persistencia viral en macacos rhesus infectados con SIV y suprimidos por terapia antirretroviral. Inmunidad 47, 776–788.e5 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Micci, L. et al. La interleucina-21 combinada con ART reduce la inflamación y el reservorio viral en macacos infectados con SIV. J. Clin. Invertir. 125, 4497–4513 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada de cambio de pliegue y dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 550 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Subramanian, A. et al. Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes: un enfoque basado en el conocimiento para interpretar perfiles de expresión de todo el genoma. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 102, 15545–15550 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandler, NG et al. Las respuestas de interferón tipo I en macacos rhesus previenen la infección por SIV y retrasan la progresión de la enfermedad. Naturaleza 511, 601–605 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blighe, K., Rana, S. & Lewis, M. EnhancedVolcano: diagramas de volcanes listos para publicación con colores y etiquetado mejorados. https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano (2020).

Gu, Z., Eils, R. & Schlesner, M. Los mapas de calor complejos revelan patrones y correlaciones en datos genómicos multidimensionales. Bioinformática 32, 2847–2849 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E. y Satija, R. Integración de datos transcriptómicos unicelulares en diferentes condiciones, tecnologías y especies. Nat. Biotecnología. 36, 411–420 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang-Huau, TL et al. Las células dendríticas derivadas de monocitos y los macrófagos generados in vivo humanos presentan antígenos cruzados a través de una vía vacuolar. Nat. común 9, 2570 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak, G. et al. MAST: un marco estadístico flexible para evaluar los cambios transcripcionales y caracterizar la heterogeneidad en los datos de secuenciación de ARN de una sola célula. Genoma Biol. 16, 278 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Andreatta, M. & Carmona, SJ UCell: puntuación robusta y escalable de firmas de genes unicelulares. computar Estructura. Biotecnología. J. 19, 3796–3798 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay, AA & Tharp, GK TREM2+ y macrófagos de tipo intersticial orquestan la inflamación de las vías respiratorias en la infección por SARS-CoV-2 en macacos rhesus, NHP_COVID-19_2. https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_2; https://doi.org/10.5281/zenodo.7626608 (2023).

Descargar referencias

Agradecemos amablemente al Director del Centro Nacional de Investigación de Primates de Emory (ENPRC), Paul Johnson; División de Recursos Animales, especialmente Joyce Cohen, Stephanie Ehnert, Stacey Weissman, Sherrie Jean, Jennifer S. Wood, Fawn Connor-Stroud, Rachelle L. Stammen, Racquel A. Sampson-Harley, Denise Bonenberger, John M. Wambua, Dominic M D'Urso y Sanjeev Gumber por brindar apoyo en el cuidado y patología de los animales. Además, agradecemos a Kalpana Patel y Maureen Thompson por su orientación sobre bioseguridad y a Ernestine Mahar, Kyndal Goss, Christina Gavegano y Sudhir Kasturi por su apoyo técnico, computacional y de citometría. Agradecemos a Raymond F. Schinazi por proporcionarnos el baricitinib y el virus, así como la idea original. Pedimos disculpas por las publicaciones clave omitidas debido a limitaciones de espacio. Oficina de NIH de Programas de Infraestructura de Investigación (ORIP) P51 OD11132 que proporciona financiamiento de subvención base a ENPRC y Emory NPRC Genomics Core; y P51 OD11132-61S1 y P51 OD11132-60S4 a M.Pa. Emory University COVID-19 Molecules and Pathogens to Populations and Pandemics (MP3) Initiative Seed Grant to M.Pa., AP, and RFS YNPRC Coronavirus Pilot Research Project Program grant (to M.Pa. under grant P51 OD11132). Fast Grants #2144 a M.Pa. La Beca de la Fundación William IH y Lula E. Pitts para M.Pa. Subvención NIH 5R01-MH-116695 otorgada a RFS Los datos de secuenciación se adquirieron en un Illumina NovaSeq6000 financiado por NIH S10 OD026799 a SEB Nos gustaría dedicar este manuscrito al Dr. Timothy N. Hoang, cuyo compromiso con este proyecto y el descubrimiento científico fueron crucial para impulsar este estudio. El Dr. Hoang será recordado por su inteligencia, empuje y amor por la ciencia y por todas las vidas que tocó durante su corta pero impactante carrera.

Estos autores contribuyeron igualmente: Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Mirko Paiardini, Steven E. Bosinger.

Fallecido: Timothy N. Hoang.

División de Microbiología e Inmunología, Centro Nacional de Investigación de Primates de Emory, Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang, Maria Pino, Michelle Y.-H. Lee, Zachary Strongin, Justin L. Harper, Christopher T. Edwards, Kevin Nguyen, Rama R. Amara, Thomas H. Vanderford, Mirko Paiardini y Steven E. Bosinger

Emory NPRC Genomics Core Laboratory, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, EE. UU.

Arun K. Boddapati, David A. Cowan, Elizabeth N. Beagle, Tristan R. Horton, Sydney Hamilton, Hadj Aoued, Kathryn L. Pellegrini y Gregory K. Tharp

Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Jacqueline Corry y Simon M. Barratt-Boyes

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina, Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Anne Piantadosi, Susan P. Ribeiro, Rafick P. Sekaly, Mirko Paiardini y Steven E. Bosinger

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Rebeca D. Levitt

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de Emory, Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Rama R. Amara

Departamento de Inmunología, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Simon M. Barratt-Boyes

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad de Emory y Children's Healthcare of Atlanta, Atlanta, GA, EE. UU.

Raymond F Schinazi

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Conceptualización: AAU, TNH, EGV, M. Pino, M. Paiardini, RFS y SEB; Metodología: TNH, M. Pino, EGV, SPR, MY-HL, JC, ZS, DAC, ENB, TRH, SH, HA, JLH, KN, KLP, AP, RDL y THV; Análisis formal: AAU, TNH, M. Pino, AKB, MY-HL, CTE, ZS, EGV, GKT y THV; Investigación: AAU, EGV, TNH, M. Pino, M. Paiardini y SEB; Recursos: SEB, SMBB, RRA, RFS, RPS, M. Paiardini y SEB; Redacción—Borrador original: AAU, M. Pino y SEB; Redacción, revisión y edición: TNH, SPR, EGVM Paiardini y RFS Visualización: AAU, TNH, M. Pino, AKB y GKT Supervisión: M. Paiardini y SEB; Adquisición de fondos: M. Paiardini, SEB y RFS

Correspondencia a Mirko Paiardini o Steven E. Bosinger.

RFS se ha desempeñado en el pasado como consultor no remunerado de Eli Lilly, cuyos medicamentos se están evaluando en la investigación descrita en este documento, y posee acciones en Eli Lilly. También recibe regalías por las ventas de Baricitinib para COVID-19 en EE. UU. y México. Los términos de este acuerdo han sido revisados ​​y aprobados por la Universidad de Emory de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. Todos los demás autores no tienen ningún conflicto que declarar.

Nature Communications agradece a Jincun Zhao y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Upadhyay, AA, Viox, EG, Hoang, TN et al. TREM2+ y los macrófagos de tipo intersticial orquestan la inflamación de las vías respiratorias en la infección por SARS-CoV-2 en macacos rhesus. Nat Comun 14, 1914 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

Descargar cita

Recibido: 04 Octubre 2021

Aceptado: 16 de marzo de 2023

Publicado: 06 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.