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May 04, 2023

La microbiota intestinal contribuye a la patogenia de la anorexia nerviosa en humanos y ratones

microbiología de la naturaleza volumen 8,

Nature Microbiology volumen 8, páginas 787–802 (2023) Citar este artículo

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La anorexia nerviosa (AN) es un trastorno alimentario con una alta mortalidad. Alrededor del 95% de los casos son mujeres y tiene una prevalencia poblacional de alrededor del 1%, pero falta un tratamiento basado en la evidencia. La patogenia de la AN probablemente involucra la genética y varios factores ambientales, y se ha observado una microbiota intestinal alterada en individuos con AN usando secuenciación de amplicón y cohortes relativamente pequeñas. Aquí investigamos si una microbiota intestinal alterada contribuye a la patogénesis de la AN. La metagenómica y la metabolómica de escopeta se realizaron en muestras de heces y suero, respectivamente, de una cohorte de 77 mujeres con AN y 70 mujeres sanas. Múltiples taxones bacterianos (por ejemplo, especies de Clostridium) se alteraron en AN y se correlacionaron con estimaciones del comportamiento alimentario y la salud mental. El viroma intestinal también se alteró en AN, incluida una reducción en las interacciones virales y bacterianas. Los módulos funcionales bacterianos asociados con la degradación de los neurotransmisores se enriquecieron en AN y varias variantes estructurales en bacterias se vincularon con características metabólicas de AN. La metabolómica sérica reveló un aumento en los metabolitos asociados con la reducción de la ingesta de alimentos (por ejemplo, ácido indol-3-propiónico). Los análisis de inferencia causal implicaron que los metabolitos bacterianos séricos median potencialmente el impacto de una microbiota intestinal alterada en el comportamiento de la AN. Además, realizamos un trasplante de microbiota fecal de casos de AN a ratones libres de gérmenes con alimentación restringida en energía para reflejar el comportamiento alimentario de AN. Descubrimos que la reducción del aumento de peso y la expresión génica inducida del tejido adiposo e hipotalámico estaban relacionadas con el metabolismo energético aberrante y el comportamiento alimentario. Nuestros estudios "ómicos" y mecanicistas implican que un microbioma intestinal disruptivo puede contribuir a la patogénesis de la AN.

La anorexia nerviosa (AN) es una afección de salud mental grave y un trastorno de la alimentación caracterizado por una imagen corporal distorsionada, pensamientos obsesivos sobre la comida, patrones rituales de comportamiento que incluyen una ingesta reducida de alimentos, pérdida de peso corporal, aumento de la actividad física y rigidez emocional1. La AN afecta principalmente a mujeres en alrededor del 95% de los casos y tiene una prevalencia poblacional de alrededor del 1%2. Se puede clasificar en dos subtipos, el tipo restrictivo común (AN-RS) y el tipo menos frecuente de atracones o purgas (AN-BP)1. Falta la base de evidencia para el tratamiento3 y aunque el tratamiento multidisciplinario especializado puede reducir la mortalidad4, menos de la mitad de los casos de AN logran una remisión completa5. La tasa de mortalidad agregada se estima en 5,6% por década, muy superior a la de la población general6.

A pesar de las investigaciones para determinar la etiología de la AN, sigue siendo un síndrome, es decir, un conjunto de síntomas sin una causa unificadora bien definida. Los estudios de gemelos informaron estimaciones de heredabilidad del 50% al 60%7 y los estudios de asociación del genoma completo identificaron ocho loci genómicos que muestran correlaciones con trastornos psiquiátricos, actividad física y rasgos metabólicos y antropométricos. Esto es independiente de las variantes comunes asociadas con el índice de masa corporal8,9. A nivel fisiopatológico, la AN se caracteriza por múltiples cambios endocrinos10 y señalización perturbada de neurotransmisores en diversas partes del cerebro11.

El tracto digestivo humano contiene ensamblajes complejos de microorganismos que pueden afectar el metabolismo, la inmunidad y la neurobiología del huésped a través de metabolitos y otras vías12. Esto puede incluir el eje intestino-microbiota-cerebro, que puede afectar las funciones cerebrales, incluida la regulación del apetito, el comportamiento y las emociones13. Por ejemplo, el metabolito bacteriano caseinolítico peptidasa B (ClpB), producido predominantemente por enterobacterias, es un mimético antigénico de la hormona estimulante de los melanocitos α, que puede ejercer efectos anorexigénicos14,15.

Se ha planteado la hipótesis de que una microbiota intestinal aberrante puede estar involucrada en la patogenia de la AN. Se han publicado varios estudios pequeños que utilizaron la secuenciación de amplicón para caracterizar la microbiota intestinal a nivel de género en AN16,17,18,19, que muestran disbiosis de la microbiota bacteriana intestinal (consulte la Nota complementaria 1). Además, en un modelo de anorexia en ratones, se ha demostrado que los cambios en la microbiota intestinal están asociados con cambios en el comportamiento alimentario y la expresión de neuropéptidos hipotalámicos20.

Aquí exploramos la hipótesis de que una microbiota intestinal perturbada y un metaboloma sérico contribuyen a la compleja patogénesis de la AN. Para hacerlo, realizamos metagenómica de escopeta en muestras fecales de 77 casos femeninos de AN y 70 controles femeninos de la misma edad, lo que permitió realizar análisis en profundidad de la microbiota bacteriana intestinal y arqueológica a nivel taxonómico, funcional y genético, así como análisis de la microbiota intestinal viral. También caracterizamos el metaboloma sérico, que se analizó con los datos del metagenoma intestinal en relación con los marcadores individuales del comportamiento alimentario y psicológico. Los mecanismos causales se exploraron in silico utilizando análisis de mediación bidireccional e in vivo a través del trasplante de microbiota fecal (FMT) de microbiota intestinal de casos de AN a compañeras de camada hembra libres de gérmenes. Nuestros hallazgos respaldan la hipótesis de que una microbiota intestinal alterada con AN y los metabolitos bacterianos asociados contribuyen a la patogénesis de la AN (datos ampliados, figura 1).

Las estadísticas resumidas de las características clínicas de las 77 mujeres inscritas con AN y las 70 mujeres de control emparejadas por edad consideradas con un peso saludable (HC) se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Se utilizó el cuestionario validado del Inventario de trastornos alimentarios-3 (EDI-3). para estimar los niveles de comportamiento alimentario específico21 y una descripción detallada de la subescala EDI-3 se muestra en la Nota complementaria 2. Como se esperaba, las mujeres con AN eran mucho más delgadas, tenían concentraciones séricas de glucosa e insulina en ayunas más bajas, mayor sensibilidad a la insulina según lo estimado por Evaluación del modelo homeostático para la resistencia a la insulina (HOMA-IR) y proteína C reactiva sérica inferior. Las características iniciales detalladas de los participantes del estudio se muestran en la Tabla complementaria 2. Además, dentro de los casos de AN, los casos de tipo AN-RS se caracterizaron por valores más altos de insulina sérica y una menor sensibilidad a la insulina que los individuos AN-BP (Tabla complementaria 1). Al comparar muestras de heces de AN y HC, no hubo diferencias significativas en los recuentos de células bacterianas entre AN y HC o dentro de los subtipos de AN (PWilcoxon> 0.05, Tabla complementaria 1).

A nivel de filo, las muestras de microbiota de AN se caracterizaron por una reducción de Bacteroidota y Actinobacteriota (Datos ampliados, Fig. 2a). A nivel de familia, Bacteroidaceae fue dominante en ambos grupos (Datos extendidos Fig. 2b). Entre las 20 familias más abundantes, la abundancia de Christensenellales CAG-138 fue mayor en AN como una nueva observación para esta cohorte, mientras que la abundancia de Ruminococcaceae y Lachnospiraceae fue mayor en HC. Entre las 89 familias bacterianas identificadas, Christensenellaceae fue la más significativamente enriquecida en AN (Datos extendidos Fig. 2c). Observamos una mayor diversidad β del microbioma AN a nivel de género (Datos extendidos Fig. 2d), siendo Bacteroides el filotipo dominante en ambos grupos (Datos extendidos Fig. 2e). Entre los 30 géneros principales, Faecalibacterium, Agathobacter, Gemmiger, Lachnospiraceae G sin clasificar, Ruminococcus 2, Roseburia, Dysosmobacter – Oscillibacter, Coprococcus, Oscillospirales 4 CAG-103 y Eisenbergiella fueron más abundantes en HC, mientras que Christensenellales CAG-138 sin clasificar fue más abundante en AN (Datos extendidos Fig. 2e). Además, entre los 225 géneros bacterianos identificados, Lactobacillus fue el más significativamente enriquecido en AN (Datos extendidos Fig. 2f). A pesar de la diferencia en los géneros principales entre AN y HC, encontramos que la riqueza de pangenomas de especies metagenómicas (MSP, en lo sucesivo denominadas especies) fue similar entre los dos grupos (Datos extendidos Fig. 2g). En los análisis de enterotipo22, encontramos una mayor prevalencia del enterotipo Ruminococcacea (enterotipo R) en AN en comparación con HC, y una mayor prevalencia del mismo enterotipo en AN-BP que en el subtipo AN-RS (Datos extendidos Fig. 2h) .

