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Aug 21, 2023

Los médicos ahora pueden ser capaces de decir COVID

En COVID-19, Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Destacado,

En COVID-19, Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Destacados, Noticias, Investigación e Innovación17 de diciembre de 2021

Z. Hugh Fan, Ph.D., profesor del Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial de la Facultad de Ingeniería Herbert Wertheim

Para aquellos que han ido al médico o a la clínica durante la temporada de gripe que se avecina, la preocupación más persistente es si sus síntomas son indicativos del virus común que está rondando en el lugar de trabajo o de una posible infección por COVID-19. Mientras los investigadores se esfuerzan por tratar este virus, y sus variantes y mutaciones inevitables, uno de los mayores desafíos ha sido diagnosticar de manera rápida y precisa la fuente de la enfermedad para que se administren los protocolos de tratamiento adecuados y, a tiempo, para disminuir las probabilidades de enfermedades potencialmente peligrosas. complicaciones

Dirigido por Z. Hugh Fan, Ph.D., profesor del Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial de la Facultad de Ingeniería Herbert Wertheim, y el Dr. John Lednicky, Profesor de Investigación del Departamento de Medio Ambiente y Global de la Facultad de Salud Pública y Profesiones de la Salud. Health, un equipo interdisciplinario de la Universidad de Florida ha desarrollado una prueba de diagnóstico innovadora para el SARS-CoV-2 que es rápida, confiable, de bajo costo y capaz de diferenciar entre COVID-19 e influenza.

(Arriba) Representación del mecanismo de válvula de bola que es similar a un bolígrafo, en el que la tinta se dispensa sobre el papel cuando se presiona la bola de metal en la punta mientras se escribe. La válvula se cierra cuando la bola funciona como un tapón para el pozo en la parte superior. La válvula está abierta por el pasador en la unidad en la parte inferior que levanta la bola cuando el pasador se alinea con la bola después de deslizarse, liberando el reactivo. (Centro) Se introduce una muestra en el pocillo inferior y luego se desliza el pocillo inferior para obtener una entrega secuencial de 4 reactivos para la lisis del virus y el aislamiento/purificación del ARN. (Abajo) Detección colorimétrica asistida por una linterna UV y el tiempo total desde la muestra hasta la respuesta en 50 min.

El Dr. Fan y su equipo demostraron la capacidad de detectar dos virus en 50 minutos sin usar equipos de laboratorio voluminosos o sofisticados o fuente de alimentación, y con una sensibilidad de detección que está a la par con la de la RT-PCR estándar de oro (reverse transcription polymerase chain reacción), que es la prueba recomendada por la Organización Mundial de la Salud y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. El esfuerzo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud.

"En términos de atención al paciente, esta innovadora plataforma de muestra a respuesta es una actualización importante del estándar RT-PCR existente en varios niveles", dijo el Dr. Fan. "Con respecto al diagnóstico, el tiempo de respuesta es de menos de una hora en el lugar de la prueba en comparación con uno o dos días en un laboratorio de prueba externo".

Vista despiezada del dispositivo que consta de 3 componentes, incluida una unidad tampón en la parte superior, una unidad de mezcla en el medio y la unidad de detección en la parte inferior. La unidad de tampón contiene 4 pocillos en cada lado para el almacenamiento de un tampón de lisis, un tampón de unión y 2 tampones de lavado para la preparación de muestras. En cada pozo de la unidad tampón se coloca una bola de acero inoxidable en el fondo que funciona como válvula. La unidad mezcladora tiene un pozo en cada lado y se desliza debajo de la unidad tampón a través de las guías deslizantes en ambos lados y en el medio. La unidad de detección contiene una almohadilla de papel laminada entre dos películas termoplásticas y unida a la capa del pozo con una cinta adhesiva de doble cara.

El dispositivo diseñado por UF se publicó recientemente para su revisión por pares en ACS Sensors, la revista insignia de la American Chemical Society, que se centra en la ciencia de los sensores.

RT-LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle) es un ensayo utilizado para la detección de ARN viral. La metodología para RT-LAMP se basó en el mecanismo detrás de la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena de autociclado. Una polimerasa lleva a cabo la reacción y la polimerasa tiene una alta actividad de desplazamiento de cadena. También se utilizan dos pares de cebadores, un par de cebadores internos y otro de cebadores externos. Estos cebadores están especialmente diseñados para la reacción. RT-LAMP logra una alta especificidad debido a las secuencias diana. A diferencia de otras tecnologías, RT-LAMP reconoce la secuencia objetivo utilizando seis secuencias independientes al principio, lo que le otorga una alta especificidad. Primer reconocimiento del genoma de destino conduce a una fuerte reacción colorimétrica, lo que permite la detección sin instrumentación altamente especializada o costosa.

