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Oct 27, 2023

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Naturaleza Ingeniería Biomédica

Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

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Durante la cirugía, el diagnóstico histopatológico rápido y preciso es fundamental para la toma de decisiones clínicas. Sin embargo, el método predominante de patología de consulta intraoperatoria es intensivo en tiempo, mano de obra y costos, y requiere la experiencia de patólogos capacitados. Aquí mostramos que las muestras de biopsia se pueden analizar en 30 minutos mediante la evaluación secuencial de los fenotipos físicos de las células suspendidas singularizadas disociadas de los tejidos. El método de diagnóstico combina la disociación mecánica de los tejidos sin enzimas, la citometría de deformabilidad en tiempo real a tasas de 100–1000 células s−1 y el análisis de datos mediante la reducción de la dimensionalidad no supervisada y la regresión logística. Los parámetros de fenotipo físico extraídos de imágenes de campo claro de células individuales distinguieron subpoblaciones de células en varios tejidos, mejorando o incluso sustituyendo las mediciones de marcadores moleculares. Utilizamos el método para cuantificar el grado de inflamación del colon y para discriminar con precisión el tejido sano y tumoral en muestras de biopsia de colon humano y de ratón. Este enfoque rápido y sin etiquetas puede ayudar a la detección intraoperatoria de cambios patológicos en biopsias sólidas.

Los cambios en las propiedades físicas de las células, como el tamaño, la forma o la deformabilidad de las células, son fundamentales para la patología de algunas enfermedades y tienen un gran potencial como marcador de diagnóstico o pronóstico1,2. En las últimas décadas, se ha desarrollado una variedad de herramientas para examinar las propiedades mecánicas de las células, incluida la aspiración con micropipeta, microscopía de fuerza atómica, reometría de microesferas y trampas ópticas3,4. El campo ha visto un aumento exponencial de publicaciones que sugieren una fuerte correlación entre el fenotipo mecánico celular y el estado de la enfermedad, incluida la sepsis5,6, la malaria7, la diabetes8, la anemia de células falciformes9 y el cáncer10,11,12. Desafortunadamente, estas técnicas convencionales adolecen de un bajo rendimiento celular y del requisito de un profundo conocimiento especializado para su funcionamiento, lo que limita su uso como herramienta de diagnóstico. La citometría de fluorescencia y deformabilidad en tiempo real (RT-FDC)13,14 es una de varias técnicas microfluídicas nuevas10,15,16,17,18,19,20,21,22 que han superado estos inconvenientes, lo que permite evaluar las propiedades físicas de células individuales sin etiquetas y de alto rendimiento, lo que abre una nueva vía para el diagnóstico clínico. RT-FDC no solo es rápido (con hasta 1000 células analizadas por segundo), sino que, además de la deformabilidad de las células, también proporciona información multidimensional obtenida directamente de las imágenes de las células. El potencial de diagnóstico de RT-FDC se ha demostrado en muchas enfermedades humanas que van desde la leucemia hasta infecciones bacterianas y virales, incluida la enfermedad por coronavirus 2019 (refs. 23, 24, 25, 26, 27). Sin embargo, hasta ahora, la aplicabilidad de la técnica se limitaba a analizar células cultivadas o biopsias líquidas de sangre o médula ósea.

La biopsia de tejido sólido es el método más común para caracterizar la malignidad y es fundamental para guiar a los cirujanos durante el manejo intraoperatorio y perioperatorio de pacientes con cáncer. La evaluación diagnóstica de las biopsias de tejido sólido suele realizarse a través de una consulta intraoperatoria de patología, que se basa en el análisis histopatológico de secciones de biopsia congeladas28. El flujo de trabajo convencional del diagnóstico intraoperatorio implica numerosos pasos de procesamiento, reactivos de tinción y la inspección microscópica de cortes de tejido por parte de patólogos experimentados para un análisis experto. Además, la preparación de muestras requiere mucho tiempo, recursos y mano de obra. Se han propuesto flujos de trabajo alternativos28, incluida la espectroscopia Raman estimulada29,30, la tomografía de coherencia óptica31 y la microscopía de fluorescencia32,33, pero aún no se han implementado. Por lo tanto, es inminente la necesidad de un enfoque que reduzca la preparación de muestras y el tiempo de diagnóstico.

En este artículo, presentamos un método de diagnóstico rápido y sin etiquetas para biopsias de tejido sólido. El enfoque combina la disociación mecánica libre de enzimas de los tejidos usando un triturador de tejidos (TG) para el aislamiento rápido y simple de células individuales viables34,35 con la evaluación secuencial de los fenotipos físicos celulares de miles de células individuales usando RT-FDC. Primero, examinamos un panel de diferentes tejidos de ratón y evaluamos el rendimiento celular, la viabilidad y la viabilidad de la medición RT-FDC sobre la disociación mecánica del tejido. Ilustramos la capacidad de distinguir subpoblaciones de células de tejido basándose únicamente en los parámetros físicos derivados de la imagen sin conocimiento previo o etiquetado molecular adicional, lo que puede mejorar la citometría de flujo convencional, que se basa en paneles multicolores de marcadores para identificar células. También mostramos que nuestro enfoque puede determinar los cambios inflamatorios en el tejido del colon, en función de la medición de la deformabilidad celular en el sistema de microfluidos. Además, examinamos muestras de biopsia congeladas y frescas de colon humano y de ratón y mostramos que RT-FDC puede distinguir tejidos sanos de cancerosos, mediante el uso de análisis de componentes principales (PCA) y aprendizaje automático en los datos multidimensionales. Los hallazgos demuestran que la evaluación del fenotipo físico de las células individuales derivadas de tejido mediante RT-FDC es una estrategia alternativa para detectar un estado inflamatorio o maligno. Nuestro procedimiento, que puede generar resultados en 30 minutos, tiene potencial como canal de diagnóstico intraoperatorio para detectar con sensibilidad cambios patológicos en biopsias y, de manera más general, para identificar y caracterizar poblaciones celulares en tejidos de manera imparcial y sin marcadores.

Antes de evaluar el fenotipo físico de las células, el primer desafío al que se enfrentó fue la extracción rápida de células individuales de tejidos sólidos en una escala de tiempo de minutos, mientras se buscaba una representación de máxima precisión de la heterogeneidad de las subpoblaciones celulares. Para ello, utilizamos un TG, un dispositivo mecánico de disociación basado en filas de dientes que giran en sentido contrario (fig. 1) ensamblados en un tubo Falcon35. El dispositivo ejecuta automáticamente una secuencia predefinida de pasos alternos de corte y trituración para aislar células individuales de un tejido sólido. En total, se procesaron diez tejidos murinos diferentes utilizando TG o protocolos enzimáticos convencionales para la comparación (Tablas complementarias 1 y 2). La viabilidad fue del 70 al 90% en la mayoría de los tejidos; el rendimiento celular fue similar a la disociación enzimática y dependiente del tejido (Datos ampliados Fig. 1). La ventaja clave de la disociación mecánica fue que el tiempo de procesamiento tomó menos de 5 minutos por muestra, en comparación con decenas de minutos o incluso varias horas para los protocolos enzimáticos. La velocidad de la extracción presumiblemente ayuda a preservar los fenotipos bioquímicos y biofísicos en condiciones cercanas a las in situ.