A nivel de especie (Tabla complementaria 3), observamos que la microbiota intestinal de AN se caracteriza por una mayor diversidad β (Fig. 1a). Dentro de los subgrupos de AN, el subtipo AN-BP tenía una comunidad bacteriana más heterogénea a nivel de especie que el subtipo AN-RS (Fig. 1b). En la comparación entre los casos de AN de pacientes hospitalizados y ambulatorios, encontramos que la diversidad β de los pacientes hospitalizados era mayor que la de los pacientes ambulatorios a nivel de especie (Figura 1 y datos complementarios). El cambio reciente de peso corporal dentro de las 4 semanas no se asoció con la composición bacteriana intestinal (Tabla complementaria 4). Las especies que fueron significativamente diferentes en la distribución de abundancia entre AN y HC después de desconfundir las interferencias de múltiples medicamentos (inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, antipsicóticos y benzodiazepinas, especificados en la Tabla complementaria 2) se muestran en la Fig. 1c. Entre las especies mermadas en AN se encuentran Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans, especies que tienen una alta capacidad para digerir polisacáridos vegetales y se consideran parte de la microbiota intestinal relacionada con la salud23. En un análisis de red no dirigido de coabundancia (datos extendidos, Fig. 3), identificamos una comunidad bacteriana que consiste en Eisenbergiella, bacteria productora de butirato SS3/4 - (Clostridium) sp. CAG:81, Faecalibacterium prausnitzii 3, (Oscillibacter) sp. ER4/Firmicutes bacteria CAG: 129_59_24, Oscillibacter sp. 57_20, (Clostridium) sp. 2789STDY5834924, Lachnospiraceae sin clasificar y Dysosmobacter – Oscillibacter sin clasificar, que fue más abundante en HC. Una comunidad altamente enriquecida en AN estuvo compuesta por Erysipelatoclostridium ramosum, Enterocloster bolteae, (Clostridium) innocuum y Blautia sp. CAG:257.

a, b Diagrama de caja (línea, mediana; caja, rango intercuartílico (RIC); bigotes, 1,5 × RIC) de la diversidad β de la microbiota intestinal AN (n = 77) y HC (n = 70) (a) y de dos Subtipos AN (AN-RS n = 56, AN-BP n = 21) y microbiota intestinal HC (b) a nivel de especie bacteriana (distancia de Canberra). La significación estadística de las diferencias entre dos grupos se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (bilateral). c, Especies bacterianas significativamente contrastadas entre AN y HC. Las diferencias en la abundancia se detectaron utilizando la canalización metadeconfoundR donde se corrigieron las covariables que incluyen la edad, el IMC, el tabaquismo y la ingesta de múltiples drogas. Los valores delta de Cliff dan estimaciones del tamaño del efecto. Para cada MSP contrastado, la prevalencia en toda la cohorte, HC, AN y Padj se dan junto a la anotación de MSP. d, Mapa de calor que muestra que las especies de bacterias intestinales están vinculadas a las puntuaciones de trastornos alimentarios en los casos de AN, utilizando un modelo de regresión lineal en el que la edad, el IMC, el tabaquismo y la ingesta de múltiples fármacos se definieron como covariables y se ajustaron. Las variables en la escala de trastornos alimentarios específicos están marcadas en azul y la escala psicológica general está marcada en rojo. El panel derecho del mapa de calor indica la dirección de cada variable. Para cada MSP, la prevalencia en AN se proporciona junto a la anotación de MSP. +, Padj < 0,05 por el método de Benjamini-Hochberg (consulte los valores de P exactos).

Datos fuente

Investigamos las covariaciones numéricas entre la abundancia absoluta de bacterias a nivel de género y especie y las variables bioclínicas en la cohorte combinada de HC y AN. Utilizamos un modelo de regresión lineal ajustado por factores de confusión que incluyen la edad, el tabaquismo y la ingesta de múltiples drogas (Métodos y Nota complementaria 3, Fig. 2 y Datos).

Curiosamente, algunos taxones bacterianos se vincularon con puntajes de trastornos alimentarios y condiciones psicológicas después de ajustar múltiples factores de confusión, como la edad, el índice de masa corporal (IMC), el historial de tabaquismo y los medicamentos. A nivel de especies, encontramos que las especies de Clostridium se correlacionaron positivamente con las puntuaciones de los trastornos alimentarios (Fig. 1d), lo que indica un papel potencial de estas especies en la regulación del comportamiento alimentario y los síntomas neuropsiquiátricos24. Además, entre las especies bacterianas que se correlacionaron inversamente con las puntuaciones del trastorno alimentario, encontramos que las abundancias absolutas de Lactococcus acidophilus25 y Faecalibacterium prausnitzii26, ambas asociadas con síntomas depresivos, estaban relacionadas con una puntuación de alienación interpersonal (Fig. 1d) . Además, la abundancia absoluta de Parasutterella se correlacionó positivamente con la insatisfacción corporal y la abundancia absoluta de Bifidobacterium se correlacionó con un marcador de perfeccionismo. A pesar de una abundancia absoluta similar de Brachyspira en AN y HC, este género se correlacionó positivamente con marcadores de 'impulso por la delgadez' en AN (Datos extendidos Fig. 4). Como se muestra en la Fig. 5 de datos extendidos, no encontramos diferencias en los niveles circulantes de ClpB14 anorexigénico entre los grupos AN y HC (Nota complementaria 4).

Estimamos la dinámica de crecimiento de la microbiota intestinal bacteriana a partir de los datos metagenómicos mediante el cálculo de la relación pico-mínimo (PTR)27 para 50 especies bacterianas. Treinta y cinco de estos estaban presentes en más de 20 muestras. Los valores medianos de PTR diferían notablemente entre AN y HC (PWilcoxon = 2,0 × 10−4, datos extendidos, figura 6), lo que podría estar relacionado con la reducción severa en la ingesta de alimentos en pacientes con AN. Se predijo que seis bacterias tendrían una tasa de crecimiento significativamente más baja en AN (PWilcoxon < 0,05, Datos ampliados, Fig. 6). Estos fueron Akkermansia muciniphila, Alistipes finegoldii, Coprococcus catus, Eubacterium siraeum, Odoribacter splanchnicus y la bacteria productora de butirato SS3/4.

Observamos una mayor riqueza viral (Chao1, Fig. 2a) y diversidad (Shannon, Fig. 2b) en muestras fecales de AN en comparación con HC. El cambio reciente de peso corporal dentro de las 4 semanas no se asoció con la composición viral intestinal (Tabla complementaria 4). Después de desconfundir las covariables (edad, tabaquismo y consumo de drogas), identificamos 31 especies virales que se enriquecieron o disminuyeron en AN (Fig. 2c). De gran interés, 25 de las 30 especies virales aumentadas en AN eran fagos de Lactococcus con huéspedes conocidos de Lactococcus lactis, bacterias que se han utilizado ampliamente en la producción de productos alimenticios fermentados.

a, b, Diagrama de caja (línea, mediana; caja, IQR; bigotes, 1.5× IQR) de cambios en la riqueza de Chao1 (a) y la diversidad de Shannon (b) de la microbiota intestinal viral entre AN (n = 77) y HC ( n = 70) a nivel de especie viral. La significación se examinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos caras (a, b). c, valores delta de Cliff de especies virales intestinales contrastadas entre AN y HC con Padj < 0,05 según la corrección de Benjamini-Hochberg (dado junto a la anotación viral). Las especies diferenciales se identificaron mediante la canalización metadeconfoundR, donde se desconfundieron los impactos de los cofactores, incluidos la edad, el tabaquismo y la ingesta de múltiples drogas. d, Diferencia en el número de correlaciones ecológicas trans-reino entre la microbiota intestinal viral y bacteriana en AN (n = 77) en comparación con HC (n = 70), y entre dos subtipos de AN (AN-RS n = 56, AN-BP n = 21) utilizando el algoritmo SparCC.

Datos fuente

El análisis de las correlaciones virales y bacterianas dentro de la microbiota intestinal de AN y HC reveló una disminución notable en el número de interacciones virales y bacterianas en AN (219 para HC versus 84 para AN, prueba exacta de PFisher = 8.8 × 10−15, Fig. 2d) . Esto se debió principalmente a interacciones debilitadas entre especies virales y productores de bacterias de ácidos grasos de cadena corta, como Roseburia inulinivorans, Faecalibacterium prausnitzii y Roseburia hominis (Figura 3 y datos complementarios). No observamos ninguna interacción entre los fagos de Lactococcus y las bacterias Lactococcus en el análisis trans-reino (Figuras complementarias 3 y 4 y Datos).

En los análisis de los subgrupos de AN, el análisis de coordenadas principales (PCoA) en la distancia de Canberra no mostró alteraciones notables en la composición viral intestinal (PPERMANOVA = 0,571, Fig. 5 y datos complementarios). Sin embargo, al comparar el número de correlaciones virales-bacterianas en la microbiota intestinal AN-RS y AN-BP, encontramos una reducción en el número y una proporción mucho menor de correlaciones positivas en AN-RS (164 para AN-BP versus 44 para AN-RS, prueba exacta de PFisher <2.2 × 10−16) (Fig. 2d y Fig. 4 complementaria). Esto sugiere que la microbiota intestinal en AN-RS ha debilitado las interacciones virales-bacterianas intestinales.

Usando módulos metabólicos intestinales (GMM)28 y módulos cerebrales intestinales (GBM)29 para predecir los potenciales funcionales bacterianos intestinales, identificamos 159 módulos funcionales. En particular, la abundancia de GBM para la biosíntesis de serotonina y la degradación de dopamina, glutamato y triptófano, que son metabolitos con efectos sobre el estado de ánimo y el apetito, se enriquecieron en AN (Fig. 3a). Por el contrario, la abundancia de las vías de síntesis de glutamato II y vitamina K2 fue mayor en HC (Fig. 3a)30. Además, encontramos que las vías de síntesis de serotonina y degradación del glutamato estaban inversamente correlacionadas con las concentraciones circulantes de glucosa e insulina, o la sensibilidad a la insulina (Fig. 3b). Si bien observamos diferencias en los GBM, no identificamos diferencias en los GMM entre AN y HC (Tabla complementaria 5).

a, tamaño del efecto delta de Cliff de los módulos funcionales contrastados entre AN (n = 77) y HC (n = 70) usando la tubería metadeconfoundR donde se corrigieron las interferencias de covariables que incluyen edad, IMC, tabaquismo y consumo de múltiples drogas. Lingotes de oro, módulos funcionales más abundantes en AN; barras azules, módulos funcionales más abundantes en HC. Para cada módulo contrastado, el valor P después de la corrección de Benjamini-Hochberg se proporciona junto a la anotación del módulo. b, Mapa de calor de las asociaciones entre las variables clínicas y los potenciales funcionales del bacterioma intestinal mediante un modelo de regresión lineal en el que se desconfundieron los efectos de las covariables, como la edad, el tabaquismo y la ingesta de múltiples fármacos. + indica P < 0,05 según la corrección de Benjamini-Hochberg (consulte los valores de P exactos).

