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May 22, 2023

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Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 622 (2023) Citar este artículo

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La leucemia mieloide aguda es la leucemia aguda más común en adultos, la barrera de la refractaria y la resistencia a los medicamentos aún no se ha conquistado en la clínica. La expresión génica anormal y los cambios epigenéticos juegan un papel importante en la patogénesis y el tratamiento. Un súper potenciador es un modificador epigenético que promueve los genes protumorales y la resistencia a los medicamentos al activar la transcripción del oncogén. El análisis integrador multiómico identifica el gen CAPG asociado al superpotenciador y su alto nivel de expresión se correlacionó con un mal pronóstico en la LMA. CAPG es una proteína del citoesqueleto pero tiene una función poco clara en la LMA. Aquí mostramos la función molecular de CAPG en la regulación de la vía de señalización de NF-κB mediante análisis proteómico y epigenómico. La eliminación de Capg en el modelo murino de AML dio como resultado células AML agotadas y una supervivencia prolongada de los ratones AML. En conclusión, el gen CAPG asociado a SE puede contribuir a la progresión de la AML a través de NF-κB.

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia maligna hematológica agresiva causada principalmente por la acumulación de mutaciones genéticas y la proliferación maligna de células madre hematopoyéticas (HSC)1,2,3,4,5. Las altas tasas de farmacorresistencia y recurrencia son el desafío actual en los ensayos clínicos6. La LMA puede ocurrir y progresar como resultado de mutaciones genéticas aleatorias y alteraciones epigenéticas7,8,9,10.

Los últimos años han destacado un progreso significativo en la comprensión de los patrones epigenéticos anormales subyacentes de varios tipos de cáncer. Las anomalías epigenéticas activan protooncogenes11 y provocan inestabilidad cromosómica12,13, mientras que el silencio transcripcional de los genes supresores de tumores14,15. La detección de eventos moleculares epigenéticos durante el desarrollo y la progresión de la AML podría ser valiosa para el desarrollo de tratamientos más efectivos.

Super-enhancer (SE) es esencialmente un grupo de potenciadores típicos activos (TE)16. En comparación con los TE, los SE tienen un tamaño mayor y una mayor capacidad para activar la transcripción. Durante el desarrollo, los SE desempeñan un papel fundamental en la regulación del destino celular y la determinación de los genes16. Las células cancerosas adquieren SE en regiones de oncogenes como MYC, BCL2 y su fenotipo canceroso se basa en una transcripción anormal16,17. Las modificaciones epigenéticas como la metilación del ADN y la acetilación de histonas pueden regular la activación anormal de los efectores aguas abajo a través de los SE18,19,20. También se encontró que los SE median genes relacionados con tumores21,22, puntos de control inmunitarios23, citoquinas inflamatorias24, transcripción25,26. Estos sugieren que los SE están involucrados en la aparición y el desarrollo de la recurrencia de la resistencia a los fármacos y tumores.

La proteína de actina de cobertura, similar a gelsolina (CAPG) es una proteína de unión a actina de la superfamilia de gelsolina que desempeña un papel crucial en la organización del citoesqueleto de actina27. La evidencia sugiere que las proteínas que pertenecen a la superfamilia de gelsolina pueden estar involucradas en otros procesos, incluida la regulación de la expresión génica28,29. A diferencia de otros miembros de la superfamilia de las gelsolinas, la CAPG se encuentra principalmente en el núcleo y no en el citoplasma30. Estudios previos han demostrado que CAPG es un biomarcador de cáncer de mama para el desarrollo y tratamiento de metástasis óseas31. Sin embargo, queda por investigar el patrón de expresión y la función de CAPG en AML.

En este estudio, identificamos un gen CAPG asociado a un superpotenciador específico de AML. y verificó que CAPG puede regular la progresión de AML a través de la vía de señalización de NF-κB.

La comprensión profunda de la patogenia de la AML confirió un nuevo objetivo de tratamiento para la terapia de AML, primero identificamos superpotenciadores específicos de AML y genes asociados a SE. Los superpotenciadores son importantes para controlar y definir la expresión de genes específicos de células16. Para identificar SE específicos de AML y genes relacionados, integramos datos multiómicos para caracterizar el gen asociado al superpotenciador específico de AML con el objetivo de proporcionar nuevos objetivos para la terapia de AML. Identificamos SE específicos de leucemia mieloide aguda y genes asociados a SE mediante el análisis de datos de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) de AML H3K27ac. Mientras tanto, se identificaron genes asociados de SE de células sanguíneas normales, incluidos neutrófilos (NE), monocitos (MO) y células progenitoras de células madre hematopoyéticas (HSPC) (Fig. 1 complementaria). Además, analizamos el conjunto de datos de RNA-seq disponible públicamente (GSE128910) de un estudio anterior, calculamos los genes expresados ​​​​diferencialmente entre voluntarios de salud y pacientes con AML, seleccionamos los genes que se expresaron en AML (RPKM> 1) y fueron 3 veces más altos de lo normal ( Figura 1a)32,33,34,35.

un esquema experimental para buscar genes asociados a superpotenciadores específicos y altamente expresados ​​en células de AML. Los neutrófilos (NE), los monocitos (MO) y las células progenitoras de células madre hematopoyéticas (HSPC) representan células sanguíneas normales. El círculo azul representa los genes asociados al superpotenciador en las células hematopoyéticas normales. El círculo verde representa genes regulados al alza en pacientes con AML. El círculo gris representa genes asociados a superpotenciadores en células de AML. b Las pistas de ChIP-seq muestran la señal representativa de H3K27ac en voluntarios sanos y pacientes con LMA. Los súper potenciadores se muestran como cuadros grises.