La muestra de tejido se disecciona en pequeños trozos y se coloca en el rotor interior de la unidad TG que contiene medio de cultivo35. La disociación mecánica se realiza mediante una secuencia preprogramada y ejecutada automáticamente de rotaciones en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj. Las células disociadas se centrifugan y se resuspenden en tampón de medición. La muestra se carga en un chip de microfluidos y se analiza mediante RT-FDC. Se captura una imagen de campo claro de cada una de las 10.000 celdas típicas. Se extraen varias características de las imágenes, que se utilizan para el análisis multidimensional. En total, el procedimiento desde el tejido hasta el resultado lleva menos de 30 min.

A continuación, las células individuales extraídas se analizaron mediante RT-FDC. En una medición RT-FDC, cientos de células por segundo, suspendidas en un tampón de metilcelulosa de alta viscosidad, se empujan a través de la constricción de un canal de microfluidos, donde se deforman por gradientes de tensión y presión y se obtiene una imagen de cada célula. Se calcularon varios parámetros físicos a partir de las imágenes en tiempo real, a saber, deformación, tamaño de celda, brillo, desviación estándar de brillo, relación de aspecto y relación de área (para obtener detalles, consulte la Tabla complementaria 3). Además, se utilizó el módulo de fluorescencia14 para detectar la expresión de marcadores de superficie celular.

En la Fig. 2 se muestran ejemplos ilustrativos de la distribución de parámetros físicos de células extraídas de hígado, colon y riñón. Cada uno de estos grupos estaba compuesto por células con fenotipo físico similar (según el gráfico de densidad) y expresión de marcador de superficie (extensión ampliada). Datos Fig. 2). Por ejemplo, un grupo de células con propiedades físicas similares (en este caso definidas por el brillo promedio y el tamaño celular) estaba compuesto principalmente por células positivas para la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) (Fig. 2a), lo que demuestra que una población limpia de células epiteliales las células se pueden distinguir sin etiquetas, utilizando únicamente parámetros físicos derivados de imágenes.

a, Diagrama de dispersión ilustrativo del promedio de brillo frente al tamaño celular para células aisladas del hígado que muestra numerosos grupos de células. La marcada población de células (que forma un grupo de células con un tamaño de 25 a 50 μm2 y un brillo promedio de 100 a 115) está enriquecida con células positivas para EpCAM (epiteliales), pero carece de células positivas para CD31 (endoteliales) o células positivas para CD45 (leucocitos). ). FITC, isotiocianato de fluoresceína; PE, ficoeritrina; APC, aloficocianina. b, Gráficos de dispersión ilustrativos de células de colon teñidas para marcadores de superficie celular EpCAM y CD45. Dentro de la población positiva para EpCAM, se pueden identificar siete subpoblaciones de células sobre la base de gráficos de densidad de parámetros físicos, como el brillo y el tamaño de la célula. c, Gráficos de dispersión ilustrativos de células renales teñidas para EpCAM y CD45. Dentro de la población de CD45, se identifican cuatro subpoblaciones en función de las similitudes en el tamaño y la deformación de las células. El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad de eventos.

La Figura 2b, c ilustra la ventaja de usar fenotipado físico basado en imágenes además de usar solo citometría de flujo convencional basada en fluorescencia. En la citometría de flujo convencional es casi imposible distinguir subpoblaciones individuales de células epiteliales (EpCAM+) a menos que se utilicen paneles adicionales de anticuerpos fluorescentes contra tipos de células conocidos y predefinidos. La distinción de varias subpoblaciones fue posible con RT-FDC debido a la profundidad de información adicional proporcionada por los parámetros de fenotipo físico. Dentro de las células epiteliales del colon, identificamos siete grupos de células basados ​​únicamente en el brillo y el tamaño (Fig. 2b). De manera similar, dentro de la población de leucocitos (CD45 +) del riñón, encontramos cuatro grupos diferentes según el tamaño de la célula y los parámetros de deformación (Fig. 2c). Observamos que, utilizando la modalidad de clasificación desarrollada recientemente para RT-FDC36, cualquiera de estas poblaciones celulares puede aislarse de acuerdo con los parámetros derivados de la imagen y analizarse para determinar su identidad molecular, por ejemplo, mediante secuenciación de ARN posterior.

RT-FDC también se puede utilizar para capturar interacciones celulares. Usando los parámetros de relación de aspecto y tamaño celular, identificamos dobletes celulares en muestras de timo, bazo y riñón. Muchos dobletes estaban compuestos por dos tipos de células diferentes, según los marcadores de la superficie celular (Datos ampliados, Fig. 3). La posición de la célula dentro del canal en combinación con la posición del pico de fluorescencia nos permitió identificar, por ejemplo, que un doblete estaba compuesto por un leucocito (CD45+) y una célula endotelial (CD31+) (Datos ampliados Fig. 3b, d, f). Con el módulo de clasificación RT-FDC36, los dobletes de células pueden aislarse sin etiquetas para realizar más análisis moleculares y aplicaciones posteriores, incluidos los estudios de células inmunitarias que interactúan físicamente en el tejido37.

Una cuestión importante a tener en cuenta cuando se utiliza la disociación mecánica de tejidos y el análisis sin etiquetas por fenotipo físico es si este enfoque representa fielmente la distribución de los tipos de células presentes en el tejido. Si bien esto es imposible de evaluar para todos los tejidos y aplicaciones en general, es instructivo observar más de cerca el hígado como un tejido específico (Datos ampliados Fig. 4a-c). La disociación mecánica parece menos perjudicial para las células sensibles, como los hepatocitos, que son propensos a la muerte celular y, a menudo, se pierden durante los procedimientos estándar de aislamiento38. Tras la disociación del tejido hepático murino, las células de más de 150 μm2 de área celular transversal (~7 μm de radio) se determinaron como hepatocitos según su morfología y tamaño39. Como el principal tipo de célula parenquimatosa del hígado, los hepatocitos representan el 70 % de la población de células hepáticas y ocupan casi el 80 % del volumen hepático40. En la suspensión celular obtenida usando TG, la proporción de hepatocitos a células totales fue en promedio 52,5%, mucho más cercana a la representación real en tejido en comparación con el 7,7% para la digestión enzimática. Además, se pudieron identificar distintas subpoblaciones de hepatocitos según el tamaño celular. Presumimos que estas poblaciones corresponden a hepatocitos de diferente ploidía, ya que el contenido de ADN está fuertemente correlacionado con el volumen celular41. Si se confirma, por ejemplo, mediante la correlación con un análisis de fluorescencia cuantitativa de la cantidad de ADN en cada célula, nuestro método podría servir como una herramienta para el control sin etiquetas del envejecimiento y los procesos fisiopatológicos en el hígado, que están relacionados con la proporción de poliploides. hepatocitos42. En otros tejidos, como el pulmón, las diferencias entre la disociación mecánica y enzimática no fueron tan prominentes y ninguna técnica dio un sesgo hacia una población celular específica (Datos extendidos Fig. 4d). Sin embargo, para la aplicabilidad general de nuestro enfoque a las diversas posibilidades que abre para el análisis de tejidos, por supuesto, se necesita más trabajo experimental.