Datos fuente

Los genomas bacterianos pueden tener variantes estructurales (SV) que potencialmente interfieren con los genes funcionales que afectan la interacción entre los microbios y su huésped31. Por lo tanto, las diferencias en la presencia o abundancia de SV entre cepas bacterianas por lo demás idénticas pueden ser la base de diferencias fenotípicas y funcionales críticas31,32. Aquí perfilamos los SV en todas las muestras e identificamos 5056 SV de deleción y 2423 SV variables en 56 especies bacterianas (Fig. 4a, b). Para algunas especies, observamos marcadas diferencias en la variación del número de copias. Identificamos 87 deleciones SV y 18 variables SV en Bacteroides uniformis en 134 individuos, 78 deleciones y 15 variables SV en Faecalibacterium prausnitzii en 124 individuos, y 110 deleciones SV y 55 variables SV en Parabacteroides distasonis en 121 individuos. Para la microbiota arqueológica, solo identificamos SV en Methanobrevibacter smithii en 13 individuos (Fig. 4a y Fig. 6 y datos complementarios). Para explorar las posibles diferencias en la genética bacteriana, calculamos aún más la distancia de Canberra de los perfiles SV bacterianos entre las 147 muestras (Fig. 4c). Las muestras de AN y HC fueron significativamente diferentes en la diversidad β de la composición de SV (PWilcoxon <2.2 × 10−16). En conjunto, estos resultados sugieren que la composición de las SV bacterianas difiere entre los dos grupos.

a, Número de SV de cada especie bacteriana o archaeal en 147 (77 casos y 70 controles) participantes del estudio. Para cada especie, se proporciona el número de deleciones y SV variables. b, gráfico circular que muestra el número total de SV identificados. c, Diagrama de caja (línea, mediana; caja, IQR; bigotes, 1,5 × IQR) de la diversidad β (distancia de Canberra) de la composición genética basada en SV en el bacterioma AN (n = 77) y HC (n = 70). El valor de p se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral. d, Diagrama de cuerdas que muestra asociaciones significativas entre las puntuaciones de los trastornos alimentarios y las SV bacterianas después de ajustar por edad, IMC, tabaquismo y consumo de múltiples drogas. e, Mapa de calor que muestra las asociaciones entre los SV de Bacteroides uniformis y las puntuaciones EDI-3 utilizando un modelo de regresión lineal donde se desconfundieron los impactos de la edad, el IMC, el tabaquismo y la ingesta de múltiples drogas. + indica P < 0,05 corregido por Benjamini-Hochberg (consulte los valores de P exactos). En d y e, las variables de la escala de trastornos alimentarios están coloreadas en azul, la escala psicológica general está en rojo y las SV bacterianas están en negro. f, La tasa de deleción del SV de deleción de 10 kpb que alberga tiamina-monofosfato quinasa en el genoma de B. uniformis en el grupo AN. g, diagrama de caja (línea, mediana; caja, IQR; bigotes, 1,5 × IQR) que muestra las puntuaciones EDI-3 en personas con anorexia con (n = 49) y sin (n = 28) la eliminación de 10 kbp. La significación se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (bilateral).

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Al explorar las relaciones entre los SV bacterianos intestinales y los marcadores del comportamiento alimentario, encontramos que en los casos de AN, los SV bacterianos se asociaron significativamente con las puntuaciones del trastorno alimentario después de desconfundir múltiples covariables (Fig. 4d). Como ejemplo digno de mención, en el análisis de asociación entre los SV en el genoma de B. uniformis y las puntuaciones de alimentación del huésped, encontramos que una deleción de 10 kpb se asoció directamente con marcadores de bulimia y abnegación, lo que indica que esta deleción SV puede estar involucrada. en la regulación del trastorno alimentario y los rasgos psicológicos en AN (Fig. 4e). De hecho, el análisis de genes mostró que el comienzo de esta región genómica específica en B. uniformis codifica una tiamina-monofosfato quinasa (Fig. 4f y Tabla complementaria 6), que es la enzima distal involucrada en la ruta de biosíntesis de tiamina (vitamina B1). La deficiencia de tiamina se ha asociado con la salud mental, incluida la pérdida de memoria, la ansiedad, la depresión, la irritabilidad, el insomnio, así como con la pérdida del apetito y las molestias gastrointestinales33. Alrededor de un tercio de los casos de AN pueden sufrir deficiencia de tiamina34. Descubrimos que los casos de AN que carecían de esta región genómica bacteriana tenían puntajes más altos para bulimia (una característica clave para el subtipo AN-BP) y abnegación (Fig. 4g), un patrón también sugerido por nuestros análisis de correlación (Fig. 4e). Otro ejemplo que vincula la genética bacteriana con las variables bioclínicas relacionadas con el metabolismo se proporciona en (Datos extendidos Fig. 7) y la Nota complementaria 5.

Realizamos perfiles metabolómicos no dirigidos de suero de casos y controles de AN. Esto reveló un perfil de metaboloma sérico que consta de 28 metabolitos polares y 35 metabolitos relacionados con la microbiota, que fue significativamente diferente entre AN y HC (Fig. 5a), mientras que solo se alteró ligeramente entre los dos subtipos de AN (Datos extendidos Fig. 8a). Identificamos 25 metabolitos séricos con diferencias de concentración entre casos y controles después de ajustar los factores de confusión (valor de P ajustado (Padj) <0,05) (Fig. 5b).

a, Análisis de componentes principales (PCA) del perfil del metaboloma sérico de casos de AN y participantes de HC. b, valores delta de Cliff de metabolitos contrastados entre AN (n = 77) y HC (n = 70) después de ajustar por edad, IMC, tabaquismo y consumo de múltiples drogas. Las piruletas doradas son metabolitos enriquecidos en AN, y las piruletas azules muestran metabolitos séricos enriquecidos en HC. c, Flujo de trabajo para el análisis de mediación bidireccional para características microbianas intestinales, metabolitos séricos y fenotipos del huésped. d, diagrama de Sankey que muestra la red de relación causal inferida de la dirección 1 donde las características microbianas intestinales, incluidas las especies bacterianas, los módulos metabólicos/cerebrales intestinales y la genética bacteriana, se trataron como factores causales, los metabolitos son mediadores y las puntuaciones EDI-3 son resultados. e, Ejemplos de relaciones causales inferidas entre características microbianas, metabolitos y puntajes EDI-3. Dirección 1 significa características microbianas → puntajes de trastornos alimentarios mediados por metabolitos, ilustrados con una línea negra; la dirección 2 significa características microbianas → metabolitos mediados por puntajes EDI-3, ilustrados con una línea roja discontinua. Las proporciones de los efectos de la mediación se muestran en el centro de los gráficos circulares. FFA, ácido graso libre.

Datos fuente

Concentraciones séricas de ácidos primarios (ácido cólico (CA), ácido glucocólico (GCA)) y ácidos biliares secundarios (ácido glucohiocólico (GHCA), ácido 7-oxo-hiocólico (7-oxo-HCA), ácido glucohiocólico (GHDCA), 7 -ácido oxo-desoxicólico (7-oxo-DCA), ácido ω/α-muricólico (ω/α-MCA), ácido ursodesoxicólico (UDCA)) fueron más altos en la AN, lo que indica un papel potencial de la microbiota intestinal en la AN relacionada con la AN. cambios en la síntesis y metabolismo de ácidos biliares secundarios, y regulación de la saciedad35. Además, las concentraciones séricas de ácido indol-3-acético y ácido indol-3-propiónico (IPA), dos metabolitos del triptófano, fueron más altas en AN en comparación con HC. Curiosamente, el IPA está asociado con la secreción del péptido 1 similar al glucagón, que puede estimular la saciedad y retrasar el vaciado gástrico36,37. También se observó una desregulación de valina, ácidos grasos insaturados de cadena larga y saturados en el grupo AN (Fig. 5b y Nota complementaria 6).

Para explorar el papel de los metabolitos séricos en la interacción entre la microbiota intestinal y los fenotipos del huésped, construimos modelos de mediación bidireccional. Para la dirección 1, planteamos la hipótesis de que los metabolitos séricos (incluidos los metabolitos relacionados con la microbiota) como variables median el efecto causal de las características microbianas intestinales (especies bacterianas, módulos cerebrales intestinales y genética bacteriana) en los fenotipos del huésped (Eating Disorder Inventory-3 (EDI-3 ) puntajes y características metabólicas). Para la dirección 2, tratamos los fenotipos como mediadores y las alteraciones en los metabolitos como resultado de cambios en las características microbianas (Fig. 5c). Este análisis bidireccional in silico nos permitió cuantificar hasta qué punto un mediador hipotético (un metabolito) participa en la interacción entre una causa (características microbianas) y su efecto (características fenotípicas del huésped).

Primero realizamos la inferencia causal de las características bacterianas en las puntuaciones del cuestionario EDI-3 en casos de AN (Datos extendidos Fig. 8b). Las relaciones causales inferidas en la dirección 1 consistieron en 13 características microbianas como iniciadores, 11 metabolitos como mediadores y 7 puntajes EDI-3 como resultados (Fig. 5d). Como ejemplo digno de mención, identificamos el 'impulso por la delgadez' como resultado de la especie bacteriana C. paraputrificum enriquecida con AN (Fig. 1c), que se vinculó con cambios en los niveles séricos de IPA, también enriquecidos en el grupo AN. C. paraputrificum es un productor de múltiples catabolitos de triptófano, incluidos IPA, ácido indolacrílico, ácido indolacético y triptamina, todos los cuales están involucrados en la regulación del apetito y la salud mental24 (Fig. 5e).

En otro ejemplo, el sulfato de indoxil, que estaba enriquecido en pacientes con AN, se identificó como un mediador de (Clostridium) sp. enriquecido con AN. CAG:269 en la puntuación de insatisfacción corporal (fig. 5e). El sulfato de indoxil es una toxina cardio y urémica, y se ha demostrado que induce comportamientos similares a la ansiedad o la depresión en modelos humanos y animales38,39. Clostridium es un género de bacterias productoras de indol que pueden codificar triptofanasa40, la enzima crítica que convierte el triptófano en indol, piruvato y amoníaco41.

A continuación, analizamos la inferencia causal entre las características microbianas y las características metabólicas del huésped en toda la cohorte (Datos ampliados, Fig. 8c). La red causal en la dirección 1 constaba de 14 características microbianas, 10 metabolitos y 5 características metabólicas como tratamientos causales, mediadores y resultados, respectivamente (Datos extendidos Fig. 8d). En particular, encontramos que el módulo de síntesis de serotonina afectó causalmente al IMC del huésped a través del ácido glicoursodesoxicólico de ácido biliar secundario, que está regulado al alza por la serotonina42 (Datos extendidos Fig. 8e). Finalmente, de acuerdo con nuestros hallazgos previos, la leucina sérica medió el impacto de B. vulgatus en la homeostasis de la glucosa43 (Datos extendidos Fig. 8e). No observamos una relación causal unidireccional entre los cambios en el comportamiento alimentario y el estado psicológico, las características microbianas intestinales y los metabolitos (Tabla complementaria 7).

Para investigar las posibles relaciones causales entre una microbiota intestinal alterada en AN y fenotipos relevantes, trasplantamos microbiota fecal de tres casos de AN-RS elegidos al azar (para lograr uniformidad ya que AN-BP tiene un fenotipo más heterogéneo que el subtipo AN-RS) y tres Participantes HC emparejados por edad con tres camadas independientes de ratones hembra libres de gérmenes (GF) (Datos extendidos Fig. 9a). Para minimizar las variaciones en los antecedentes genéticos, incluimos compañeros de camada como ratones de control. En cada estudio de camada, 8, 6 y 6 compañeros de camada, respectivamente, fueron asignados aleatoriamente como receptores de microbiota fecal AN o HC. Después del trasplante de heces, los ratones receptores se alojaron individualmente y recibieron una dieta restringida en calorías al 30 % durante 3 semanas para imitar la ingesta reducida de alimentos en la AN humana (datos extendidos, figura 9b). La alimentación con dieta ad libitum chow no generó ninguna alteración fenotípica en ratones GF44, una observación consistente con un informe anterior sobre kwashiorkor45 (Datos ampliados Fig. 10a).