De acuerdo con el análisis anterior, seleccionamos 6 genes asociados a SE específicos de AML (CAPG, CD207, GPR132, SLC7A11, HIPK3 y FCER1G) que tienen una expresión significativamente alta (Fig. 1b). Estas regiones genéticas están enriquecidas para SE y altamente expresadas en AML (Fig. 2a, Fig. 2a complementaria). Seleccionamos el CAPG como objeto de nuestra investigación, que se ha informado de alta expresión en AML.

a Los datos de RNA-seq (GSE128910) muestran que CAPG se expresa en gran medida en pacientes con AML. Voluntarios sanos (n = 4) o pacientes con LMA (n = 7). b Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de CAPG en la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA)-LAML. Las líneas de puntos representan un límite de confianza del 95 %. c Comparar el nivel de expresión de CAPG en carcinoma invasivo de mama (BRCA), carcinoma de células papilares renales de riñón (KIPR), cistoadenocarcinoma seroso de ovario (OV), adenocarcinoma de páncreas (PAAD), adenocarcinoma de recto (READ) y tumores de células germinales testiculares (TGCT) del tumor y del tejido normal. Se utilizaron la suma de rangos de Wilcoxon y la prueba de rangos con signos para analizar la importancia de las diferencias. La mediana se muestra por la línea dentro de la caja. d Esquema experimental para ratones AML inducidos por MLL-AF9 establecido. e RT-qPCR que muestra que la expresión de CAPG aumentó en células leucémicas murinas de ratones trasplantados primarios en comparación con células de médula ósea de ratones normales (n = 5 ratones). Cada punto representa un ratón. Los datos se presentan como medias ± SD. *p < 0,05 en comparación con el grupo control. f Western blot que muestra que la expresión de CAPG aumentó en células leucémicas de ratones trasplantados primarios en comparación con células normales de médula ósea de ratón. Se usó GAPDH para mostrar carga igual. Cada banda representa un ratón individual.

Analizamos la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) y encontramos que el nivel de expresión de CAPG se asoció positivamente con un mal pronóstico en AML (Fig. 2b). Paralelamente, la expresión de otros genes asociados con SE también se correlacionó con el pronóstico en diversos grados (Fig. 3 complementaria). Además, una investigación realizada por la base de datos TCGA reveló que CAPG se expresó estadísticamente de manera significativa en una variedad de tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales (Fig. 2c). Esto implica que CAPG está íntimamente relacionado con el desarrollo de tumores.

Para validar aún más si los genes asociados a los SE se expresan de manera diferencial en la enfermedad y afectan el pronóstico de la AML, se compararon posteriormente los niveles de expresión en las muestras de sangre periférica recolectadas de pacientes y muestras de médula ósea de modelos de ratón (Fig. 2d). Observamos que la expresión de CAPG en células de AML murinas inducidas por MLL-AF9 estaba significativamente elevada en comparación con las células normales de médula ósea murina (Fig. 2e, f y Fig. 2b complementaria).

En general, los oncogenes en la AML pueden detectarse con precisión mediante genes asociados a superpotenciadores, y el gen CAPG asociado a superpotenciadores está relacionado con la progresión de la AML.

CAPG es conocido como un miembro de la superfamilia de proteínas de gelsolina, que regula la longitud del filamento de actina cubriendo o cortando los filamentos36. La CAPG se localiza en el citoplasma y núcleo celular, a diferencia de otros miembros de esta familia37. La CAPG se ha relacionado con un mal pronóstico en el cáncer de páncreas38 y de mama31,39, pero no se han realizado investigaciones sobre la LMA. En AML, hay una tendencia de regulación positiva en la expresión de actina (Fig. 2c complementaria). Para examinar cómo contribuye CAPG a la progresión de la AML, purificamos y caracterizamos los complejos de proteína CAPG en la línea celular THP-1 de AML humana para construir interactomas CAPG mediante inmunoprecipitación con espectrometría de masas (IP-MS) (Fig. 3a y Datos complementarios 3).

un esquema que muestra el sistema IP-MS dependiente de anticuerpos para identificar interactomas CAPG en células THP-1. b Conexión de CAPG con múltiples complejos proteicos. Resumen de los principales complejos de proteínas (círculo de línea discontinua) asociados con el interactoma CAPG. El tamaño del círculo representa la fiabilidad de la interacción proteína-proteína y el grosor de la línea de conexión representa la intensidad de la interacción. c Co-IP muestra las interacciones entre CAPG y proteínas relacionadas con NF-κB (RPL4, ZFP91, CCAR2).