Existen aplicaciones específicas, en particular de diagnóstico, de nuestro enfoque en las que la determinación fiel de los números de células originalmente presentes en el tejido in situ es menos importante. Después de todo, los fenotipos físicos detectados también reflejan diversas respuestas celulares al procesamiento de la muestra, la adhesión de las células entre sí y con la matriz extracelular, y la conectividad y la fuerza mecánica dentro del tejido. Todos estos aspectos pueden verse alterados en condiciones patológicas y serían recogidos por nuestro enfoque. Demostramos la utilidad diagnóstica en dos casos de uso específicos clínicamente relevantes relacionados con el colon.

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son trastornos inflamatorios crónicos del intestino asociados con una barrera epitelial/mucosa comprometida y activación/reclutamiento de células inmunitarias43. Aunque la etiología de la EII aún no se comprende completamente, gran parte de nuestra comprensión sobre la EII proviene de modelos animales experimentales de inflamación intestinal. Uno de estos modelos es la transferencia adoptiva de células T vírgenes a ratones deficientes en Rag1 para inducir colitis experimental (modelo de colitis crónica de transferencia de células T, en adelante denominado colitis de transferencia). Luego, la gravedad se cuantifica comúnmente a través de una puntuación histopatológica generada a partir de portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) del tejido del colon.

Nuestro objetivo fue investigar los cambios en el fenotipo físico de las células del colon durante la colitis de transferencia. Los diagramas de dispersión de la deformación frente al tamaño celular sugieren una diferencia entre la enfermedad y el tejido sano (Fig. 3a), donde las células del tejido enfermo aparecen menos deformadas que las células del tejido sano. Tras el examen de las células CD45+ (Fig. 3b,c), se hizo evidente que las muestras de colitis por transferencia se caracterizaban por una gran abundancia de leucocitos con baja deformación, probablemente linfocitos. En general, encontramos una disminución significativa de la deformación mediana con un tamaño del efecto fuerte en las muestras de colitis de transferencia, acompañada de un aumento significativo en el porcentaje de leucocitos, de acuerdo con la infiltración de linfocitos transferidos adoptivamente (N = 14; Fig. 3d). La mediana de la deformación de las células se correlacionó negativamente con el porcentaje de leucocitos, con un coeficiente de correlación de Pearson de r (12) = −0,69 (P = 0,0065; Fig. 3e). Además, los valores medianos del tamaño de la celda y la deformación se vincularon con la puntuación H&E de expertos (Fig. 1 complementaria); aunque la correlación mediante ajuste lineal no fue posible. Las muestras de colitis de transferencia con una puntuación alta de H&E exhibieron un tamaño celular más grande y una deformación más baja en comparación con el tejido sano. Una observación digna de mención fue que el tejido sano era más difícil de dividir mecánicamente en células individuales que el tejido enfermo, lo que produjo más eventos para el análisis.

a, Gráficos de dispersión de tamaño celular frente a deformación de células aisladas de muestras de tejido de colitis de transferencia (TC) en comparación con tejido de colon murino sano (Control); con el tamaño de celda correspondiente y los histogramas de deformación. b, Las mismas dos muestras de colon seleccionadas para células positivas para CD45, que muestran el enriquecimiento de leucocitos en muestras de colitis de transferencia, acompañado de cambios en los parámetros de fenotipo físico. El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad de eventos. c, Gráficos de estimación de la densidad del núcleo de las muestras que se muestran en ayb, con contornos que marcan los niveles 0,5 (sombra clara, contorno exterior) y 0,95 (sombra oscura, contorno interior). d, Cuantificación de la deformación media y porcentaje de células positivas para CD45 (n = 14 animales biológicamente independientes en tres experimentos independientes). Los recuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartílico. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney bilateral; deformación mediana *P = 0,0227 y r = 0,55, % CD45+ **P = 0,0041 y r = 0,7 (r, tamaño del efecto). e, correlación de Pearson bilateral de la deformación media de todas las células y la proporción de leucocitos (células CD45+); P = 0,0065 y r = −0,69.

Nuestras observaciones de que el fenotipo físico de las células cambia con la inflamación, junto con la creciente evidencia de que la inflamación crónica se asocia con malignidad44,45, nos llevó a especular que nuestro enfoque podría detectar cambios en muestras de biopsia de tumores. Confirmamos esta posibilidad tanto para muestras humanas como de ratón.

Estudios previos han encontrado diferencias entre las propiedades mecánicas de las células cancerosas y sus contrapartes sanas11,12,46,47,48,49. Un inconveniente importante de estos estudios es la laboriosa preparación de muestras y el bajo rendimiento de medición que limita la conversión de estos estudios a enfoques de diagnóstico reales. Dada la rapidez de nuestro enfoque para obtener y analizar el fenotipo mecánico de células individuales de tejidos sólidos, exploramos su potencial para detectar el cáncer colorrectal. Utilizamos ratones deficientes en una proteína específica de células epiteliales intestinales con un papel clave en la integridad epitelial. Estos animales desarrollan tumores de colon espontáneamente. Examinamos un total de 16 ratones y comparamos células aisladas de tumores con células de una parte sana del colon del mismo animal. Analizamos células de más de 60 µm2 (determinadas por el área de la sección transversal), ya que por debajo de este umbral, la muestra estaba compuesta principalmente de células inmunitarias y pequeños desechos (Fig. 2 complementaria).

Nuestros resultados mostraron que el fenotipo físico de las células del tejido tumoral difería significativamente de las muestras de control. Los gráficos representativos de un solo ratón en la Fig. 4a-c demuestran que las células del tumor tenían un tamaño celular más grande y una mayor deformación que sus contrapartes sanas. El análisis de las 32 muestras reveló que las células de los tumores tenían un tamaño celular medio significativamente mayor (Fig. 4d), deformación (Fig. 4e) y relación de área (Fig. 4g), con tamaños de efecto de moderados a fuertes. Las muestras de tumores también exhibieron una mayor heterogeneidad, demostrada por la distribución más amplia en la Fig. 4c y desviaciones estándar significativamente más altas del tamaño celular y la relación del área (Fig. 4d, g).

a, b, Gráficos de dispersión del tamaño celular frente a la deformación de una muestra de control (a) de tejido de colon murino en comparación con tejido tumoral (b). El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad de eventos. c, Gráficos de estimación de la densidad del núcleo de las muestras que se muestran en ayb, con contornos que marcan los niveles 0,5 (sombra clara, contorno exterior) y 0,95 (sombra oscura, contorno interior). Los histogramas de tamaño celular y deformación demuestran una mayor heterogeneidad del tamaño celular y la deformación en el tumor (verde) en comparación con el tejido de control (púrpura). d-g, medias y desviaciones estándar de los parámetros de fenotipo físico de 16 muestras de control (púrpura) y 16 de tumor (verde) (n = 16 animales biológicamente independientes en seis experimentos independientes). Los recuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartílico. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos caras; r, tamaño del efecto: tamaño de celda (**P = 0,0019, r = 0,55), desviación estándar del tamaño de celda (***P = 0,0005, r = 0,61) (d); deformación (*P = 0,026, r = 0,39), desviación estándar de deformación (NS, no significativo) (e); relación de aspecto (NS), desviación estándar de la relación de aspecto (NS) (f); relación de área (**P = 0,0023, r = 0,54), desviación estándar de la relación de área (*P = 0,013, r = 0,44) (g). h, PCA de muestras de tejido de colon de ratón, donde los puntos verdes representan muestras de tumores y los puntos morados representan las muestras de control. Se realizó un análisis de regresión lineal en PC1 y PC2 con las dos categorías resultantes mostradas como colores de fondo púrpura (control) y verde (tumor).