Después de 21 días, los ratones GF trasplantados con heces de casos de AN mostraron una mayor disminución inicial en el peso corporal y un aumento de peso más lento con el tiempo en comparación con los ratones que recibieron HC FMT (Fig. 6a y Datos extendidos Fig. 10b; consulte la Nota complementaria 7 para discusión).

a, cambio de peso corporal (BW) en comparación con el peso corporal en el día 0 después de una dieta restringida en energía (AN-T n = 10, HC-T, n = 10 examinado en 3 experimentos independientes). La significación se calculó mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA), seguido de una prueba post hoc de Benjamini-Hochberg. b,c, niveles de ARNm de los genes de ratones indicados en hipotálamo (b) y tejido adiposo blanco inguinal (c) en los ratones receptores de microbiota fecal (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, examinados en 3 estudios independientes experimentos). La significación entre los dos grupos se probó utilizando la prueba t de Student de dos colas no pareadas. Los datos se presentan como media ± sem (a–c). d, diagrama de Venn de los ASV identificados y transferidos entre donantes humanos y receptores de ratón GF. e, Izquierda: mapa de calor de los 84 ASV conservados en donantes humanos. Medio: diferencias en los 84 ASV conservados derivados del contenido cecal entre los receptores de ratones AN-T y HC-T GF (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, examinados en 3 experimentos independientes). Las alteraciones microbianas transferidas están marcadas en azul. Derecha: información taxonómica de los ASV.

Datos fuente

Realizamos análisis de expresión génica hipotalámica después de FMT. Los receptores trasplantados con AN y trasplantados con HC diferían en la expresión de varios genes hipotalámicos involucrados en el control del comportamiento alimentario y el gasto de energía (Fig. 6b). Esto incluyó una mayor expresión de los supresores del apetito Bdnf46 y Cartpt47, y el receptor de serotonina, Htr1b (involucrado en la regulación posterior de la serotonina), en receptores de AN FMT. La expresión de Snca, que codifica la proteína neuronal alfa-sinucleína asociada con varias enfermedades neurodegenerativas, fue mayor en los ratones trasplantados con AN48. Además, analizamos los niveles de ARN mensajero (ARNm) de genes que codifican proteínas que regulan la termogénesis del tejido adiposo. Descubrimos que la abundancia de ARNm de Ucp1, Elovl3 y Pgc1α aumentó en la grasa inguinal de ratones trasplantados con AN, lo que indica una mayor termogénesis del tejido adiposo en este grupo de ratones (Fig. 6c).

La secuenciación de amplicón del gen del ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 16S de heces de donantes humanos y contenido cecal de receptor de ratón GF identificó 85 variantes de secuencia de amplicón superpuestas (ASV; Fig. 6d), de las cuales 45 (53%) ASV alterados en donantes se transfirieron a receptores ( Figura 6e). El perfil del metaboloma sérico detectó 31 metabolitos conservados entre donantes y receptores, y las alteraciones de 19 de estos (61 %) se transfirieron de humano a ratón (Datos ampliados, Fig. 10c). Identificamos tres ASV: ASV_021, ASV_229 y ASV_002 que fueron anotados como Bacteroides a nivel de género. La abundancia relativa de estos ASV y la expresión de los genes de pardeamiento, incluido Ucp1 (datos extendidos, Fig. 10d), se correlacionaron positivamente, lo que indica un papel potencial de estos ASV en la pérdida de peso corporal o un menor aumento de peso a través del pardeamiento adiposo mejorado. La correlación inversa entre la abundancia relativa de ASV_122, anotada como género Akkermansia, y el gen hipotalámico supresor del apetito Htr1b también es notable y sugiere un papel potencial de ASV_122 en la regulación del apetito (Datos extendidos Fig. 10d). En conjunto, las alteraciones en la expresión génica del tejido hipotalámico y adiposo y los cambios en el peso corporal a lo largo del tiempo en ratones sugieren que una microbiota intestinal alterada en la AN humana puede contribuir a algunos de los elementos en la compleja patogénesis de la AN.

Usando una combinación de secuenciación y metabolómica para caracterizar el microbioma intestinal y el metaboloma en humanos y ratones, mostramos que los componentes bacterianos y virales del microbioma y el metaboloma sérico están alterados en personas con AN en comparación con individuos sanos. También encontramos que las SV de las especies bacterianas son diferentes entre la AN y los controles sanos, y los análisis de inferencia causal in silico implican que los metabolitos bacterianos median algunos efectos de una microbiota intestinal alterada en el comportamiento de la AN. Finalmente, los ratones GF trasplantados con heces AN con una dieta restringida en energía inicialmente pierden más peso y tienen un aumento de peso más lento con el tiempo en comparación con los ratones trasplantados con heces de individuos sanos. Esto se asoció con una mayor expresión de genes supresores del apetito en el hipotálamo y una mayor expresión de genes relacionados con la termogénesis en tejido adiposo de ratones trasplantados con AN.

Tanto en los experimentos FMT como en los análisis de inferencia in silico, observamos cambios en los niveles circulantes de ácido glicina-quenodesoxicólico, ácido indol-3-propiónico, ácido taurina-α-muricólico y ácido taurina-hiodesoxicólico. Proponemos que estos metabolitos pueden actuar como mediadores potenciales de algunos de los fenotipos de AN. Por ejemplo, el ácido indol-3-propiónico es un metabolito del triptófano, que está implicado en la actividad de la serotonina49, y el ácido hiodesoxicólico es un ácido biliar 6α-hidroxilado, también llamado ácido muricólico, que reduce el aumento de peso corporal50. Este ácido biliar está implicado en la regulación de la saciedad51. La actividad de la serotonina, así como la regulación del apetito, podrían estar implicadas en el desarrollo y/o mantenimiento del síndrome AN. Los estudios futuros deberán explorar los efectos individuales y combinados de estos metabolitos en el metabolismo energético. Aún así, muchas más especies de bacterias intestinales y metabolitos derivados pueden mediar los rasgos de AN observados en humanos y ratones, como se informó en un modelo de anorexia basado en la actividad20,52.

Los análisis de deleción y SV variables en especies de bacterias intestinales indicaron que la genética bacteriana puede influir en los rasgos de comportamiento y la fisiopatología relevantes para la AN. De especial interés es una deleción de 10 kpb en el genoma de B. uniformis que se asoció con estimaciones de bulimia y abnegación. Predijimos que esta eliminación da como resultado la pérdida de un gen que codifica la tiamina-monofosfato quinasa, lo que puede resultar en una deficiencia relativa de tiamina producida por la microbiota. Esto es de interés en el contexto de la patología AN, ya que se sabe que varios problemas de salud mental e intestinal están relacionados con la deficiencia de tiamina33.

Nuestros estudios de la microbiota intestinal viral en AN mostraron un desacoplamiento parcial de las interacciones ecológicas entre las especies virales y las especies bacterianas productoras de cadena corta con impacto en la biología cerebral53. Además, las muestras de AN se enriquecieron en fagos de Lactococcus con huéspedes bacterianos conocidos de L. lactis. El enriquecimiento asociado con la AN en los fagos de Lactococcus puede provocar la interrupción de la fermentación de los alimentos y sugerir el posible uso de alimentos fermentados en el tratamiento futuro de la AN. La razón de este enriquecimiento de fagos de Lactococcus no está clara, pero nuestro hallazgo puede justificar probar un probiótico multicepa que contiene L. lactis en adolescentes con AN54.

Nuestro estudio tiene limitaciones: (1) el uso de una cohorte danesa transversal de AN limita la generalización de los hallazgos a otras etnias; (2) la misma limitación se aplica al uso de pacientes con AN en tratamiento en un centro especializado, ya que estos pacientes pueden no ser representativos de formas más leves de AN; y (3) aunque se desconfundieron los efectos de múltiples covariables, no teníamos información sobre la dieta y la actividad física, comportamientos que afectan la microbiota intestinal.

En conclusión, el presente estudio multiómico descubre alteraciones profundas y complejas de la microbiota intestinal en personas con AN, con implicaciones funcionales y metabolitos séricos alterados. Estos compuestos pueden actuar a través de la circulación sanguínea o a través de vías de señalización neuronal intestinal-microbiota-cerebro que afectan la regulación cerebral del apetito, las emociones y el comportamiento. FMT de donantes humanos de AN a ratones GF bajo alimentación con restricción de energía resultó en un menor aumento de peso corporal y una serie de cambios en la expresión de genes hipotalámicos y de tejido adiposo involucrados en el control del comportamiento y la homeostasis energética. La combinación de experimentos multiómicos e in vivo complementa nuestros análisis de inferencia causal para permitir la identificación de metabolitos bacterianos específicos que potencialmente median los rasgos de AN del huésped humano. Nuestros hallazgos respaldan la hipótesis de que una microbiota intestinal gravemente alterada contribuye a algunas de las etapas de la patogenia de la AN.

Todos los pacientes con AN fueron diagnosticados por un psiquiatra consultor experimentado y cumplieron con los criterios del DSM-5 para los subtipos restrictivos o de atracones/purgas de AN1. Dado que el 90-95 % de las personas con AN diagnosticada son mujeres, decidimos incluir solo mujeres en el presente estudio y dado que el origen étnico puede influir en la microbiota intestinal, solo incluimos mujeres caucásicas danesas con casos de AN, reclutadas de tres centros especializados en Dinamarca de 1 de septiembre de 2014 al 31 de julio de 2016. Los centros fueron: Centro de Trastornos de la Alimentación (Hospital Universitario de Odense), Unidad de Psiquiatría Infantil y Adolescente (Hospital Universitario de Aarhus) y Unidad de Investigación Psiquiátrica (Hospital Universitario de Aalborg). Los criterios de exclusión comprendieron tratamiento con antibióticos o antifúngicos en los 3 meses anteriores, cualquier enfermedad o infección somática aguda o crónica. Todos los pacientes incluidos fueron tratados en centros especializados, y fueron entrevistados por un psicólogo o psiquiatra experimentado y especializado al inicio de su tratamiento. El Inventario de Trastornos de la Alimentación validado (EDI, detalles proporcionados en la Nota complementaria 2) se utilizó para la entrevista y como un cuestionario completado por especialistas profesionales de la salud capacitados21. Los criterios de exclusión para las mujeres de control sanas de la misma edad fueron un IMC inferior a 18,5 o superior a 25 kg m-2, medicación regular de cualquier tipo, excepto las píldoras anticonceptivas, y antibióticos en los últimos 3 meses. Los participantes de control fueron reclutados a través de anuncios públicos y por contacto directo con el personal de salud, estudiantes de medicina y sus familiares. El IMC y otras características clínicas de los controles sanos se enumeran en la Tabla complementaria 2.