Identificamos 79 proteínas que interactúan con CAPG en THP-1 (Material complementario). Además, se empleó el análisis de enriquecimiento a través de la ontología génica y la conclusión con la visualización basada en gráficos de los interactomas para determinar las funciones biológicas celulares. Gene Ontology se utilizó para seleccionar los grupos de anotaciones funcionales. El análisis funcional reveló que, como proteína de unión a actina, los socios de la proteína CAPG de los extractos de proteínas totales están íntimamente asociados con el ácido nuclear y la unión de filamentos de actina y también están involucrados en actividades moleculares celulares. Las categorías GO estuvieron involucradas en procesos relacionados con el metabolismo celular, la localización y la estabilidad de las biomoléculas. También está involucrado con el empalme del ARN y puede influir en la expresión génica, participando en el control epigenético, relacionado con la remodelación de la cromatina y la modificación de histonas. Se encontró CAPG en el ribosoma, el núcleo y el nucleoplasma, particularmente en el citoesqueleto de actina, según el análisis de componentes celulares. CAPG también se asoció con el complejo de modificación epigenética. El resultado indicó que CAPG como proteína gelsolina no solo constituye el citoesqueleto, sino que también desempeña una función crítica en los procesos de crecimiento celular (Fig. 4a complementaria).

Para interpretar aún más el papel funcional potencial de CAPG, los resultados del interactoma se sometieron a análisis de red de interacciones proteína-proteína (PPI) (Fig. 3b). En particular, observamos que CAPG interactúa físicamente con múltiples complejos de proteínas del citoesqueleto que involucran el complejo de miosina, el complejo de troponina, el complejo de tubulina y el complejo de actina. Este resultado es coherente con la función de CAPG como proteína gelsolina.

Además, el análisis de las características del interactoma reveló que CAPG está asociado con múltiples complejos reguladores epigenéticos, que no se han informado previamente. Es de destacar que se han informado tres proteínas que interactúan (CCAR2, RPL4, ZFP91) como activadores de la vía de señalización del factor nuclear-κB (NF-κB)40,41,42 (Fig. 3c). Además, el complejo SNW1 se ha identificado como un nuevo regulador transcripcional de la vía NF-κB43 (Fig. 4b complementaria). Las investigaciones muestran que el desequilibrio de la actividad de NF-κB provoca enfermedades relacionadas con la inflamación, como el cáncer, por lo que se considera que NF-κB es un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer44. La activación de las vías de NF-κB contribuye a la transformación leucémica iniciada por algunas quinasas oncogénicas cruciales45. Detectamos que el CAPG caracterizado interactúa con el complejo de la vía de señalización NF-κB en las células de AML, por lo que planteamos la hipótesis de que CAPG tiene potencial como objetivo para regular el proceso de la enfermedad de AML.

Para dilucidar la conexión entre CAPG y NF-κB durante el desarrollo de AML, recolectamos células de médula ósea de ratones normales y AML. Realizamos ensayos CAPG ChIP-seq para identificar la red reguladora de genes y evaluamos los datos para seleccionar picos específicos de AML enriquecidos en regiones de genes (Fig. 4a).

un diagrama de Venn de los loci de unión de CAPG en células de médula ósea normales y células de médula ósea de LMA. b Análisis de enriquecimiento de términos de ontología génica de genes regulados por CAPG solo en células de AML, P < 0,05 para cada resultado que se muestra en la figura. c Se compararon los niveles de ARNm de CAPG en el grupo control, knockdown y estimulado con 10 ng/ml de TNF-α. Los datos se presentan como medias ± SD. *** p < 0,001. Los resultados son de tres réplicas biológicas. d La adición de TNF-α revirtió la inhibición de la actividad de la vía NF-κB inducida por la eliminación de CAPG en células THP-1. Los datos se presentan como medias ± SD. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Los resultados son de tres réplicas biológicas. e El análisis KEGG reveló que los genes aguas abajo de CAPG se enriquecieron principalmente en la vía de señalización de NF-κB, P < 0,05 para cada resultado que se muestra en la figura. f Niveles de ARNm de leucemogénesis en control, grupo de eliminación de CAPG. Los datos se presentan como medias ± SD. ** p < 0,01, *** p < 0,001.

El análisis GO mostró que los genes regulados por CAPG estaban sustancialmente relacionados con la vía NF-κB en términos de componente celular y función molecular (Fig. 4b). También evaluamos los objetivos del factor de transcripción y los genes aguas abajo, identificamos a CAPG como un gen potencial involucrado en la regulación de la actividad transcripcional de la vía NF-κB (Fig. 5a, b complementaria). Toda esta evidencia implica que CAPG está relacionado con la activación de la vía NF-κB.

Para demostrar aún más nuestra conclusión, investigamos el enriquecimiento de CAPG en el genoma de las células THP-1. El análisis de ChIP-qPCR mostró que CAPG se enriqueció significativamente en la región de factores de transcripción de NF-κB en células THP-1 (Fig. 5c complementaria).

Además, regulamos a la baja la expresión de CAPG en células THP-1 (Fig. 4c y Fig. 5d complementaria)) y evaluamos los niveles de expresión de los genes aguas abajo de NF-κB (Fig. 4d). En particular, la eliminación de CAPG condujo a una marcada reducción en la expresión de varios genes de respuesta inmune y apoptóticos que se han asociado con la progresión de la LMA (Fig. 4d) 46,47. También recopilamos datos de RNA-seq después de eliminar CAPG y realizamos un análisis KEGG, que reveló que los genes regulados a la baja se enriquecieron significativamente en la vía NF-κB (Fig. 4e y Datos complementarios 4).

Para demostrar la regulación directa de la vía NF-κB por CAPG, activamos la vía estimulando las células THP-1 con TNF-α y observamos un rescate significativo de la expresión de genes aguas abajo (Fig. 4d). Además, cuando se agota CAPG, el nivel de expresión de la leucemogénesis se reduce significativamente (Fig. 4f). Estas observaciones implican que CAPG puede modular directamente la vía NF-κB, que a su vez afecta la progresión de la AML.