Luego investigamos si las diferencias de fenotipo físico podrían explotarse para la distinción confiable entre tejido tumoral y tejido sano. Para ello, dividimos las células en tres categorías según el tamaño celular (60–90, 80–120 y 120–400 μm2). Para cada categoría de tamaño, se derivaron 12 parámetros: media, mediana y desviaciones estándar del tamaño de celda, deformación, relación de aspecto y relación de área; sumando un total de 36 parámetros para cada muestra (Fig. 3 complementaria). Estos parámetros se usaron para PCA, Fig. 4h. Los dos componentes principales, PC1 (39,8%) y PC2 (18,7%), explicaron el 58,5% de la varianza. La importancia relativa de las características físicas para determinar los componentes principales se muestra en la Fig. 3 complementaria. La característica más dominante para PC1 fue la deformación de las celdas entre 60 y 120 µm2, mientras que en el caso de PC2 prevalecieron los parámetros de tamaño de celda. La regresión logística realizada en el PCA (mostrada por la división lineal en la Fig. 4h) demostró que la información del fenotipo físico condensado representada por los componentes principales es suficiente para distinguir entre tejido sano y tumoral; 29 de 32 muestras estaban en la región correcta. Finalmente, analizamos la correlación entre la deformación y el tamaño de la celda y encontramos que era débil o inexistente (Fig. 4 complementaria). Esto nos llevó a concluir que la deformación y el tamaño celular eran predictores independientes de tumores en muestras de colon murino, lo que demuestra aún más el valor agregado de la deformación medida a través de RT-FDC como marcador de diagnóstico.

A continuación, buscamos desafiar nuestro método para detectar tumores a partir de muestras de biopsias humanas. Como primer paso, realizamos análisis RT-FDC en células aisladas de 13 muestras de biopsia criopreservadas de cáncer colorrectal y 13 muestras de tejido circundante sano de los mismos pacientes. PCA se realizó en 45 parámetros (Fig. 5a y Fig. 5 complementaria) con el 41,7% de la varianza explicada por los dos componentes principales (25,3% y 16,4% para PC1 y PC2, respectivamente); se optimizó la selección de parámetros RT-FDC para obtener una buena separación entre tejido sano y tumoral. El PCA mostró que las muestras tumorales y sanas se segregaron bien a lo largo de PC2, principalmente por la deformación y la desviación estándar del brillo de las células mayores de 100 µm2 (Fig. 5a). Los parámetros de tamaño de celda de las celdas por debajo de 100 µm2 también contribuyeron a la separación de las muestras. La exclusión del parámetro más importante (deformación de células mayores de 100 µm2) dio como resultado una peor separación entre muestras sanas y tumorales (Fig. 6 complementaria). Se realizó una regresión logística en el PCA (que se muestra mediante la división lineal en el gráfico de PCA) y se usó para predecir la clasificación de seis muestras ciegas (que se muestran como cruces en la Fig. 5a); las seis muestras se clasificaron correctamente como tejido sano o tumoral, respectivamente. Examinamos la cantidad mínima de celdas necesarias para la clasificación correcta de estas muestras ciegas (Fig. 7 complementaria). Se tuvieron que analizar aproximadamente 1.500 células de una muestra para una clasificación correcta, lo que corresponde a un tiempo de medición de RT-FDC de aproximadamente 5 min.

En los gráficos PCA de la izquierda, cada punto verde representa una muestra de tumor de un paciente; los puntos morados representan el tejido circundante sano correspondiente del mismo paciente. Se realizó una regresión logística en cada uno de los PCA con las dos categorías resultantes mostradas como colores de fondo púrpura (sano) y verde (tumor). Las cruces representan experimentos ciegos utilizados para la validación del modelo entrenado. El análisis de importancia de características a la derecha del gráfico PCA muestra la importancia codificada por colores de cada característica para determinar PC1 y PC2 para ese tejido en particular; el eje x enumera las categorías de tamaño de celda; el eje y enumera los parámetros RT-FDC y sus características estadísticas derivadas de las celdas en la categoría de tamaño correspondiente (entre paréntesis). sd, desviación estándar. a, PCA de los parámetros RT-FDC de 32 muestras de colon congeladas (16 biopsias de tumores y 16 muestras de tejido circundante sano; n = 16 muestras biológicamente independientes en 16 experimentos independientes). b, PCA de los parámetros RT-FDC de 28 muestras de biopsia de colon frescas (14 tumorales, 14 sanas; n = 14 muestras biológicamente independientes en 14 experimentos independientes). c, PCA de los parámetros RT-FDC de 18 muestras de biopsia de pulmón frescas (9 tumorales, 9 sanas; n = 9 muestras biológicamente independientes en 9 experimentos independientes).

El corto tiempo combinado de procesamiento y análisis (<30 min) y los resultados positivos obtenidos en secciones de biopsia de tejido congelado sugieren el uso del método para patología intraoperatoria: el examen de la muestra de biopsia de un paciente durante la cirugía. Para explorar si incluso el paso de congelación podría omitirse, analizamos biopsias recién extirpadas de pacientes con cáncer colorrectal (N = 14). El algoritmo entrenado con tejido de colon congelado no funcionó bien con tejido fresco, posiblemente debido a las diferencias de fenotipo físico entre el tejido congelado y el fresco (datos ampliados, figura 5). Por lo tanto, se realizó una nueva ACP con datos de biopsias de colon frescas en dos categorías de tamaño (20–50 y 50–600 µm2) (Fig. 5b), donde el 68,5 % de la varianza se explicaba por los dos componentes principales (36,5 % y 32% para PC1 y PC2, respectivamente). Aquí, la deformación de las células contribuyó fuertemente en el PCA y el tamaño de la célula fue menos importante que los otros parámetros físicos del fenotipo. Tras la regresión logística, solo 3 de 22 muestras utilizadas para PCA y 1 de 6 de las muestras ciegas no se clasificaron correctamente, lo que podría atribuirse a la heterogeneidad intertumoral o intratumoral. No obstante, utilizando nuestro enfoque en muestras ciegas, logramos una precisión del 100 % en la clasificación de muestras sanas y tumorales de biopsias congeladas, y una precisión del 83 % para muestras de biopsias frescas.

Para validar nuestro método en tejido de un órgano diferente, lo aplicamos a muestras de biopsia de pulmón recién extirpadas de nueve pacientes con cáncer. PCA combinado con regresión logística separó fácilmente siete muestras sanas de siete tumorales y otras cuatro muestras ciegas se clasificaron correctamente (Fig. 5c). En el PCA, el 46,9% de la varianza fue explicada por PC1 y PC2 (31,2% y 15,7%, respectivamente). Los parámetros de deformación contribuyeron fuertemente a PC1, lo que nuevamente demuestra que la información única brindada por la medición de la deformabilidad celular es útil para distinguir entre tejido tumoral y tejido sano.