El protocolo del estudio se registró en ClinicalTrials.gov (NCT02217384) y el estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité Ético Científico Regional del Sur de Dinamarca (archivo n.º 42053 S-20140040). Todos los participantes involucrados en este estudio dieron su consentimiento informado por escrito.

Pacientes internados. Todas las mediciones descritas a continuación se realizaron durante el tratamiento de rutina en la unidad especializada para la estabilización somática y psicológica de pacientes con AN grave. El objetivo del tratamiento en la unidad de hospitalización es una restauración de peso segura y efectiva de 2.0 a 3.0% por semana. La atención fue brindada por un equipo multidisciplinario y está de acuerdo con las guías internacionales. Se proporcionaron comidas personalizadas individualmente bajo la supervisión de enfermeras capacitadas o dietistas en horarios programados. Si las comidas no se podían consumir dentro de los plazos predefinidos (15 min para un refrigerio y 30 min para una comida principal), se añadían bebidas nutritivas suplementarias por vía oral o mediante una sonda duodenal. Para tener en cuenta las preferencias individuales, se ofreció la opción de tres comidas diferentes. El contenido de macronutrientes fue consistente y dentro de los rangos de porcentaje de energía recomendados: 40-50 % de carbohidratos (máximo de 10 % de azúcar), 30-40 % de grasa y 20-25 % de proteína. La ingesta diaria de energía se individualizó de acuerdo con el curso de peso. Si un paciente no alcanzaba el 2% de la ganancia de peso semanal, se aumentaba el contenido energético del menú diario. Todas las comidas fueron seguidas por un descanso supervisado que variaba de 30 a 60 min en una posición sentada. Entre los descansos, se permitía actividad física ligera como una caminata; sin embargo, no se permitió ninguna forma de entrenamiento físico. Para los pacientes con una necesidad imperiosa de ejercicio excesivo o de otra manera la falta de cumplimiento de las normas de conducta, la supervisión de la conducta se extendió y, si era necesario, a las 24 horas del día.

Pacientes ambulatorios. Los pacientes con AN realizaban visitas periódicas a las unidades ambulatorias donde se brindaba atención por parte de un equipo multidisciplinario que incluía médicos, enfermeras, psicólogos y educadores de comportamiento en salud.

Se les dio un plan de dieta individual, que tenía la misma composición de macronutrientes que se mencionó anteriormente para los pacientes hospitalizados. Al igual que con los pacientes hospitalizados, todos los pacientes ambulatorios también se inscribieron en cursos de tratamiento terapéutico cognitivo conductual.

La talla se midió en un estadiómetro montado en la pared y el peso se midió por la mañana antes del desayuno en una báscula de plataforma calibrada. El IMC se calculó como el peso dividido por el cuadrado de la altura (=kg/m2).

Las muestras de sangre se tomaron por la mañana después de un ayuno nocturno. Las muestras de sangre se recogieron en hielo y se procesaron para obtener suero y plasma, y ​​posteriormente se almacenaron a -80 °C. Las concentraciones séricas de sodio, potasio, albúmina y creatinina se midieron mediante ensayos enzimáticos en un sistema Roche/Hitachi cobas c. Las concentraciones séricas de colesterol total, colesterol de lipoproteínas de alta densidad y colesterol de lipoproteínas de baja densidad se determinaron utilizando el método de precipitación con cloruro de magnesio con ácido fosfotúngstico. Los niveles de insulina inmunorreactiva en suero se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, mientras que la concentración sérica de alanina aminotransferasa se analizó con un método culombimétrico enzimático que incluía la activación de fosfato de piridoxal.

El análisis de ClpB en plasma se realizó como se describió previamente55.

Las heces se recolectaron de acuerdo con las pautas de International Human Microbiome Standards (IHMS) (SOP 03 V1) en kits por casos de AN y HC en el hogar e inmediatamente se congelaron a -20 ° C hasta que se transportaron en hielo seco y se congelaron 4-24 h más tarde en −80 °C en tubos de plástico en los biobancos. La extracción de ADN de alícuotas de muestras fecales se realizó siguiendo IHMS SOP P7 V256.

Para el recuento de células bacterianas (Fig. 7 complementaria), se diluyeron 0,08–0,12 g de muestras fecales congeladas (−80 °C) 15 veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) de pH 7,2 (Sigma-Aldrich), homogeneizadas mecánicamente usando tejido lyser (40 min, 12,5 agitaciones por segundo; QIAGEN) y fijado con paraformaldehído al 2% (10 min, temperatura ambiente; Biotum). Luego, las muestras se diluyeron 120 veces en tampón de tinción filtrado (EDTA 1 mM, Tween20 al 0,01 %, pH 7,2 DPBS, BSA al 1 % (Sigma-Aldrich)). Para minimizar los grumos, las muestras se filtraron a través de un filtro de células (tamaño de poro 5 μm; pluriSelect), humedecidas previamente en el tampón de tinción. A continuación, la suspensión de células bacterianas se tiñó con SYBR Green I (1:200 000; Thermo Fisher) en DMSO (Sigma-Aldrich) y se incubó en la oscuridad durante 30 min. Para una determinación precisa de los recuentos de células bacterianas, se añadió a las muestras una concentración conocida de 123 count eBeads (Invitrogen) antes del análisis. Las mediciones se realizaron con un citómetro de flujo BD Fortessa LSRII (BD Biosciences) y los datos se adquirieron con el software BD FACSDiVaTM. Se aplicó un valor umbral de 200 en el canal FITC (530/30 nm). Intensidad de fluorescencia en los canales de fluorescencia verde (530/30 nm, FITC), azul (450/50 nm, azul Pacífico), amarillo (575/26 nm, PE) y rojo (695/40 nm, PerCP-Cy5-5) como así como las intensidades de luz dispersadas hacia adelante y hacia los lados (FSC y SSC). Las mediciones se realizaron a un caudal preestablecido de 0,5 μl s−1. Los datos se procesaron en R utilizando el paquete flowcore (v1.11.20)57 en R (v4.1.2). La estrategia de selección fija separó los eventos fluorescentes microbianos del fondo de la muestra fecal.

El ADN se cuantificó mediante la cuantificación fluorométrica Qubit (Thermo Fisher) y se calificó mediante el perfilado del tamaño del ADN en un analizador de fragmentos (Agilent). Se usó ADN de alto peso molecular (>10 kpb; 3 µg) para construir la biblioteca. El corte del ADN en fragmentos de aproximadamente 150 pb se realizó utilizando un ultrasonicador (Covaris) y la construcción de la biblioteca de fragmentos de ADN se realizó utilizando los kits Ion Plus Fragment Library y Ion Xpress Barcode Adapters (Thermo Fisher). Las bibliotecas de fragmentos de ADN purificadas y amplificadas se secuenciaron utilizando el secuenciador de protones de iones (Thermo Fisher), con un mínimo de 20 millones de lecturas de alta calidad de 150 pb (en promedio) generadas por biblioteca.

Para construir la tabla de recuento de genes, se utilizó el software METEOR58: primero, AlienTrimmer59 filtró las lecturas por baja calidad. Después de eliminar las lecturas de baja calidad y las lecturas de ADN humano, el 75,7 % ± 2,7 % de las lecturas de secuenciación metagenómica de alta calidad del ADN fecal se mapearon en el Catálogo intestinal integrado 2 (IGC2)60, que comprende 10,4 millones de genes, utilizando Bowtie2 (ref. 61 ). Las lecturas asignadas a un gen único en el catálogo se atribuyeron a sus genes correspondientes. Luego, las lecturas que se asignaron con el mismo puntaje de alineación a múltiples genes en el catálogo se atribuyeron de acuerdo con la proporción de sus recuentos de mapeo únicos a los genes capturados. La tabla de conteo resultante se procesó aún más utilizando el paquete R MetaOMineR v1.3162. Se redujo a 14 millones de lecturas mapeadas para tener en cuenta las diferencias en la profundidad de secuenciación y la tasa de mapeo entre muestras. Luego, la matriz reducida se normalizó para la longitud del gen y se transformó en una matriz de frecuencia por fragmentos por kilobase de transcripción por millón de fragmentos de normalización mapeada. El recuento de genes se calculó como el número de genes presentes (abundancia estrictamente positiva) en la matriz de frecuencia.

IGC2 se organizó previamente en 1990 MSP con MSPminer63 utilizando un conjunto de datos de MSP actualizado disponible públicamente64. La abundancia relativa de MSP se calculó como la abundancia media de sus 100 genes "marcadores" (es decir, los genes que se correlacionan más en conjunto). Si se observaba menos del 10 % de los genes "marcadores" en una muestra, la abundancia de MSP se establecía en 0. Este enfoque se utilizó en los consorcios MetaHIT62 y Metacardis65. Para las 4 MSP con menos de 100 genes centrales, se usaron todos los genes centrales disponibles.

Las abundancias en los rangos taxonómicos más altos se calcularon como la suma de las MSP que pertenecen a un taxón dado. El recuento de MSP se evaluó como el número de MSP presentes en una muestra (es decir, cuya abundancia es estrictamente positiva). El perfil de enterotipos se realizó como se demostró anteriormente66.

Los genes del catálogo IGC2 se mapearon con diamond67 en ortólogos KEGG (KO) de la base de datos KEGG68 (v8.9). Cada gen se asignó al KO mejor clasificado entre los éxitos con un valor e <10 × 10-5 y una puntuación de bits> 60. Luego, evaluamos la presencia y abundancia de GMM28 y GBMs29 en una muestra metagenómica mediante la canalización implementada en el paquete R omixerRpm (v0.3.2) como se describió anteriormente28,29.

Usamos la tubería computacional para inferir la dinámica de crecimiento bacteriano intestinal a partir de muestras metagenómicas como se describió anteriormente27. Las lecturas de secuenciación se asignaron a una base de datos que contiene referencias genómicas completas de 2991 cepas pertenecientes a 1509 especies microbianas. Para cada especie bacteriana, se seleccionó una cepa de referencia con una prevalencia del 100 % en las muestras. Luego se armó un mapa de cobertura sobre la base de lecturas alineadas con el genoma de referencia. Los segmentos genómicos se agruparon en regiones de 10 kpb y se calculó y suavizó la cobertura de los contenedores resultantes. La ubicación del origen y el término de la replicación se predijo mediante ajustes de la misma cepa en múltiples muestras. Por último, se calcularon los PTR para cada especie bacteriana en cada muestra como la cobertura de secuenciación suavizada de la cepa representativa en la ubicación máxima prevista, dividida por la ubicación mínima prevista.