Para determinar si CAPG está asociado con la progresión de AML, realizamos experimentos de eliminación de CAPG para verificar su función. La eliminación de CAPG puede inhibir el crecimiento de las células de AML (Fig. 6a complementaria). Para explorar más a fondo el posible papel protumoral de CAPG en la AML, se trasplantaron cantidades iguales de células de AML murinas de control (Ctrl) o Capg knockdown (shCapg) en receptores singénicos de tipo salvaje (WT) (Fig. 5a).

un esquema experimental para la caída de Capg in vivo. b Análisis de transferencia Western que muestra la eliminación de Capg en células de AML clasificadas de la médula ósea de ratones con AML. c Análisis de RT-qPCR que muestra la eliminación de Capg en células AML clasificadas de la médula ósea de ratones AML con control de codificación (Ctrl) y eliminación de Capg (shCapg) en el día 45 después del trasplante. Los datos se presentan como medias ± SD. **p < 0,01 en comparación con el grupo control. Los resultados son de tres réplicas biológicas. d Diagramas de flujo citométrico representativos, el porcentaje de células GFP + AML en la médula ósea (BM) en el día 45 después del trasplante (n = 5 ratones). Cada punto representa un ratón. ***p < 0,001 en comparación con el grupo control. e Los diagramas de flujo citométrico representativos y los resultados estadísticos muestran que la eliminación de Capg reduce la carga de leucemia en la sangre periférica (PB) en el día 28 y el día 45 después del trasplante (n = 5 ratones). Cada punto representa un ratón. *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con el grupo de control. f Imagen representativa del bazo (arriba a la izquierda), el hígado (abajo a la izquierda) y el análisis cuantitativo del peso del bazo (centro) y el peso del hígado (derecha) del control de scramble y ratones AML de eliminación de Capg (n = 5 ratones). Cada punto representa un ratón. **p < 0,01, ***p < 0,001 en comparación con el grupo de control. g Tinción de Wright-Giemsa de un frotis de sangre de ratones AML de control y de eliminación de Capg. Barra de escala 20 µm. h Análisis de supervivencia de ratones trasplantados con control de codificación o células AML de eliminación de Capg. Los datos mostrados se combinan de dos trasplantes independientes (n = 5 ratones). p = 0,0018, prueba de rango logarítmico.

Para evaluar los efectos de la reducción de Capg, primero clasificamos las células de leucemia con proteína fluorescente verde (GFP) + de ratones Vector y shCapg AML y demostramos que los niveles de expresión del grupo shCapg se redujeron mediante RT-qPCR y western blot (Fig. 5b, c ).

Encontramos que la deficiencia de Capg agotó significativamente las células de AML en la sangre periférica (PB) (Fig. 5e) y redujo la carga de enfermedad en la médula ósea (Fig. 5d).

Además, el bazo y el hígado de los ratones AML se agrandaron significativamente, mientras que la eliminación de Capg alivió significativamente estos síntomas (Fig. 5f). De manera consistente, el análisis histológico mostró que los ratones AML en el grupo shCapg tenían menos infiltración de células leucémicas en la sangre periférica (Fig. 5g). Es importante destacar que la eliminación de Capg prolongó significativamente la supervivencia de los ratones AML, la mediana de supervivencia general (MOS) aumentó a 83 días en el grupo shCapg en comparación con 51 días en el grupo de control (Fig. 5h). Estos resultados indican que la eliminación de Capg suprime la progresión de la LMA inducida por MLL-AF9 en ratones, lo que respalda nuestra hipótesis de que Capg es oncogénico en la LMA.

Además, resuma el patrón, CAPG actúa en la vía de señalización de NF-κB mediante interactomas de proteínas para activar la expresión de genes aguas abajo. Puede acelerar la progresión de la AML al unirse directamente a las regiones de factores de transcripción de la familia NF-κB y activar la regulación de la expresión génica posterior.

En conjunto, los datos muestran que CAPG juega un papel importante en la progresión de la AML al regular la vía de señalización de NF-κB. Nuestro estudio identificó un gen CAPG asociado a un superpotenciador como un oncogén en la AML, lo que confirió un nuevo objetivo de tratamiento para la terapia de la AML.

Las modificaciones epigenéticas a menudo desempeñan un papel clave en la aparición y el desarrollo de varios tumores, y los superpotenciadores (SE) son un elemento epigenético que puede regular la expresión génica específica del tipo celular y desempeñar un papel crucial en las decisiones sobre el destino celular, incluida la transcripción. de las moléculas del punto de control inmunitario de las células tumorales23, el escape inmunitario25,26 y la expresión de citoquinas inflamatorias24. El análisis de RNA-seq a nivel del transcriptoma puede generar una gran cantidad de genes expresados ​​diferencialmente, lo que dificulta la identificación de genes que afectan significativamente la progresión de la enfermedad. Por el contrario, los superpotenciadores son muy específicos para cada tipo de célula y tienen potentes funciones reguladoras de la expresión génica, que pueden impulsar la expresión de genes que controlan y definen la identidad celular16. Al integrar datos de superpotenciadores con datos transcriptómicos, podemos reducir el rango objetivo y mejorar la precisión. Queda por verificar y explorar si la combinación de SE y transcriptómica específicos de tipo celular puede lograr una detección más precisa y eficiente de genes protumorales.