También probamos la sensibilidad de nuestro enfoque a la situación en la que solo están presentes unas pocas células cancerosas (tumores con baja celularidad tumoral y extenso contenido de estroma tumoral desmoplásico) o permanecen (tumores después de quimioterapia o radioquimioterapia con remisión casi completa) en las muestras de tejido disponibles. . Este aspecto es especialmente importante para situaciones clínicas en las que se utiliza el análisis intraoperatorio para determinar si el margen operatorio está libre de cáncer (las llamadas secciones congeladas), lo que puede ser particularmente difícil cuando solo hay muy pocas células tumorales presentes. Realizamos un experimento en el que analizamos una mezcla de tumor fresco y muestras de tejido pulmonar sano en diferentes proporciones (Fig. 8 complementaria). Una muestra compuesta por un 50% de tejido sano y un 50% de tejido tumoral se clasificó como muestra tumoral. Por supuesto, no todo el tejido tumoral consiste en células cancerosas, por lo que la sensibilidad real para detectar células cancerosas es mayor que la aparente aquí. De hecho, algunas de las muestras de tumores de colon tenían un contenido estromal relativamente alto. En los casos extremos (Tabla complementaria 5, muestras de tejido de colon congelado 7 y 11), el contenido estromal fue del 98 % y el 80 %, lo que significa que los pacientes casi no tenían tumor residual después de la radioquimioterapia neoadyuvante. Aun así, estas muestras se clasificaron correctamente como tumor. Este resultado es notable ya que señala una posible solución al problema de muestreo presente en el análisis histopatológico convencional, especialmente en escenarios de secciones congeladas. El resultado de esto último depende en gran medida de si el patólogo inspecciona y selecciona la ubicación correcta del tejido donde todavía hay células cancerosas. Debido a las limitaciones de tiempo y técnicas de la preparación de portaobjetos en escenarios de secciones congeladas, solo se puede visualizar una pequeña fracción de la muestra de tejido resecado total. Si la disociación del tejido en células individuales y el análisis de un subconjunto aleatorio de estas pueden detectar con sensibilidad la presencia de tan solo el 20%, o incluso el 2%, de células cancerosas presentes en una muestra de tejido dada, esto sería un claro avance sobre el estado del arte. Se necesita una investigación más específica para establecer firmemente esto. Finalmente, nuestro método también puede detectar cáncer de bajo grado, donde se espera que cualquier diferencia en los parámetros físicos sea más difícil de detectar que en el cáncer de alto grado. La gran mayoría de las muestras analizadas fueron G2 (moderadamente diferenciadas) o G3 (poco diferenciadas/indiferenciadas, a menudo también denominadas "de alto grado"; Tablas complementarias 5-10). En el conjunto de datos de tejido pulmonar, una de las muestras se clasificó como G1 de grado más bajo (bien diferenciado; Tabla complementaria 10). Por lo tanto, el método no se limita al cáncer de alto grado.

Hemos mostrado un método rápido y sencillo para el procesamiento y análisis de células de tejido sólido, adecuado para diagnósticos basados ​​en biopsias. A la disociación mecánica del tejido le sigue un análisis de alto rendimiento de las células en flujo deformativo. En unos pocos minutos, se obtienen imágenes de miles de células y se extraen varias características físicas del fenotipo de cada imagen celular. El método no tiene etiquetas y se basa simplemente en imágenes de campo claro, en contraste con las herramientas de diagnóstico molecular o la citometría de flujo convencional, donde se necesitan reactivos costosos o marcadores fluorescentes. Es importante destacar que la información está disponible dentro de los 30 minutos posteriores a la escisión de la biopsia, lo que puede ser una ventaja cuando existe la necesidad de detectar patología rápidamente. Este es el caso durante la consulta intraoperatoria que brinda información de diagnóstico durante la cirugía del cáncer y, a menudo, define el curso posterior del procedimiento. El flujo de trabajo estándar requiere el transporte de la muestra de biopsia al departamento de patología, donde se incluye en un medio de montaje (compuesto de temperatura de corte óptima), se congela y se corta en rodajas finas con un criostato. Luego, los portaobjetos se preparan con tinción H&E y los patólogos evalúan numerosas características, incluida la naturaleza de la lesión (es decir, su malignidad) utilizando un microscopio30,50. Nuestro flujo de trabajo evita los pasos de congelación y tinción, podría realizarse directamente en el sitio y permite detectar malignidad sobre la base de la evaluación automatizada de parámetros físicos de células individuales.

Más allá del diagnóstico intraoperatorio, mostramos que el método es útil para el examen rápido de muestras de EII. El diagnóstico clínico de la EII requiere en la mayoría de los casos la combinación de diferentes pruebas, entre ellas análisis de sangre, examen de heces, endoscopia y análisis histológico de biopsias de mucosas51,52. La puntuación histológica tiene una importancia creciente en la EII, ya que el nivel histológico de inflamación se correlaciona con la recurrencia de la enfermedad, la probabilidad de cirugía y el riesgo de cáncer. Mostramos que el grado de inflamación del tejido en una muestra de biopsia de colon se puede obtener al monitorear el fenotipo físico de las células a través de RT-FDC, evitando la necesidad de tinción o evaluación de expertos. Prevemos que el método podría usarse para monitorear los cambios inflamatorios temporales para evaluar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento, y para proporcionar un sistema de puntuación de diagnóstico objetivo para la práctica clínica diaria, que actualmente no existe para la EII.

Estudios previos sobre células cancerosas han mostrado una fuerte correlación entre la malignidad y las propiedades mecánicas de las células10,11,12,46,49,53. Aquí explotamos esta correlación para detectar malignidad en biopsias de tejido humano. RT-FDC sondea la deformabilidad celular, a una tasa de alto rendimiento, al exponer las células al flujo de corte en un canal de microfluidos; y permite el fenotipado mecánico de células individuales, utilizando un modelo analítico y simulaciones numéricas54,55. Suponiendo una celda esférica inicial en condiciones normales (sin estrés), RT-FDC puede proporcionar un módulo elástico como una medida cuantitativa de la rigidez de la celda. Sin embargo, en muestras de tejido heterogéneas, como las utilizadas en este estudio, las células a menudo no son esféricas antes de ingresar al canal de microfluidos y no se puede obtener un módulo elástico. No obstante, el grado de deformación en este ensayo de deformación estándar puede interpretarse como una medida cualitativa de deformabilidad y la información de deformación inherente a las imágenes se muestra como un valioso marcador de diagnóstico. PCA de muestras de colon murino y biopsias colorrectales humanas reveló que la deformación celular en condiciones de flujo de canal estandarizadas es clave para distinguir entre tejido sano y tumoral en los tipos de biopsia examinados. Esto destaca la singularidad de la información aportada por este método, actualmente ausente de las prácticas diagnósticas de rutina que, hasta el momento, se basan principalmente en la evaluación histológica. Tras este estudio de prueba de concepto, será necesario investigar si el método se puede adaptar a diferentes tipos de cáncer o tejido. Esperamos que los cambios en la deformabilidad celular se manifiesten más en ciertos tipos de cáncer que en otros. Puede haber ciertas áreas de aplicación en las que el método tenga potencial para mejorar la práctica diagnóstica.