Antes de la clasificación de SV, se realizó la canalización con un algoritmo iterativo de asignación de lectura basado en la cobertura para reasignar las lecturas ambiguas a la referencia más probable con alta precisión31,32. Los genomas de referencia proporcionados en la base de datos proGenomes (http://progenomes1.embl.de/) se concatenaron y luego se dividieron en contenedores genómicos de 1 kpb y se aplicaron para la detección de segmentos genómicos altamente variables. La canalización SGV-Finder31 se utilizó para detectar los SV que son (1) con un porcentaje de eliminación del segmento genómico en la población de <25 % (SV variable, vSV), (2) con un porcentaje de eliminación entre el 25 % y el 75 % (deleción SV, dSV; se mantuvo la ausencia o presencia de este segmento genómico en particular) o (3) con un porcentaje de deleción > 75 % (este segmento genómico se excluyó del análisis). Todas las especies bacterianas con llamada SV estuvieron presentes en al menos el 10% del total de las muestras y se utilizaron para análisis posteriores.

Se utilizó el paquete R 'mediation'69 (v4.5.0) para inferir relaciones causales entre las características microbianas intestinales, los metabolitos polares y relacionados con la microbiota, y las características metabólicas y las puntuaciones de los trastornos alimentarios. Para reducir los números de prueba, solo mantuvimos los grupos de candidatos que consistían en variables que estaban fuertemente asociadas entre sí; es decir, para un grupo causal candidato de característica microbiana-metabolito-variable fenotípica, la asociación entre la característica microbiana intestinal y el metabolito sérico fue significativa (Padj < 0,1); la asociación entre metabolito y variable fenotípica fue significativa (Padj < 0,1); y la asociación entre la característica microbiana y la variable fenotípica fue significativa (Padj < 0,1). Después de realizar el análisis de mediación, solo los grupos de candidatos con importancia en la dirección 1 se mantuvieron para la visualización del diagrama de Sankey.

Perfilamos la microbiota intestinal viral utilizando MiCoP70, ya que este método está optimizado para llamar a los virus directamente a partir de lecturas de secuenciación de metagenómica masiva y calcular la abundancia relativa dentro del conjunto de datos de virome. Como conjunto de datos de referencia, MiCoP se basa en la base de datos RefSeq Viral del NCBI71. Identificamos un total de 209 especies virales con prevalencia de > y = 10 % y abundancia relativa de > y = 0,01 % para 147 (77 AN versus 70 HC) individuos incluidos en el conjunto de datos. La riqueza, la diversidad alfa y beta se calcularon con el paquete R 'fossil'72 y 'vegan'73. Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas para determinar diferencias estadísticamente significativas en los índices de riqueza y diversidad alfa entre grupos. Se realizó un análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) en n = 999 para la distancia de Canberra. Las interacciones virales-bacterianas en los datos del microbioma AN-RS y AN-BP se calcularon utilizando el algoritmo Sparse Correlations for Compositional (SparCC)74. Antes del análisis de SparCC, los conjuntos de datos de microbiota bacteriana y viral de AN se subdividieron en conjuntos de datos de AN-RS y AN-BP, que luego se enviaron por separado para el análisis de SparCC.

Los metabolitos enumerados como metabolitos relacionados con la microbiota intestinal se basaron en la extracción de literatura75,76. Las muestras de suero se aleatorizaron y la preparación de las muestras se realizó como se describió anteriormente43,77. Brevemente, se agregaron 400 μl de metanol (MeOH) que contenía estándares internos (ácido heptadecanoico, dl-valina marcada con deuterio, ácido succínico marcado con deuterio y ácido glutámico marcado con deuterio, 1 µg ml−1) a 30 µl de las muestras de suero. , que luego se mezclaron en vórtex y se incubaron en hielo durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron (9400 × g, 3 min) y se recogieron 350 μl del sobrenadante después de la centrifugación. El solvente se evaporó a sequedad, se agregaron 25 μl de reactivo MOX y la muestra se incubó por 60 min a 45 °C. Se añadió N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (25 μl) y después de 60 min de incubación a 45 °C, se añadieron 25 μl de la mezcla estándar de índice de retención (n-alcanos, 10 μg ml−1).

Los análisis se realizaron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 7890B acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo Agilent 7200. Se utilizaron los siguientes parámetros: el volumen de inyección fue de 1 µl con una división de 100:1 en PTV a 70 °C, calentando a 300 °C a 120 °C min−1; columna: Zebron ZB-SemiVolatiles con una longitud de 20 m, un diámetro interno de 0,18 mm, un espesor de película de 0,18 µm, con un flujo de helio inicial de 1,2 ml min−1, que aumenta a 2,4 ml min−1 después de 16 min. Programa de temperatura del horno: 50 °C (5 min), luego a 270 °C a 20 °C min−1 y luego a 300 a 40 °C min−1 (5 min). Fuente EI: 250 °C, energía de electrones de 70 eV, emisión de 35 µA, retardo de disolvente de 3 min. Rango de masas de 55 a 650 amu, velocidad de adquisición de 5 espectros por segundo, tiempo de adquisición de 200 ms por espectro. Cuádruple a 150 °C, flujo de colisión de 1,5 ml min−1 N2, temperatura aux-2 280 °C.

Las curvas de calibración se construyeron utilizando alanina, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido glutámico, glicina, ácido láctico, ácido málico, ácido 2-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, colesterol, fructosa, glutamina, ácido indol-3-propiónico, isoleucina, leucina, prolina, ácido succínico, valina, asparagina, ácido aspártico, ácido araquidónico, glicerol-3-fosfato, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina, serina y treonina adquiridos de Sigma-Aldrich en un rango de concentración de 0,1–80 μg ml−1. Se recolectó una alícuota de cada muestra, se combinó y se usó como muestras de control de calidad, junto con la muestra de suero CRM1950 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST), una muestra de suero agrupada interna. La desviación estándar relativa de las concentraciones fue en promedio del 16 % para las muestras de control de calidad agrupadas y del 10 % para las muestras del NIST.

El procedimiento de preparación de la muestra se realizó como se describió anteriormente78. La placa se preacondicionó con 450 µl de acetonitrilo antes de agregar 100 µl de muestra y 10 µl de mezcla estándar interna de sustancias polifluoroalquiladas (PFAS) y ácidos biliares (BA) (200 ng ml−1 y 1000 ng ml−1, respectivamente). A continuación, se añadieron a cada pocillo 450 µl de acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 1 % y las muestras se extrajeron utilizando un colector de vacío de 10″. El eluato se evaporó a sequedad bajo un flujo de gas nitrógeno y se reconstituyó en 80 µl de MeOH/etanoato de amonio acuoso 2 mM.

La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando una columna Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm de diámetro interno, tamaño de partícula de 1,7 µm), equipada con una precolumna C18 (Waters). La fase móvil A constaba de H2O:MeOH (v/v 70:30) y la fase móvil B de MeOH conteniendo ambas fases acetato de amonio 2 mM como agente de ionización. El caudal se fijó en 0,4 ml min−1 con el gradiente de elución de la siguiente manera: 0–1,5 min, la fase móvil B se incrementó del 5 % al 30 %; 1,5–4,5 min, la fase móvil B se aumentó al 70 %; 4,5–7,5 min, la fase móvil B se aumentó al 100 % y se mantuvo durante 5,5 min. Se utilizó un post-tiempo de 5 min para recuperar las condiciones iniciales para el siguiente análisis. El tiempo total de ejecución por muestra fue de 18 min. Los ajustes de la fuente de ionización por electropulverización dual fueron los siguientes: el voltaje del capilar fue de 4,5 kV, el voltaje de la boquilla de 1500 V, la presión de N2 en el nebulizador fue de 21 psi y el caudal y la temperatura del N2 como gas envolvente fueron de 11 l min−1 y 379 °C, respectivamente. Para obtener espectros de masas precisos en la exploración de espectrometría de masas (MS), el rango m/z se estableció en 100–1700 en el modo de iones negativos. Se utilizó el software MassHunter B.06.01 (Agilent) para toda la adquisición de datos.

La identificación de los compuestos se realizó con una biblioteca espectral interna utilizando MS (y tiempo de retención), información de espectrometría de masas en tándem. La cuantificación se basó en una curva de calibración emparejada con matriz enriquecida con compuestos nativos. La curva de calibración constaba de concentraciones que oscilaban entre 0 y 1600 ng ml−1 para BA. La desviación estándar relativa para los BA fue en promedio del 17,8 % para las muestras de control de calidad y del 19,4 % para las muestras del NIST.

Los protocolos con animales fueron aprobados por los Comités de Ética Científica de la Región Capital de Copenhague, Dinamarca. Se criaron ratones hembra Swiss Webster libres de gérmenes y se mantuvieron en aisladores gnotobióticos de película flexible hasta el comienzo de los experimentos en el Departamento de Medicina Experimental de la Universidad de Copenhague. Los ratones fueron alimentados con una dieta chow esterilizada en autoclave (7 % azúcares simples, 3 % grasas, 50 % polisacáridos, 15 % proteínas (p/p), energía 3,5 kcal g-1) y agua ad libitum bajo un ambiente de 12 h de luz/12 h de oscuridad. ciclo (encendido de luces a las 7:30 am) y temperatura constante (21–22 °C) y humedad (55 ± 5%).

Muestras fecales de subgrupos seleccionados al azar de tres pacientes con AN (mujeres de 20, 22 y 20 años con un IMC de 10,3, 11,5 y 11,7 kg m−2, respectivamente) y tres HC (mujeres de 20, 22 y 21 años con un IMC de 22,6, 21,1 y 21,2 kg m-2, respectivamente) que eran representantes de casos y controles se utilizaron para colonizar compañeras de camada GF hembra de 6 semanas de edad. Brevemente, se suspendieron 250 mg de muestras fecales con 5 ml de medio LYBHI (complementado con cisteína al 0,05 % y hemina al 0,2 % como agentes reductores) diluidos en glicerol al 20 % (20 ml g−1 de heces) en un criovial anaeróbico; estas muestras de inóculo luego se agitaron en un vórtex durante 5 min, seguido de 5 min de reposo para precipitar las partículas. Luego, las suspensiones fecales se transfirieron a crioviales de 1 ml y se congelaron inmediatamente a -80 °C. En el primer día, ambos grupos de ratones se alojaron en jaulas esterilizadas en autoclave con ventilación individual donde recibieron la primera dosis (200 µl) de lodos fecales. A los ratones se les administró entonces una dieta de pienso esterilizada en autoclave y agua ad libitum durante 2 días y se registró su consumo de alimentos. En el día 3, los ratones recibieron por sonda una segunda dosis de material fecal de los mismos donantes de AN y HC compatibles que antes. A partir de entonces, los ratones de ambos grupos se alojaron individualmente y se sometieron a una dieta chow autoclavada con restricción energética del 30 % (la cantidad de comida administrada se fijó en el 70 % de la ingesta de alimentos ad libitum para cada ratón) durante 3 semanas en las que se administró agua ad libitum. Tanto los ratones trasplantados con anorexia (AN-T) como los trasplantados de control normal (HC-T) se pesaron cada 5 días después del inicio de la dieta restringida en energía.