En este estudio, identificamos genes asociados con SE mediante la integración de SE específicos de células con datos de RNA-seq y encontramos seis genes (CAPG, CD207, GPR132, SLC7A11, HIPK3 y FCER1G) que se correlacionan con un mal pronóstico en la leucemia mieloide aguda (LMA). ) pacientes según la base de datos TCGA-LAML. CD207 es un receptor glicosilado que actúa como receptor específico de las células de Langerhans, procesando el antígeno para su presentación a las células T48. GPR132 es un receptor huérfano de leucemia que tiene el potencial de desencadenar la diferenciación mieloide49. En pacientes con leucemia mieloide aguda, la alta expresión de SLC7A11 se asocia con mal pronóstico50,51. HIPK3 está involucrada en el proceso de apoptosis y se asocia con mal pronóstico en varios tipos de cáncer52. FCER1G, como componente del receptor de inmunoglobulina E (IgE) de alta afinidad, está asociado con la respuesta inmune en varios tipos de cáncer53,54. Se ha informado que CAPG está estrechamente asociado con las proteínas tirosina quinasas en la LMA, vinculado a la resistencia a los medicamentos en la LLA55,56, y está asociado con un mal pronóstico en el cáncer de páncreas38 y de mama31,39. Se ha informado que CAPG está estrechamente asociado con las proteínas tirosina quinasas en la LMA y vinculado a la resistencia a los medicamentos en la LLA55,56. A continuación, verificamos la función de Capg en AML en un modelo de ratón y descubrimos que la expresión reducida de Capg puede obstaculizar la progresión de la enfermedad de AML. En conjunto, estos datos sugieren que el gen CAPG asociado al superpotenciador es un objetivo terapéutico potencial para la AML, y la confiabilidad del enfoque de análisis integrado basado en el superpotenciador, también es una herramienta prometedora para predecir biomarcadores de enfermedades.

Los superpotenciadores juegan un papel importante en la tumorigénesis y la progresión tumoral. En este estudio, encontramos el gen relacionado CAPG a través del superpotenciador y verificamos su papel en la LMA. El mecanismo biológico fundamental es la promoción de AML a través de la activación de la expresión de leucemogénesis aguas abajo a través del elemento epigenético SE, es un evento clásico de transición del destino celular a través de alteraciones epigenéticas dinámicas. Nuestro estudio demuestra a nivel genómico que la caída de CAPG impidió la progresión de la enfermedad de AML. La tecnología de edición de genes permite alteraciones moleculares precisas a nivel del genoma para el tratamiento de muchas enfermedades57. En los últimos años, la aplicación de la tecnología CRISPR a la modificación molecular epigenética ha sido fructífera58. El uso de CRISPR-dCas9 combinado con histona desacetilasa para borrar las modificaciones de histonas y disminuir la actividad de SE tendrá el potencial de restringir la expresión génica relacionada con SE y obstaculizar la progresión de la enfermedad59. Especulamos que a nivel epigenético, la expresión del protooncogén CAPG se verá reducida por la actividad inhibitoria de SE, lo que limitará la progresión de la LMA.

La inestabilidad genómica y la anomalía epigenética pueden facilitar directamente la aparición de enfermedades. Se ha informado que las alteraciones epigenéticas, incluida la metilación del ADN, la modificación de histonas y la accesibilidad de la cromatina, desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica. Según el "dogma central genético" de la biología molecular, la información genética se transmite por medio de proteínas de ADN-ARN. Como último eslabón de este proceso, las proteínas funcionan como el principal sepulturero del movimiento vital formando complejos macromoleculares. Cada vez hay más pruebas que describen la esencialidad de las interacciones proteína-proteína (PPI) que gobiernan una amplia gama de procesos celulares.

Se informó que CAPG es una proteína de unión a actina de la superfamilia de gelsolina, asociada con la organización del citoesqueleto. Se ha encontrado una mayor expresión de CAPG en varios cánceres metastásicos, lo que sugiere su papel en la invasión y metástasis de células cancerosas60,61,62. Por lo tanto, identificamos los interactomas CAPG por inmunoprecipitación con espectrometría de masas (IP-MS). Descubrimos en el interactoma CAPG los componentes de los complejos de proteínas reguladoras, como el complejo NSL de proteína remodeladora de cromatina, el complejo SNW1, el complejo MLL1-WDR5 y la proteína enzimática de modificación que involucra al complejo WMM. Múltiples estudios independientes han encontrado un vínculo físico entre la agresividad del cáncer y estos complejos reguladores epigenéticos. Está bien establecido que el complejo NSL se correlaciona con la agresividad del cáncer63 y la escasa supervivencia64,65. Además, la interrupción de la interacción MLL1-WDR5 se considera un enfoque terapéutico para la leucemia66. Indicando la importancia de estas vías y factores reguladores epigenéticos para la progresión de la AML. A continuación, analizamos la función molecular de los socios de interacción y encontramos que tres de ellos (CCAR2, RPL4, ZFP91) han sido informados como activadores de la vía de señalización de NF-κB. CCAR2, conocido como DBC1, puede regular anoikis a través de la vía NF-κB40,67. CCAR2 estimula la fosforilación de relA nuclear (RelA), mejorando la actividad transcripcional de NF-κB y regulando genes diana que están asociados con la resistencia a anoikis40,67. Mientras tanto, RPL4 y ZFP91 como activadores de la vía NF-κB, inducen la proliferación y promueven el proceso del cáncer41,68,69. ZFP91 promueve la proliferación de células cancerosas y la carcinogénesis mediante la activación de la proteína correguladora transcripcional HIF-1 a través de NF-κB68. RPL4 involucrado en un complejo de proteínas ribosómicas que activa NF-κB a través de CD4041. SWNI también está vinculado a la vía NF-κB en el interactoma CAPG, su participación implica la unión al NF-κB para facilitar la elongación transcripcional de los genes diana43. Los resultados anteriores indican que CAPG participa en la regulación de las transducciones de señales de NF-κB que no se han informado antes.