Para uso clínico práctico, será beneficioso integrar el procesamiento de tejidos y el análisis de fenotipo de una sola célula en una sola canalización automatizada. Aunque la disociación mecánica mediante un TG es una forma eficaz de obtener células individuales de tejidos para aplicaciones de diagnóstico, será importante reducir los pasos de manipulación manual, como el filtrado y la concentración de células. Sin embargo, incluso en su estado actual, es más rápido y rentable que el procesamiento enzimático de tejidos. Una ventaja clave de la disociación mecánica fue que el tiempo de procesamiento tomó menos de 5 minutos por muestra, en comparación con decenas de minutos o incluso varias horas para los protocolos de disociación enzimática. Además, los protocolos enzimáticos normalmente requieren reactivos dependientes de la muestra que suelen ser costosos y requieren condiciones de almacenamiento especiales, mientras que la disociación mecánica se puede realizar en un medio de cultivo estándar. Aunque diferentes protocolos enzimáticos a menudo enriquecen para tipos de células específicos56, creemos que la suspensión de una sola célula de la disociación mecánica podría ser más representativa de las poblaciones reales en el tejido y que, por lo tanto, es adecuada para un examen imparcial del panorama celular. La disociación rápida también tiene el potencial de preservar las propiedades bioquímicas y biofísicas de las células en un estado cercano al in situ; es probable que estas propiedades se deterioren con tiempos de procesamiento más largos en otros enfoques. Debido a la velocidad de la disociación mecánica, las células pueden sufrir menos cambios proteómicos o transcripcionales, que se sabe que ocurren durante el procesamiento enzimático34,57,58,59,60. Se necesitan más estudios comparativos y moleculares para evaluar estas suposiciones.

En el futuro, las investigaciones en cohortes de pacientes más grandes permitirán explotar el aprendizaje automático para la toma de decisiones de diagnóstico o pronóstico. La inteligencia artificial ya está ayudando a los patólogos a inspeccionar imágenes histológicas de portaobjetos completos, diagnosticar cáncer o clasificar tumores61,62,63. Los grandes conjuntos de datos obtenidos por el análisis RT-FDC, compuestos por miles de imágenes de células e información multidimensional, se prestan para tales enfoques de inteligencia artificial. En este estudio, nos enfocamos en los parámetros calculados a partir de imágenes en tiempo real, pero los parámetros de fenotipo físico adicionales se pueden calcular después de la adquisición y se pueden usar como entradas adicionales para el aprendizaje automático, como características de forma o textura. El trabajo futuro también se centrará en la correlación entre los datos del fenotipo físico y la puntuación de malignidad tumoral, el potencial metastásico y la tasa de supervivencia.

Finalmente, un aspecto importante del método es que el fenotipo físico de las células se puede utilizar para identificar poblaciones de células en el tejido, ya sea de forma totalmente libre de etiquetas o sinérgicamente con marcadores moleculares, mejorando las mediciones de fluorescencia. Además, debido a la modalidad de clasificación recientemente agregada a RT-FDC36, una población específica de células puede aislarse según parámetros calculados a partir de imágenes en tiempo real o utilizando redes neuronales entrenadas64,65. Esto podría emplearse para el enriquecimiento de poblaciones de células no caracterizadas en tejido para análisis ómicos posteriores o incluso para fines de medicina regenerativa, como el aislamiento sin etiquetas de células madre derivadas de tejido.

En general, nuestros hallazgos muestran que el fenotipado físico de las células a través de RT-FDC después de la disociación mecánica del tejido sin enzimas es un método rápido y simple que puede usarse para diagnosticar estados patológicos en biopsias de tejido. En particular, puede proporcionar una predicción rápida e imparcial del estado de la enfermedad en estados inflamatorios y malignidad.

Todos los experimentos con animales se realizaron en colaboración con el Departamento de Medicina Interna 1, Hospital Universitario de Erlangen, de conformidad con todas las pautas institucionales y éticas, y cubiertos por las licencias de animales apropiadas (Tierversuchsantrag no. 55.2.2- 2532-2-1032/55.2. 2-2532-2-473). Los estudios con animales se llevaron a cabo de manera equiparada por sexo y edad utilizando compañeros de camada para cada experimento. Se utilizaron tanto animales machos como hembras. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Los ratones se examinaron de forma rutinaria en busca de patógenos de acuerdo con las directrices de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio. Los ratones se alojaron en ciclos de luz y oscuridad de 12 h, a 20-23 °C y 40-60% de humedad. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Gobierno del Estado de Middle Franconia. Los animales se sacrificaron por dislocación cervical y los órganos se extirparon quirúrgicamente. Para la comparación del procesamiento enzimático y TG, se usaron ratones C57BL/6J machos y hembras, de 8 a 19 semanas de edad. La perfusión de tejido pulmonar y hepático precedió al proceso de disociación enzimática. Para la disociación mecánica utilizando un TG, los órganos se lavaron minuciosamente con solución tampón de fosfato (PBS) antes de colocarlos en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 2 % y se colocaron en hielo hasta su posterior procesamiento. Los protocolos enzimáticos se obtuvieron de la literatura y se resumen en la Tabla complementaria 1. Tanto para los protocolos enzimáticos como para el TG, se registró el peso del tejido utilizado. Al final del procedimiento de disociación, se contó el rendimiento total de células usando un contador de células LUNA.

Los ratones inmunodeficientes Rag1-/- recibieron 1 millón de células T CD4+ CD25- mediante inyección intraperitoneal. Se aislaron células mononucleares del bazo de ratones donantes C57/BL6 y se purificaron mediante tecnología de clasificación de células activadas magnéticamente, antes de inyectarlas en ratones inmunodeficientes como se describió anteriormente66,67. Los animales se sacrificaron 3 semanas después de la transferencia celular y el tejido del colon se procesó como se describe en la sección "Disociación de tejidos y preparación de células individuales".

Para generar una eliminación específica de una proteína específica de células epiteliales intestinales con un papel clave para la integridad epitelial, se cruzaron ratones portadores de LoxP-Cre flanqueados por la proteína específica con ratones VillinCre. Se observó tumorigénesis espontánea en colon con penetrancia del 100%.

Las muestras de biopsia humana extirpadas quirúrgicamente (obtenidas del Instituto de Patología, Erlangen) de tejido tumoral o sano se colocaron inmediatamente en medio DMEM avanzado complementado con 10 % de FBS, 1 % de GlutMAX, 1 % de HEPES y 1 % de penicilina/estreptomicina y se almacenaron a 4 °C. C, procesada inmediatamente o congelada en nitrógeno líquido para uso posterior. Se analizaron pares de muestras coincidentes, con dos muestras derivadas de cada paciente: una muestra de tumor y una muestra de control procedente del tejido sano que rodea al tumor.

Las muestras de biopsia no se recolectaron específicamente para este estudio de investigación, sino que formaron parte de las prácticas estándar de atención al paciente. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes que proporcionaron muestras y todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki. El protocolo para obtener muestras de biopsias humanas para este estudio fue aprobado por votos éticos del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg (24 de enero de 2005, 18 de enero de 2012; Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich-Alexander). Número de aprobación de Erlangen-Nürnberg: Re.-No. 4607).

Las tablas complementarias 5 a 10 presentan las características de la población y la información patológica de todas las muestras humanas analizadas. Los patólogos calificaron los linfocitos infiltrantes del tumor del estroma y el contenido del estroma de los tumores como se describió anteriormente68.