Al final del estudio, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se recogió sangre de la vena cava en tubos que contenían EDTA. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 6 min a 4032 g a 4 °C. El plasma se aisló y almacenó a -80 °C para su posterior análisis bioquímico. El tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal, el ciego y el hipotálamo de cada ratón se diseccionaron con precisión y se recolectaron para el análisis PCR cuantitativo. Ningún animal o puntos de datos fueron excluidos del presente estudio.

El ARN total se extrajo de los tejidos utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, seguido de la medición de la concentración. Se transcribió un µg de ARN a ADN complementario usando el Sistema de Transcripción Inversa (Promega). La PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de detección LC480 (Roche Diagnostics) y SYBR Green I Supermix (Takara). Todas las qPCR se ejecutaron en los ciclos térmicos a 95 °C durante 10 min, seguidos de 45 ciclos de 0,01 s a 95 °C y de 20 s a 60 °C. Los datos se normalizaron al gen Rpl36 de limpieza para el tejido adiposo y al gen Rplp079 para el hipotálamo y se analizaron de acuerdo con el método delta-delta CT. Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla complementaria 8.

Los ADN microbianos se aislaron y purificaron a partir de muestras de heces (~250 mg) de donantes humanos y receptores de ratón mediante el mini kit de suelo NucleoSpin (MACHEREY‑NAGEL). Luego, el ADN se amplificó utilizando la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs) mediante PCR dirigida a la región V3-V4 del gen 16S rRNA (secuencias de cebador proporcionadas en la Tabla complementaria 8). Se utilizó el siguiente programa de PCR: 98 °C por 30 s, 25× (98 °C por 10 s, 55 °C por 20 s, 72 °C por 20 s), 72 °C por 5 min. La amplificación se verificó procesando los productos en un gel de agarosa. Los índices se agregaron en una PCR posterior utilizando un kit Illumina Nextera con el siguiente programa de PCR: 98 °C durante 30 s, 8 × (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La unión de los índices se verificó procesando los productos en un gel de agarosa. Los productos de la PCR anidada se agruparon en función de la intensidad de la banda y la biblioteca resultante se limpió con perlas magnéticas. La concentración de ADN de las bibliotecas agrupadas se midió fluorométricamente. La secuenciación se realizó en un secuenciador de escritorio Illumina MiSeq utilizando el kit de reactivos MiSeq V3 (Illumina) para una secuenciación de extremos emparejados de 2 × 300 pb. Las lecturas de extremos emparejados se recortaron, fusionaron y analizaron posteriormente mediante la canalización DADA2 (v1.16.0)80.

No se excluyeron datos antes del análisis estadístico en el presente estudio. No se incluyeron asignación ni aleatorización ya que el estudio es observacional. Este estudio incluye todas las muestras disponibles (n = 147) de pacientes con anorexia e individuos sanos. Aunque no se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, nuestros tamaños de muestra son similares a los informados en publicaciones anteriores43,81. Las muestras se distribuyeron aleatoriamente entre lotes de metagenómica y metabolómica. Los investigadores desconocían la asignación de grupos durante la recopilación de datos en los análisis metagenómicos, bioquímicos y metabolómicos. Todos los análisis de muestras humanas se realizaron utilizando R (v4.1.2). Los análisis de expresión génica y las comparaciones de peso corporal para estudios en animales se realizaron con GraphPad Prism (v9.3.0).

Análisis diferencial

Realizamos el análisis diferencial usando el pipeline metadeconfoundR implementado en el paquete R metadeconfoundR (v0.1.8; ver https://github.com/TillBirkner/ metadeconfoundR o https://doi.org/10.5281/zenodo.4721078) donde evaluó hasta qué punto las diferencias observadas entre los participantes de AN y HC en los análisis de microbioma o metaboloma se confunden por covariables que incluyen la edad, el IMC, el tabaquismo y la medicación. Esta canalización utilizó inicialmente estadísticas univariadas para encontrar asociaciones entre las características del microbioma y el estado de la enfermedad, seguidas de pruebas post hoc de comparación de modelos lineales anidados para verificar los efectos de confusión de las posibles covariables y, finalmente, devolvió una etiqueta de estado.

Análisis de asociación

Para el análisis de asociación y mediación entre las características ómicas y el comportamiento alimentario y los rasgos psicológicos dentro del grupo AN, primero verificamos la normalidad de las variables continuas con la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, encontrando que la mayoría de las variables no se distribuyen normalmente. Por lo tanto, antes del análisis de asociación, estandarizamos las variables continuas usando la transformación cuantil normal empírica para seguir una distribución normal estándar (N ~ (0, 1)). Luego implementamos un modelo de regresión lineal para evaluar las asociaciones entre las características ómicas y el comportamiento alimentario y los rasgos psicológicos utilizando la siguiente fórmula donde se agregaron factores de confusión como covariables.

La medicación incluía inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, antipsicóticos y benzodiazepinas.

Para el análisis de asociación entre las características ómicas y las características metabólicas del huésped, también se realizó una verificación de normalidad y estandarización de datos antes del análisis de regresión lineal. En el modelo de regresión lineal, los factores de confusión mencionados anteriormente se incluyeron como covariables, excepto el IMC, ya que el IMC extremadamente bajo es el cambio fenotípico más notable para los pacientes con AN en comparación con los individuos con HC.

Las diferencias en la diversidad microbiana intestinal (riqueza de genes, recuento de especies, composición taxonómica) entre AN y HC se calcularon mediante pruebas de Wilcoxon, y se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para evaluar la importancia de las diferencias entre múltiples grupos. A menos que se indique lo contrario, todos los valores de P se corrigieron utilizando el método de Benjamini-Hochberg y Padj < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Se puede acceder a los datos clínicos anónimos que se almacenan en Sharepoint a través de Odense Patient Data Explorative (archivo n.° OP_153) comunicándose con [email protected] o se pueden encontrar en la Tabla complementaria 2. Datos de secuenciación de escopeta sin procesar y datos de secuenciación de amplicón del gen 16s rRNA que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de acceso PRJEB51776 y PRJEB60103, respectivamente. Los datos de metabolómica están disponibles en el repositorio de Metabolomics Workbench en el enlace https://doi.org/10.21228/M8KT5B. La base de datos KEGG está disponible en https://www.genome.jp/kegg/. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los códigos asociados con el análisis y la visualización de datos están disponibles en https://github.com/fjw536/AnorexiaGutMicrobiome.git.

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Thirion, F. et al. La microbiota intestinal en la esclerosis múltiple varía con la actividad de la enfermedad. Genoma Med. 15, 1 (2023).

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YF recibió la beca individual Marie Skłodowska-Curie (797267) dedicada al presente estudio. El Centro de Investigación Metabólica Básica de la Fundación Novo Nordisk es una institución de investigación independiente de la Universidad de Copenhague, parcialmente financiada por una donación ilimitada de la Fundación Novo Nordisk. RKS fue apoyado por el Fondo de Investigación del Hospital Universitario de Odense (R15-A800).

Estos autores contribuyeron por igual: Yong Fan, René Støving, Samar Berreira Ibraim.

Centro de la Fundación Novo Nordisk para la Investigación Metabólica Básica, Facultad de Salud y Ciencias Médicas, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Yong Fan, Tulika Arora, Liwei Lyu, Evelina Stankevic, Tue Haldor Hansen, Fredrik Backhed y Oluf Pedersen

Centro de Trastornos de la Alimentación, Hospital Universitario de Odense y Unidad de Investigación de Endocrinología Médica, Servicios de Salud Mental en la Región del Sur de Dinamarca, Red Explorativa de Datos Abiertos de Pacientes (OPEN) e Instituto Clínico, Universidad del Sur de Dinamarca, Odense, Dinamarca

René Klink por Støving

Universidad Paris-Saclay, INRAE, MGP, Jouy-en-Josas, Francia

Samar Berreira Ibraim, Florence Thirion, Nicolas Pons, Nathalie Galleron, Benoît Quinquis, Florence Levenez, Hugo Roume & S. Dusko Ehrlich

Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad de Örebro, Örebro, Suecia

Tuulia Hyötyläinen, Tim Sinioja y Oddny Ragnarsdottir

Departamento de Medicina, Universidad de Copenhague y Hospital Universitario Herlev-Gentofte, Copenhague, Dinamarca

Liwei Lyu y Oluf Pedersen

Unidad de Investigación INSERM U1073 y TargEDys, Universidad de Rouen, Rouen, Francia

pierre dechelotte

Laboratorio de Bacteriología Molecular, Departamento de Microbiología e Inmunología, Rega Institute Ku Leuven, Lovaina, Bélgica

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva y Jeroen Raes

Centro de Microbiología, VIB, Lovaina, Bélgica

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva y Jeroen Raes

Instituto de Microbiología Médica e Higiene y Centro de Investigación de Inmunoterapia (FZI), Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Mainz, Mainz, Alemania

Gwen Falony y Sara Vieira-Silva

Instituto de Biología Molecular (IMB), Maguncia, Alemania

Gwen Falony y Sara Vieira-Silva

Departamento de Psiquiatría Infantil y Adolescente, Hospital Universitario de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Muy Clausen

Departamento de Medicina Clínica, Facultad de Salud, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Muy Clausen

Unidad de Investigación Psiquiátrica, Hospital Universitario de Aalborg, Aalborg, Dinamarca

Juegos de Kjaersdam Telleus

Departamento de Comunicación y Psicología, Facultad de Ciencias Sociales y Humanidades, Universidad de Aalborg, Aalborg, Dinamarca

Juegos de Kjaersdam Telleus

Laboratorio Wallenberg, Departamento de Medicina Molecular y Clínica, Instituto de Medicina, Academia Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Fredrik Backhed

Departamento de Fisiología Clínica, Hospital Universitario Sahlgrenska, Región Västra Götaland, Gotemburgo, Suecia

Fredrik Backhed

Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Örebro, Örebro, Suecia

matej oresic

Turku Bioscience Centre, Universidad de Turku y Universidad Åbo Akademi, Turku, Finlandia

matej oresic

Departamento de Neurociencias Clínicas y del Movimiento, University College London, Londres, Reino Unido

S. Dusko Ehrlich

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OP concibió y diseñó el concepto del estudio y detalló el protocolo y supervisó todas las fases del protocolo del estudio, incluida la redacción del documento. YF, RKS, SBI y FT realizaron el análisis de datos, interpretaron los resultados y contribuyeron a la redacción del documento. TH, TS y OR respaldaron el perfil del metaboloma. YF diseñó y llevó a cabo todos los experimentos con animales con el apoyo de TA y LLLL y ​​ES realizó el recuento de células bacterianas. RKS y THH realizaron el fenotipado de los participantes del estudio. PD, NP, NG, BQ, FL, HR, GF, SV-S., JR, LC, GKT, FB, MO y SDE contribuyeron al desarrollo y supervisión del proyecto técnico y revisaron los borradores del documento. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición del artículo.