Además, utilizamos datos CAPG ChIP-seq para confirmar los hallazgos antes mencionados. Además de los roles bien conocidos en la unión molecular y la estructura del citoesqueleto, GO y el análisis de motivos mostraron que los genes regulados por CAPG estaban fuertemente vinculados a la vía NF-κB. La eliminación de CAPG redujo significativamente la expresión de genes aguas abajo de NF-κB. Todo esto respalda la afirmación realizada anteriormente de que CAPG está involucrado en la regulación de la vía de señalización de NF-κB. Esto indica que la identificación de los interactomas de proteínas puede proporcionar una base para estudiar las funciones de las proteínas, y es una forma importante y una tendencia futura para estudiar las funciones potenciales de los genes codificadores.

En conjunto, la expresión del gen CAPG asociado al superpotenciador se corresponde con la progresión en la LMA y está relacionada con la activación de la vía NF-κB. Además, postulamos que CAPG podría ser un objetivo terapéutico viable para la LMA, y la confiabilidad del algoritmo analítico integral se basa en el superpotenciador, también una herramienta potencial para predecir biomarcadores de patologías.

Las células de la línea celular monocítica humana THP-1 se adquirieron de Solarbio (China), se cultivaron en medios RPMI (Corning, 10-040-CV) suplementados con FBS al 10 % y penicilina al 1 % y estreptomicina y dieron negativo regularmente para la contaminación por micoplasma utilizando PCR. Las células se estimularon con TNF-α (10 ng/ml) para reactivar el experimento de la vía NF-κB.

Para identificar los potenciadores típicos, inicialmente cosimos la base de datos pública H3K27AC ChIP-Seq (NE SRR1915572, Mo SRR787551, HSPC SRR2094192, AML1# SRR3503794, AML2# SRR3503797, AML2# SR35038801) ALIMENTOS 500 BUTS ALIMENTOS, ALIMENTOS 500 BUNTOS, ALIMENTOS, ALIMENTOS, ALIMENTOS 500 BAYO, AJUNTOS, AJUNTOS, ANTES DE REATOS, AMLINE ADEMÁS, BUNCES DE REMATS, ANTES DE REA. Si el la cobertura de brechas es superior a 0,4. Luego, el potenciador sin procesar cosido junto con H3K27ac alineado y las lecturas de entrada se usaron para ejecutar el algoritmo ROSE. Brevemente, los potenciadores constituyentes se unieron si estaban dentro de una cierta distancia y se clasificaron por su señal de entrada restada de H3K27ac. Y luego, separamos los súper potenciadores de los potenciadores típicos al identificar un punto de inflexión de la señal H3K27ac; la pendiente aquí fue 1. Finalmente, clasificamos los genes como genes asociados a SE por Rose GeneMapper para anotar los genes dentro del rango de 50 kb de los súper potenciadores.

Los datos de AML se utilizaron para realizar la validación con la base de datos (http://gibk21.bse.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)70 y la base de datos de Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) (http://gepia.cancer -pku.cn)71. La supervivencia general (SG) se estimó mediante la prueba de rangos logarítmicos y se consideró que un valor de p < 0,05 denotaba datos estadísticamente significativos.

El ARN total se extrajo de células GFP+ clasificadas con el reactivo TRIzol (15596026, Invitrogen) y el ADNc se sintetizó con PrimeScript™ RT Master Mix (RR036A, Takara). La qPCR en tiempo real se realizó con SYBR® Premix Ex Taq™ II (RR820A, Takara) en el sistema Applied Biosystems™ 7500 (Thermo Scientific). Los datos exhibidos representan el cambio de pliegue (FC) del grupo experimental frente al grupo de control. En resumen, ΔCt se calculó como ΔCt = Ct (gen de prueba) - Ct (gen de referencia). ΔΔCt se calculó como ΔΔCt = ΔCt (grupo experimental) - ΔCt (grupo de control). La FC de un gen de prueba en el grupo experimental frente al grupo de control se calculó como FC = 2 (−ΔΔCt). Cada gen se probó por triplicado en cada experimento independiente, y todos los experimentos se triplicaron.

Las células T 293 se transfectaron con plásmidos retrovirales MSCVMLL-AF9-IRES-GFP que contenían secuencias de ADNc de MLL-AF9 y GFP. Células de médula ósea de ratones C57 tratados con 5-fluorouracilo (5-FU) durante 5 días se infectaron con retrovirus dos veces con un intervalo de 24 h. Las células infectadas de 400 K se mezclaron con células protectoras de 100 K para inyectarlas por vía intravenosa en ratones receptores WT irradiados con una dosis letal de 9 Gy. El número de animales utilizados por experimento se muestra en las leyendas de las figuras. Los lentivirus de silenciamiento y control de Capg se prepararon mediante HEK293T transfectado por pLKO.1-puro junto con vectores de empaquetamiento psPAX2, pMD2.G. Se recolectaron células de médula ósea MLL-AF9-GFP+ de ratones AML 35 días después del trasplante. Estas células se infectaron con lentivirus de control o silenciamiento de Capg y se seleccionaron adicionalmente con 1 mg/ml de puromicina durante 72 h. Las células GFP+ de 200 K analizadas con puromicina se mezclaron con células protectoras de 100 K para inyectarlas por vía intravenosa en ratones receptores CD45.2+ irradiados con una dosis subletal de 4,5 Gy.