Se realizó la disociación de tejidos usando un TG (Fast Forward Discoveries GmbH), como se describe en las refs. 34,35. Brevemente, la muestra de tejido se cortó en pequeños trozos de aproximadamente 1 a 2 mm y se colocó en la unidad de rotor del TG con 800 μl de DMEM complementado con 2% de FBS. La unidad de rotor se colocó en la tapa de un tubo Falcon de 50 ml; el inserto del estator con un filtro de celdas de 100 μm se colocó en la parte superior de la unidad del rotor. Se colocó un tubo Falcon de 50 ml sobre la tapa, se atornilló y se posicionó en el dispositivo TG (Fig. 1). Los parámetros del proceso de molienda para cada tipo de tejido se resumen en la Tabla complementaria 2. El fabricante proporcionó los protocolos TG con algunas modificaciones menores34,35. Después del procedimiento de molienda, el tubo Falcon se invirtió sobre una gradilla, se abrió y el filtro de células se lavó con 5 ml de DMEM, FBS al 2 %. El flujo se transfirió a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugó durante 8 min a 300 g. Posteriormente, se aspiró el sobrenadante y se lavó el sedimento celular con 2 ml de PBS, FBS al 2 %, se pasó a través de un tubo de fondo redondo de citometría de flujo con tapa de filtro celular y se centrifugó a 300 g durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en el tampón de medición de alta viscosidad preparado con metilcelulosa al 0,6 % (p/p) (4000 cPs; Alfa Aesar) diluida en PBS sin calcio ni magnesio, ajustada a una osmolalidad de 270–290 mOsm kg−1 y pH 7,4. La viscosidad del tampón se ajustó a (25 ± 0,5) mPa s−1 a 24 °C utilizando un viscosímetro (HAAKE Falling Ball Viscometer Type C, Thermo Fisher Scientific).

Las mediciones de RT-FDC se realizaron como se describió anteriormente13,14, utilizando un instrumento AcCellerator (Zellmechanik Dresden GmbH). La suspensión celular se introdujo en una jeringa Luer-Lok de 1 ml (BD Biosciences) unida a una bomba de jeringa y conectada mediante un tubo PEEK (IDEX Health & Science LLC) a un chip microfluídico hecho de polidimetilsiloxano adherido a un cubreobjetos. Se adjuntó una segunda jeringa llena de tampón de medición puro al chip y se usó para enfocar hidrodinámicamente las células dentro del canal de constricción. El chip de microfluidos constaba de una entrada de muestra, una entrada de vaina y una salida conectadas por una constricción de canal central de una sección transversal cuadrada de 20 × 20, 30 × 30 o 40 × 40 μm y una longitud de 300 μm. Los caudales totales correspondientes utilizados fueron: 0,06 µl s para canales de 20 μm−1, 0,12 µl s−1 para canales de 30 μm y 0,2 µl s−1 para canales de 40 μm. La relación de flujo de vaina a muestra fue de 3:1. El chip se montó en la platina de un microscopio invertido de alta velocidad equipado con una cámara semiconductora de óxido de metal complementaria de alta velocidad. La potencia del láser para cada fluoróforo se ajustó en consecuencia, basándose en controles de tinción única y una muestra sin teñir. Se capturó una imagen de cada celda en una región de interés de 250 × 80 píxeles a una velocidad de fotogramas de 2000 fps. Los parámetros morfológicos, mecánicos y de fluorescencia se adquirieron en tiempo real. El umbral de fluorescencia para cada anticuerpo se ajustó de acuerdo con una muestra de células sin teñir obtenida del mismo tejido. La Tabla complementaria 3 enumera las características adquiridas en tiempo real y durante el análisis posterior al procesamiento; descrito en detalle en publicaciones previas69,70. Los datos se adquirieron utilizando el software ShapeIn (ShapeIn2; Zellmechanik Dresden GmbH).

Cuando fue necesario, las suspensiones de células individuales se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con 200 μl de los anticuerpos correspondientes (para la dilución de anticuerpos, consulte la Tabla complementaria 4) diluidos en PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 0,5 % (Sigma-Aldrich) y bloqueo del receptor Fc reactivo de la especie correspondiente (Miltenyi Biotec, humano: 130-059-901; ratón: 130-092-575). Los anticuerpos se lavaron añadiendo 1 ml de PBS y FBS al 2 % y se centrifugaron a 500 g durante 5 min. Luego, la preparación celular final se resuspendió en el tampón de medición antes de cargarla en el chip de microfluidos para el análisis RT-FDC. Para las muestras de biopsia congeladas, el tejido se colocó en DMEM precalentado, se complementó con FBS al 10 % durante 10 min y se dejó descongelar antes de procesarlo como se describe anteriormente.

Los datos de RT-FDC se analizaron utilizando paquetes públicos en Python 3.7. Se utilizó la biblioteca Dclab 0.32.3 para la carga inicial, el procesamiento previo y el filtrado de los datos71. Para eliminar imágenes de desechos, células dañadas y glóbulos rojos, aplicamos puertas para el área transversal mínima (20 µm2), la relación de área (1:1,1) y la relación de aspecto (1:2). Las células pequeñas <60 µm2 se identificaron seleccionando adicionalmente la relación de área 1:1,05 y la relación de aspecto 1:2. Cualquier evento fuera de estas puertas y todos los eventos <25 µm2 se consideraron desechos. En los diagramas de dispersión de los parámetros RT-FDC, la codificación de colores está de acuerdo con las estimaciones de densidad del kernel normalizadas entre 0 y 1.

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete SciPy 1.3.0. Se usó la prueba de rango con signo de Wilcoxon para evaluar muestras pareadas (muestras murinas sanas frente a tumorales y muestras de tejido de colon fresco humano frente a muestras congeladas). Se aplicó una prueba U de Mann-Whitney en los datos de colitis de transferencia. En los gráficos, los valores de P están representados por * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001. Los tamaños del efecto se calcularon como r = |z|/√N, donde z es la estadística z de la prueba y N es el número de muestras. Los tamaños del efecto se juzgaron según los criterios de Cohen de la siguiente manera: 0,1–0,3 efecto pequeño, 0,3–0,5 efecto moderado y >0,5 efecto grande. Se realizó la correlación de Pearson para juzgar la correlación entre la deformación celular y el número de células CD45+ y la correlación entre el tamaño celular y el área de muestras murinas sanas y tumorales.

El paquete Scikit learn 0.23.2 se utilizó para el procesamiento y análisis de datos adicionales72. Los parámetros obtenidos de RT-FDC se transformaron escalando cada característica al rango entre 0 y 1. PCA se usó para la reducción de dimensionalidad lineal, usando la descomposición de valores singulares de los datos para proyectar en un espacio bidimensional (PC1 versus PC2). Se utilizó regresión logística para la clasificación de muestras sanas versus tumorales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos RT-FDC generados y analizados para las Figs. 2–5 y Figs. de datos ampliados. 3–5 están disponibles en Deformability Cytometry Open Repository (https://dcor.mpl.mpg.de/organization/soteriou-kubankova)73. Los identificadores individuales para cada conjunto de datos se proporcionan en la Tabla complementaria 11. Los datos de origen para la Fig. 1 de datos ampliados también se proporcionan con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código Python para el procesamiento y visualización de datos RT-FDC está disponible en https://github.com/marketakub/physical_phenotyping_tissues.