Correspondencia a Oluf Pedersen.

FB es accionista de Implexion Pharma. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Microbiology agradece a Tom Hildebrandt y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El flujo de trabajo se creó con BioRender.com.

a,b,e Diagrama de caja (línea, mediana; caja, rango intercuartílico (RIQ); bigotes, 1,5× RIQ) de comparación entre AN (dorado, n = 77) y HC (azul, n = 70) de abundancia relativa de los 12 filos bacterianos detectados en al menos el 10% de los individuos (a), las 20 familias bacterianas más abundantes (b) y los 30 géneros principales (e). Las características se ordenan por abundancia media decreciente. Los valores cero se establecen en 1e-10. Las características coloreadas en azul están enriquecidas en el grupo HC y las doradas están enriquecidas en el grupo AN. La significación se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos caras, seguida de la corrección de pruebas múltiples y desconcertantes de drogas mediante el método de Benjamini-Hochberg en todas las características (a, b y e, consulte Datos de origen para conocer los valores de p exactos). c, f, valores absolutos del tamaño del efecto Delta de Cliff de las familias ( c ) y los géneros ( f ) contrastados entre AN y HC después de la desconfusión de drogas (valor p ajustado ≤ 0.1). Los diagramas de barras dorados indican características más abundantes en AN; Los diagramas de barras azules indican características más abundantes en HC (c, f). d, g, Diagrama de caja (línea, mediana; caja, IQR; bigotes, 1.5× IQR) que muestra la diversidad β (distancia de Canberra) del bacterioma intestinal a nivel de género (d) y la riqueza de los Pan-genomas de especies metagenómicas (MSP) ( g) entre AN (oro, n = 77) y HC (azul, n = 70). La significación se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos caras (d, g). h, el panel superior muestra la prevalencia de enterotipos en AN (n = 77) y HC (n = 70), el panel inferior muestra la prevalencia de enterotipos en pacientes con HC y AN divididos en AN-RS (n = 56) y AN-BP (n = 21 ) grupos.

Datos fuente

El tamaño y el color del nodo representan la abundancia media y el género de una MSP dada, respectivamente. Los géneros representados por una sola MSP están coloreados en gris. Las líneas rojas y azules indican correlaciones positivas y negativas, respectivamente. El grosor de línea representa el coeficiente de correlación absoluto. Solo se muestran las correlaciones con un coeficiente absoluto superior a 0,4; Los MSP sin ninguna correlación por encima del umbral están ocultos.

Las variables en la escala de trastornos alimentarios específicos están marcadas en azul, y en la escala psicológica general están marcadas en rojo. +, p ajustado < 0,05 (consulte los datos de origen para conocer los valores de p exactos).

Datos fuente

a, Abundancia relativa de la familia Enterobacteriaceae en los grupos HC (n = 70) y AN (n = 77). b, concentración de ClpB en plasma en ayunas transformada a escala logarítmica entre los grupos HC (n = 70) y AN (n = 77). c, Concentración de ClpB en plasma en ayunas transformada a escala logarítmica entre los subtipos de AN restrictiva (AN-RS n = 56) y AN compulsiva (AN-BP n = 21). La significación se calculó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral entre dos grupos (ac). Los diagramas de caja indican la mediana y el rango intercuartil (IQR) y los bigotes representan 1,5 × IQR (ac).

Datos fuente

Los diagramas de caja indican la mediana y el rango intercuartílico (IQR), los bigotes indican 1,5 × IQR. La significación se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos caras.

Datos fuente

ac, Diagrama de dispersión que muestra, HOMA-IR, insulina y glucosa plasmáticas en ayunas en individuos que albergan una variación de 1 kpb en el genoma de A. putredinis (n = 147). Importancia determinada por la prueba de correlación de Spearman de dos caras corregida por la tasa de descubrimiento falso utilizando el método de Benjamini y Hochberg. La banda de error es una línea de regresión lineal con una banda de confianza del 95 % (ac). Los puntos que representan a los individuos AN y HC se colorearon en rojo y azul, respectivamente. d, panel superior, variabilidad estandarizada (eje y) a lo largo de una región genómica de A. putredinis (eje x). Panel inferior, ubicaciones (barra azul) del gen de interés.

Datos fuente

a, gráfico de análisis de componentes principales (PCA) del metaboloma sérico de los subtipos de AN, AN-BP (anorexia compulsiva/purga), AN-RS (anorexia restrictiva). b, número de resumen de la relación de mediación inferida para la dirección 1 (características microbianas intestinales → puntajes de trastornos alimentarios mediados por metabolitos séricos), dirección 2 (características microbianas intestinales → metabolitos séricos mediados por puntajes de trastornos alimentarios). c, Número de resumen de la relación de mediación inferida para la dirección 1 (características microbianas intestinales → fenotipos mediados por metabolitos séricos), dirección 2 (características microbianas intestinales → metabolitos séricos mediados por fenotipos) para toda la cohorte. d, diagrama de Sankey que muestra la red de relación causal inferida de la dirección 1, donde las características microbianas intestinales, incluidas las especies bacterianas, el cerebro intestinal y los módulos metabólicos, y la genética bacteriana se trataron como factores causales, los metabolitos séricos son mediadores y los rasgos metabólicos son resultados. e, Ejemplos de relaciones causales inferidas entre características microbianas intestinales, metabolitos y características metabólicas del huésped. La dirección 1, que significa características microbianas → características metabólicas mediadas por metabolitos séricos, se ilustra con una línea negra, mientras que la dirección 2, que significa características microbianas → metabolitos séricos mediados por características metabólicas, se ilustra con una línea roja estipulada. La proporción del efecto de mediación se muestra en el centro de los gráficos circulares. GDCA, ácido glicodesoxicólico; GHCA, ácido glicohiocólico; GHDCA, ácido glicohiodesoxicólico; GUDCA, ácido glicoursodesoxicólico; HCA, ácido hiocólico; evaluación del modelo homeostático HOMA-IR de la resistencia a la insulina; P-, plasma; S-, suero.

Datos fuente

a, Flujo de trabajo para la preparación de purines de microbiota fecal. Las heces (250 mg) tanto de la anorexia (AN) como del control (HC) se cortaron en hielo seco, se transfirieron a una cámara anaeróbica y se resuspendieron con 5 ml de medio LYBHI diluido en glicerol al 20%. Los lodos fecales resuspendidos se dividieron en alícuotas en criotubos y se volvieron a congelar rápidamente a -80 °C hasta su uso posterior. Todas las muestras de heces de donantes AN y HC compatibles se prepararon el mismo día y las alícuotas congeladas se almacenaron congeladas para alimentar a los ratones. b, esquema experimental para el estudio de trasplante de ratones GF. En cada estudio de camada independiente, las compañeras de camada GF a la edad de seis semanas se sacaron del aislador de cría y se asignaron al azar para recibir 200 µl de purines fecales de tres casos de AN o tres sujetos HC. Ambos grupos de ratones se alojaron en jaulas esterilizadas en autoclave con ventilación individual y se les administró dieta para comer en autoclave y agua ad libitum durante dos días. Después de dos días, los ratones recibieron una segunda dosis de material fecal de los mismos donantes AN y HC compatibles que antes. A partir de entonces, los ratones de ambos grupos se alojaron individualmente y se sometieron a una dieta de comida restringida en calorías al 30% durante tres semanas. Se administró agua ad libitum durante este período. Tanto los ratones trasplantados con anorexia (AN-T) como los trasplantados de control normal (HC-T) se pesaron cada cinco días después del inicio de la dieta restringida en energía. Creado con Biorender.com.

a, Cambio de peso corporal y porcentaje de grasa de compañeros de camada de ratones libres de gérmenes (GF) (n = 21) alimentados con una dieta ad libitum chow y trasplantados con microbiota de pacientes con anorexia. b, cambio de peso corporal en comparación con el peso corporal en el día 0 después de la dieta restringida en energía para tres experimentos independientes (n = 8, 6 y 6 para lotes independientes, respectivamente). Los datos se expresan como media ± sem(a,b). La significación se calculó mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA), seguido de una prueba post hoc de Benjamini-Hochberg. c, Perfil del metaboloma sérico en donantes humanos y receptores de ratones GF alimentados con una dieta con restricción energética del 30 %. Los datos se expresaron como los cambios de pliegue transformados en log2 (log2FC) entre los grupos AN y de control. Los valores positivos de log2FC indican metabolitos enriquecidos con AN, mientras que los valores negativos de log2FC indican metabolitos enriquecidos con HC. Los metabolitos séricos que cambiaron persistentemente entre los grupos AN y HC en donantes humanos y receptores de ratones GF se marcaron con barras azules. CA, ácido cólico; DCA, ácido desoxicólico; FFA, ácido graso libre; w/a-MCA, ω/α-ácido muricólico; HDCA, ácido hiodesoxicólico; TaMCA, ácido taurina-α-muricólico; CDCA, ácido quenodesoxicólico; LCA, ácido litocólico; UDCA, ácido ursodesoxicólico; G, ácidos biliares conjugados con glicina; T, ácidos biliares conjugados con taurina. d, Mapa de calor en el panel izquierdo que muestra la correlación entre los ASV y los genes cuantificados en el hipotálamo o el tejido adiposo blanco subcutáneo. La información taxonómica de los ASV se proporciona en el panel derecho. +, p < 0,05 corregido por el método de Benjamini-Hochberg (consulte los datos de origen para conocer los valores de p exactos).

Datos fuente

Notas complementarias, Figs. 1–7 y Referencias.

Tablas complementarias 1–8.

Datos de origen para las figuras complementarias. 1–6.

Fuente de datos estadísticos.

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Fan, Y., Støving, RK, Berreira Ibraim, S. et al. La microbiota intestinal contribuye a la patogénesis de la anorexia nerviosa en humanos y ratones. Nat Microbiol 8, 787–802 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Recibido: 23 junio 2022

Aceptado: 03 de marzo de 2023

Publicado: 17 abril 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Microbiología de la naturaleza (2023)