Para identificar a los socios de CAPG en las células de AML humana, eliminamos los complejos de proteína CAPG de la extracción nuclear en THP-1 por el anticuerpo CAPG (ab181092, abcam). Las células THP-1 se expandieron a 10 placas de 150 mm de diámetro para la preparación de proteína total. La proteína se aclaró previamente con 0,5 ml de perlas de agarosa de proteína A + G (P2055, Beyotime) en 16 ml de tampón IP DNP (HEPES 20 mM, pH 7,9, glicerol al 20 %, KCl 100 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, NP-40 al 0,02 %, DTT 0,5 mM, PMSF 0,2 mM, cóctel inhibidor de proteasa al 0,1 %) durante la noche a 4 °C. Al mismo tiempo, 25 μg de anticuerpo CAPG o IgG (12-370, Millipore) conjugaron perlas de agarosa con proteína G incubando en tampón IP DNP durante la noche a 4 °C. Los extractos nucleares previamente aclarados se combinaron con las perlas conjugadas con anticuerpos y se rotaron durante 5 ha 4 °C. Después de cinco lavados en Tampón D (HEPES 20 mM pH = 7,6, EDTA 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 100 mM, glicerol al 20 %) suplementado con NP-40 al 0,02 %, el material unido se eluyó hirviéndolo durante 5 min en 2xSDS. búfer de carga. Poner la solución en las columnas de concentración, centrifugar 14.000 × g 30 min a 20 °C. Centrifugar hasta que la solución esté cerca de 40 μl. Las muestras se fraccionaron en geles Omni-PAGE™Hepes-Tris (LK206, Epizyme) y se tiñeron con InstantBlue Protein Stain (AQ211, Analysis Quiz). Los productos de una sola purificación se sometieron a secuenciación y análisis de datos de LC-MS/MS de carril completo. Se realizaron dos réplicas biológicas para cada anticuerpo.

Los archivos de MS sin procesar se analizaron y buscaron en la base de datos de proteínas en función de las especies de las muestras utilizando MaxQuant (1.6.2.10)72.

De acuerdo con la intensidad de cada proteína en la muestra, con la IgG de control como denominador y el grupo experimental CAPG como numerador, se calculó el valor de cambio de veces. Seleccionamos proteínas con FC > 2 como el interactoma de CAPG.

La interacción de proteínas y los datos complejos fueron accedidos directamente desde:

CADENA Versión 11.5 (https://cn.string-db.org/)73,

CORUM Versión 3.0 (https://mips.helmholtz-muenchen.de/corum/#)74,

UniProt (https://www.uniprot.org/)75.

La base de datos STRING evaluó la red PPI final confirmada y el software Cytoscape versión 3.9.1 interactuó con los individuos reconocidos.

Se usó formaldehído al 1% en PBS para entrecruzar las células durante 10 min, seguido de inactivación con glicina 125 mM en hielo. Las células se recolectaron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, luego se almacenaron a -80 ° C para su uso. Las células reticuladas congeladas se descongelaron en hielo y luego se resuspendieron en tampón de lisis I (HEPES-KOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 %, NP-40 al 0,5 %, Triton X-100 al 0,25 %, proteasa inhibidores). Después de rotar durante 10 min a 4 °C, las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis II (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, inhibidores de proteasa). Después de rotar durante 10 min a 4 °C, las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de sonicación (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM pH 8,0, SDS al 0,1 % y Triton X-100 al 1 %). , inhibidores de la proteasa) para sonicación. Los lisados ​​sonicados se aclararon una vez mediante centrifugación a 16 000 × g durante 10 min a 4 °C. El material de entrada estaba reservado. El resto se incubó con perlas magnéticas unidas con el anticuerpo CAPG (ab181092, abcam) para enriquecer los fragmentos de ADN durante la noche a 4 °C. Las perlas se lavaron con tampón de lavado (HEPES-KOH 50 mM, pH 7,5, LiCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, desoxicolato de Na al 0,7 %, NP-40 al 1 %) y tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, 1 EDTA mM, NaCl 50 mM) en orden. Las perlas se retiraron mediante incubación a 65 °C durante 30 min en tampón de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS al 1 %). Los enlaces cruzados se invirtieron durante la noche a 65 °C. Para purificar el ADN eluido, se añadieron 200 mL de TE y luego el ARN se degradó mediante incubación en 8 μl de 10 mg/mL de ARNasa A a 37 °C durante 2 h. La proteína se degradó mediante la adición de 4 μl de 20 mg/mL de proteinasa K y la incubación a 55 °C durante 2 h. Se realizó una extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico seguida de precipitación con etanol. A continuación, el ADN se ha resuspendido en 50 ml de TE. La preparación de bibliotecas se realizó con un kit de preparación de bibliotecas de ADN (Vazyme, n.° TD501), las bibliotecas se amplificaron durante siete ciclos y se seleccionaron por tamaño con perlas Beckman AMPure XP.