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Agradecemos a R. Grützmann y K. Bende (Universitätsklinikum Erlangen) por ayudarnos amablemente con las muestras de biopsia. También agradecemos a J. Kayser y M. Urbanska por una revisión crítica del artículo. Agradecemos el apoyo financiero de la DFG (SFB/TRR241 'IBDome' a R.LP., MW, RA y MN; FOR2438 a MN; DI 1537/20-1, DI 1537/22-1, SFB CRC1181 y SFB TR221 a JD), la IZKF Erlangen (beca de investigación A79 para JD y el paso 2 del programa de científicos clínicos para ME) y la financiación básica de la Sociedad Max Planck (para JG).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Despina Soteriou, Markéta Kubánková.

Instituto Max Planck para la Ciencia de la Luz y Centro Max Planck de Física y Medicina, Erlangen, Alemania

Despina Soteriou, Markéta Kubánková, Christine Schweitzer y Jochen Guck

Departamento de Medicina 1—Gastroenterología, Neumología y Endocrinología, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) y University Hospital Erlangen, Erlangen, Alemania

Dew Lopez-Inns, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Raja Atreya y Markus F. Neurath

Centro Alemán de Inmunoterapia (DZI), Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) y University Hospital Erlangen, Erlangen, Alemania

Dew Lopez-Posadas, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei, Maximilian Waldner, George HW Distler, Raja Atreya & Markus F. Neurath

Centro Oncológico Integral Erlangen-EMN (CCC ER-EMN), Erlangen, Alemania

Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock, Raja Atreya, Markus F. Neurath y Arndt Hartmann

Departamento de Medicina Interna 3: Reumatología e Inmunología, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) y University Hospital Erlangen, Erlangen, Alemania

Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei y Jörg HW Distler

Clinical Health Technologies, Fraunhofer IPA, Mannheim, Alemania

Stefan Scheuermann y Jens Langejürgen

Instituto de Patología, Hospital Universitario, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Alemania

Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock y Arndt Hartmann

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MK, DS y JG concibieron el estudio y gestionaron el progreso del proyecto. DS y MK coordinaron los experimentos y análisis. DS desarrolló protocolos experimentales y realizó experimentos junto con CS El análisis y visualización de datos fue realizado por MK Otros autores ayudaron con los experimentos y participaron en debates críticos. MK y DS escribieron el documento y todos los autores brindaron comentarios.

Correspondencia a Jochen Guck.

SS, JL y JG son cofundadores de la empresa Fast Forward Discoveries GmbH, que comercializa la tecnología TG. DS, MK y JG son los inventores nombrados en una solicitud de patente para la combinación de TG y RT-DC para el diagnóstico de biopsia sólida. MK y JG son cofundadores de la empresa Rivercyte GmbH, que comercializa aplicaciones de diagnóstico de citometría de deformabilidad. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biomedical Engineering agradece a Dino Di Carlo, Per Uhlen y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a,b, Porcentaje de células viables para diferentes órganos disociados utilizando un triturador de tejidos (TG; marcado en rojo) o disociación estándar (marcado en azul). La viabilidad celular se evaluó usando (a) yoduro de propidio y RT-FDC y (b) ensayo de exclusión con azul de tripano. c, Número de células (obtenidas usando un dispositivo contador de células) por mg de tejido procesado. Pulmón, hígado, riñón, páncreas y estómago procesados ​​con disociación enzimática no se pesaron antes de los experimentos. La línea representa la media y el cuadro se extiende desde los valores mínimos hasta los máximos. TG datos riñón y bazo: n = 5, todos los demás órganos n = 5; para disociación enzimática riñón, páncreas, estómago: n = 3; todos los demás órganos n = 4; repeticiones biológicamente independientes realizadas como experimentos independientes).

Datos fuente

a, Gráficos de dispersión representativos de intensidades de fluorescencia en tres canales de detección diferentes de RT-FDC, que muestran la posibilidad de usar marcadores de superficie celular fluorescentes para caracterizar las células. Los gráficos muestran la expresión de un marcador endotelial (CD31-PE) frente a un marcador leucocitario (CD45-FITC); y un marcador epitelial (EpCAM-APC) frente a CD45-FITC. b, Imágenes representativas de las células y sus correspondientes rastros de fluorescencia; la forma temporal del pico de fluorescencia corresponde a la localización subcelular del fluoróforo. Arriba de izquierda a derecha: celda negativa para todos los marcadores, una celda positiva para CD45; abajo de izquierda a derecha: célula positiva solo para EpCAM y célula positiva solo para CD31.

Gráficos de dispersión representativos de la relación de aspecto frente al tamaño celular de células aisladas de murino a, timo, c, bazo y e, riñón que muestran la estrategia de activación para identificar dobletes celulares. Dobletes de células identificados en b, timo y d, bazo y f, riñón con rastros de fluorescencia correspondientes (b, d), que muestran un leucocito (CD45) unido a una célula endotelial (CD31), o (f) la interacción de dos leucocitos.

a, Gráficos de dispersión de deformación frente al tamaño celular para células aisladas de tejido hepático de ratón utilizando un molinillo de tejidos (TG) o disociación enzimática, que muestran el enriquecimiento de hepatocitos después de la disociación mecánica para 3 repeticiones biológicas independientes. b, Gráfico de dispersión de la deformación frente al tamaño celular que muestra 3 grupos de células que corresponden a hepatocitos de diferentes tamaños; con la correspondiente gráfica de estimación de densidad del kernel (KDE) e imágenes representativas (r = radio de las celdas). c, Porcentaje de hepatocitos respecto al número total de células hepáticas, según lo detectado por RT-DC para cinco repeticiones biológicas independientes. d, Gráficos de dispersión de deformación frente al tamaño celular para células aisladas de tejido pulmonar de ratón utilizando un molinillo de tejidos o disociación enzimática para 3 repeticiones biológicas independientes.

Gráficos de dispersión de tamaño de celda frente a deformación de células individuales extraídas de muestras de biopsia de colon frescas (púrpura) o congeladas (verde); una muestra sana; b, muestra de tumor; incluyendo 3 imágenes de celdas representativas para cada parcela con una barra de escala = 10 μm2. Los gráficos de estimación de densidad kernel (KDE) de la derecha corresponden a los gráficos de dispersión de la izquierda; los histogramas muestran las distribuciones de tamaño de celda y deformación. c, medianas y desviaciones estándar del tamaño de celda, deformación, relación de área y relación de aspecto de muestras frescas (N = 6) y congeladas correspondientes (N = 6). Los recuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartílico. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando una prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos colas, tamaño de celda de desviación estándar (*p = 0,0277, r = 0,64), relación de área mediana (*p = 0,0277, r = 0,64) y relación de área de desviación estándar (*p = 0,0277, r = 0,64); r: tamaño del efecto; NS: no significativo.

Figuras, tablas y referencias.

Datos fuente.

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Reimpresiones y permisos

Soteriou, D., Kubánková, M., Schweitzer, C. et al. Fenotipado físico rápido de una sola célula de biopsias de tejido disociadas mecánicamente. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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Recibido: 01 Diciembre 2021

Aceptado: 22 de febrero de 2023

Publicado: 06 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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