"La tecnología RT-LAMP tiene numerosas ventajas sobre la RT-PCR estándar", dijo el Dr. Lednicky. "El costo de los reactivos es bajo en comparación con una reacción de RT-PCR equivalente, los resultados se obtienen más rápidamente y las necesidades de equipo para RT-LAMP son bajas, lo que es una gran ventaja para los usuarios en países con recursos limitados o para uso en consultorios médicos. y clínicas Además, las reacciones RT-LAMP empaquetadas en formato de kit ocupan poco espacio de almacenamiento y se pueden liofilizar, lo que alivia la necesidad de almacenamiento en el congelador".

Fotografía de un dispositivo ensamblado, en el que la unidad mezcladora se desliza hacia el segundo pozo desde la izquierda, levantando esas bolas allí. (recuadro) Imagen de la vista superior de una unidad de detección, que muestra un pozo para el aislamiento de ARN y RT-LAMP.

Se toma la muestra (hisopo, orina, saliva, sangre, según la prueba) y se transfiere una cantidad determinada a la primera cámara del dispositivo de procesamiento de muestras. Secuencialmente, la muestra se somete a fluidos específicos que extraen ADN o ARN del patógeno, purifican el material extraído y lo recogen en una unidad de filtro desmontable. Los productos químicos RT-LAMP se agregan a la unidad desmontable, la cámara con los fluidos RT-LAMP se sella con cinta y la unidad final se separa y se coloca en una "taza de café" controlada por microchip, que se precalienta a una temperatura específica. . Después de un período de incubación seleccionado, se determinan los resultados, evidenciados por un cambio de color que se detecta visualmente o que también se puede detectar/medir a través de su nivel de fluorescencia.

Al utilizar unidades de un solo uso de formato desechable, el dispositivo puede ser utilizado por enfermeras, médicos y otras personas sin necesidad de capacitación avanzada. Los resultados, positivos o negativos, se pueden determinar visualmente o con la ayuda de tecnología simple como una linterna. Los resultados se pueden registrar mediante el uso de un iPhone o dispositivo móvil equipado con una cámara similar para capturar la imagen, donde se envía a un sitio remoto para la confirmación de los datos.

"En pocas palabras, el dispositivo permite un análisis más rápido del material genético que la RT-PCR tradicional y se ha utilizado con éxito en la detección del virus SARS-CoV-2", dijo el Dr. Lednicky. "Es simple, económico y no requiere habilidades técnicas avanzadas ni equipos costosos. Lo que es más importante, es muy sensible y produce sensibilidades de detección, en algunos casos, 10 veces más sensibles que los ensayos estándar de RT-PCR".

La prueba simultánea del SARS-CoV-2 y los virus de la influenza actualmente no está disponible en el punto de atención (POC), pero sus variaciones están disponibles en los laboratorios de prueba y probablemente se considerarían como un dispositivo "exento de CLIA". , que incluye pruebas caseras aprobadas por la FDA. "El dispositivo también podría usarse para estudios ambientales (SARS-CoV-2 en el aire, las aguas residuales u otras matrices) y se puede colocar/combinar con otros dispositivos de detección, como muestreadores de aire", dijo el Dr. Fan.

Fotografías de una taza de café que funciona con baterías, disponible en el mercado, utilizada como baño de agua para la amplificación isotérmica. (izquierda) La taza de café está abierta y contiene unidades de detección en un baño de agua. En el recuadro encima de la taza se muestra una imagen de la unidad de detección. (derecha) La taza de café está cerrada durante la amplificación RT-LAMP a 62,5oC.

El desarrollo de este dispositivo basado en LAMP se produce inmediatamente después de los avances progresivos de los investigadores de la UF en la detección e identificación tempranas de patógenos peligrosos. Hace tres años, con fondos del Estado de Florida, el Dr. Fan y el Dr. Lednicky dirigieron un equipo de investigación que desarrolló un dispositivo miniaturizado rápido y rentable para la detección del virus Zika transmitido por mosquitos, que no presenta síntomas en hasta al 80 por ciento de los infectados. La plataforma de pruebas en el punto de atención se puede utilizar para evaluar a pacientes asintomáticos en el campo, mitigar los diagnósticos erróneos y ayudar a prevenir una mayor transmisión.

El año pasado, los ingenieros del Departamento de Ciencias de la Ingeniería Ambiental de la Escuela de Ingeniería de Infraestructura y Medio Ambiente Sostenible (ESSIE), dirigidos por el Dr. Chang-Yu Wu, desarrollaron un novedoso muestreador de aerosoles de virus que recolecta de manera eficiente los virus en el aire (incluido el COVID-19). información a partir de la cual los proveedores de atención médica pueden identificar áreas de riesgo e identificar medidas de mejora. La integración del nuevo muestreador con el dispositivo RT-LAMP podría llegar más allá de las áreas de prueba a áreas públicas generales (por ejemplo, aeropuertos, subterráneos, edificios gubernamentales, centros comerciales) proporcionando una alerta temprana de virus patógenos en el aire, ayudando a detener su propagación.