Para la alineación de lectura y la cuantificación de expresión, primero eliminamos las lecturas de baja calidad y recortamos la secuencia del adaptador con Trim Galore. Luego mapeamos las lecturas restantes del extremo del par al genoma de referencia usando STAR con paquetes de opciones ENCODE. Con el recuento de HTSeq, contamos las lecturas asignadas de forma única y normalizamos el recuento de lecturas mediante la media recortada de los valores M (TMM) y lo transformamos en lecturas por kilobases por millón de lecturas (RPKM) por edgeR. Con un corte de expresión de RPKM R 1 en al menos un grupo de muestra, eliminamos los genes poco abundantes y detectamos los genes expresados ​​​​diferencialmente usando edgeR. Los genes se consideraron expresados ​​diferencialmente cuando la tasa general de descubrimiento falso (FDR) <0,01 y el cambio de veces es superior a 2,0.

Los archivos Fastq fueron adaptadores recortados por TrimGalore (versión 0.6.4, https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) y alineados con el genoma de referencia mm9 usando Bowtie2 (versión 2.2.5, http://bowtie-bio.sourceforge.net /bowtie2/) con parámetros predeterminados. Las lecturas con una puntuación de mapa <30 y las duplicaciones de PCR se filtraron mediante Samtools76 (versión 1.9, http://samtools.sourceforge.net). Las lecturas alineadas con las regiones en la lista negra de ENCODE (http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/) se descartaron a través de bedtools77 (versión 2.29.1, https://bedtools.readthedocs.io/en/ el último/). Los picos se llamaron con macs278 (versión 2.1.2, parámetros: '-g mm -q 0.05 -m 5 50') usando la entrada como control. Se usó DiffBind (versión 2.10.0) para analizar los sitios de unión diferenciales.

Tome 20–30 μL de sangre periférica a través de la vena de la cola del ratón y agréguela al tubo de anticoagulación. Tome las células de la médula ósea del fémur y la tibia de los ratones sacrificados. Los glóbulos rojos se lisaron y las células de la médula ósea se filtraron utilizando un filtro de células de 100 mm. Anticuerpos monoclonales contra Mac-1 (M1/70, Biolegend), Gr-1 (RB6-8C5, Biolegend), c-Kit (2B8, Biolegend), Lin mix (Gr1, CD4, CD3, CD8a, Ter119, B220, IgM ) (Biolegend), CD34 (MEC14.7, Biolegend), Sca1 (D7, Biolegend), FcgRII/III (93, Biolegend), IL-7Ra (A7R34, Biolegend) (todos usados ​​50 ng por millón de células) donde indicado. Después de la incubación con anticuerpos, las muestras se analizaron con el citómetro de flujo Attune NxT (Thermo) y los resultados se analizaron con el software FlowJo. Aquí, se usó 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (A1310, Life Technologies) para excluir las células muertas.

Los términos ontológicos enriquecidos para las proteínas del interactoma CAPG se identificaron mediante STRING. Se hizo referencia al proceso biológico GO, la función molecular GO y el componente celular GO para identificar términos de ontología con el valor de p ajustado < 0,05.

Los datos se expresan como medias ± SEM. Para todos los experimentos, excepto la determinación de la supervivencia, los datos se analizaron mediante pruebas t de Student y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p < 0,05. La supervivencia de los dos grupos se analizó mediante una prueba de rangos logarítmicos y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio/repositorios y el número de acceso se pueden encontrar a continuación: NCBI BioProject PRJNA876046. La información sobre anticuerpos y oligos se puede encontrar en los Datos complementarios 1 y 2. Los datos de origen para el IP-MS se proporcionan como Datos complementarios 3. Los datos CAPG KD RNA-seq se pueden encontrar en los Datos complementarios 4. Los escaneos sin recortar de las transferencias se muestran en Figura complementaria 7. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

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Nos gustaría agradecer al Fondo de Medicina de la Universidad de Pekín para Fomentar la Innovación Científica y Tecnológica de Jóvenes Académicos (BMU2022PYB014) apoyado por "los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales"; Fondo Semilla de Investigación Científica del Primer Hospital de la Universidad de Pekín (2022SF09); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 81870127) (NSFC 82072369) (NSFC 82200178).

Departamento de Laboratorio Clínico, Primer Hospital de la Universidad de Pekín, Pekín, China

Qian Ma y Haixia Li

Departamento de Hematología, Séptimo Hospital Afiliado, Universidad Sun Yat-sen, Shenzhen, China

Minyi Zhao

Departamento de Hematología, Tercer Hospital Afiliado, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, China

Bing largo

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QM diseñó y realizó la mayoría de los experimentos y analizó los datos. MZ y BL analizaron los datos. HL supervisó el proyecto. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Haixia Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La recolección de muestras fue aprobada por la junta de revisión institucional y el comité de ética del Primer Hospital de la Universidad de Pekín.

Communications Biology agradece a Rhys Morgan, Mohammad Azam y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Georgios Giamas y Manuel Breuer. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ma, Q., Zhao, M., Long, B. et al. El gen CAPG asociado al superpotenciador promueve la progresión de la LMA. Commun Biol 6, 622 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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Recibido: 28 agosto 2022

Aceptado: 23 de mayo de 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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