Blog

Oct 26, 2023

Identificación de progenitores y SARS

Naturaleza volumen 588, páginas

Nature, volumen 588, páginas 670–675 (2020)Citar este artículo

42k Accesos

175 citas

154 Altmetric

Detalles de métricas

El pulmón distal contiene bronquiolos terminales y alvéolos que facilitan el intercambio de gases. Los sistemas tridimensionales de cultivo de pulmón distal humano in vitro facilitarían enormemente la investigación de patologías como la enfermedad pulmonar intersticial, el cáncer y la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) neumonía causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Aquí describimos el desarrollo de un sistema de cultivo químicamente definido sin alimentador a largo plazo para progenitores de pulmón distal como organoides derivados de células basales de tipo II (AT2) o KRT5+ del epitelio alveolar humano adulto único. Los organoides AT2 pudieron diferenciarse en células AT1, y los organoides de células basales desarrollaron lúmenes revestidos con células club diferenciadas y ciliadas. El análisis unicelular de células KRT5+ en organoides basales reveló una población distinta de células mitóticas ITGA6+ITGB4+, cuya descendencia se segregó aún más en una subfracción TNFRSF12Ahi que comprendía aproximadamente el diez por ciento de las células basales KRT5+. Esta subpoblación formó grupos dentro de los bronquiolos terminales y exhibió una actividad de crecimiento organoide clonogénica enriquecida. Creamos organoides de pulmón distal con polaridad apical hacia afuera para presentar ACE2 en la superficie externa expuesta, lo que facilita la infección de AT2 y cultivos basales con SARS-CoV-2 e identifica las células del club como población objetivo. Este cultivo a largo plazo y sin alimentador de organoides de pulmón distal humano, junto con el análisis de una sola célula, identifica la heterogeneidad funcional entre las células basales y establece un modelo de organoides in vitro fácil de infecciones de pulmón distal humano, incluida la neumonía asociada a COVID-19.

El pulmón distal realiza funciones respiratorias esenciales que pueden verse comprometidas por trastornos inflamatorios, neoplásicos o infecciosos como la neumonía por COVID-19. El estudio de estas condiciones se vería facilitado por modelos robustos in vitro basados ​​en células humanas. Las identidades de las células madre que regeneran el epitelio pulmonar distal in vivo durante la vida humana se han deducido de estudios con ratones, a pesar de las diferencias entre estas especies1. En humanos, las células madre basales abarcan todo el árbol de las vías respiratorias, mientras que en ratones, las células club2 y/o las células no club3 que expresan secretoglobina 1A1 (SCGB1A1) renuevan los bronquiolos distales durante el envejecimiento. En la región de intercambio de gases, las células epiteliales alveolares tipo II (AT2) de ratón generan células AT1 y AT2 durante la homeostasis4,5, y se reclutan progenitores adicionales en respuesta a una lesión grave3,6,7,8,9. Se desconoce la presencia y/o funciones de los progenitores facultativos en el pulmón humano. Las células AT2 humanas se pueden diferenciar en células AT1, pero estos cultivos son de corta duración y no demuestran una autorrenovación a largo plazo ni permiten la expansión para el modelado de enfermedades4,10,11; además, sus requisitos para las células alimentadoras impiden la definición de componentes de nicho específicos12,13. Hemos establecido un cultivo de organoides a largo plazo de pulmón humano distal, incluidas AT2 y células madre basales, y utilizamos este sistema para validar células progenitoras funcionales y modelar la infección por SARS-CoV-2.

Definimos empíricamente las condiciones del medio para respaldar la expansión clonal de progenitores de pulmón humano distal de 136 individuos en matriz extracelular (ECM) de colágeno / laminina (Fig. 1a, Tabla complementaria 1). Juntos, EGF y el antagonista de BMP NOGGIN apoyaron el crecimiento de células pulmonares distales desagregadas o fracciones epiteliales purificadas de las mismas (Datos extendidos Fig. 1a-c). Las células individuales (datos extendidos Fig. 1d-g) se expandieron en organoides quísticos SFTPC + HTII-280 + AT2 (Fig. 1b-e) u organoides sólidos KRT5 + que expresan el marcador de células basales KRT5 (Fig. 1b, f - h).

a. Los cultivos de organoides de pulmón distal humano D14 (día 14) contienen organoides quísticos y sólidos. Abajo a la izquierda, campo claro; derecha, hematoxilina y eosina (H&E). Barra de escala, 100 μm. b, inmunofluorescencia de montaje completo con anticuerpos anti-KRT5 (células basales), anti-SFTPC (células AT2) y anti-SCGB1A1 (células club). Barra de escala, 100 μm. c–e, organoides alveolares en D32. c, organoide quístico AT2. ÉL; barra de escala, 25 μm. d, inmunofluorescencia de montaje completo para anti-SFTPC, anti-HTII-280, faloidina (Ph) y DAPI; barra de escala, 50 μm. e, Anti-KI67 y fluorescencia DAPI de una sección adyacente a d. f–h, Organoides basales en D32. f, HE; barra de escala, 50 μm. g, inmunofluorescencia de montaje completo para anti-KRT5 y DAPI; barra de escala, 100 μm. h, inmunotinción Anti-KI67 y DAPI de la sección adyacente a g. i – k, ARN-seq de una sola célula de organoides pulmonares distales totales en D28. i, gráfico de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) de 7285 células individuales que demuestran poblaciones AT2, basales y de club. j, Expresión de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) y SCGB1A1 (club). k, gráficos de características para la expresión de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) y SCGB1A1 (club). l – p, Cultivo de organoide AT2 clonogénico. l, Microscopía de campo claro de organoides AT2 en D180; barra de escala, 200 μm. m, tinción H&E del cultivo como en l; barra de escala, 50 μm. n, Microscopía electrónica de transmisión del organoide AT2 en D32. LB, cuerpo lamelar; barra de escala, 5 μm. o, p, inmunofluorescencia de organoide AT2 en D32 (o); el cultivo en vidrio durante 10 días adicionales induce la diferenciación en células AT1 (p). Inmunofluorescencia para anti-HTI-56 (AT1) y anti-HTII-280 (AT2); barra de escala, 50 μm. q, gráficos de características de scRNA-seq de 2780 células organoides AT2 en D89 de cultivo acumulativo.

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de organoides de pulmón distal confirmó la presencia de poblaciones de células SFTPC+ AT2, células basales KRT5+ y células club SCGB1A1+ (Fig. 1i, j, Datos extendidos Fig. 2). Se encontraron células que coexpresaban KRT5 y SCGB1A1 en las poblaciones de células basales y club, lo que sugiere un estado de transición (Fig. 1j, k, Datos extendidos Fig. 2) que fue respaldado por los resultados del análisis de trayectoria SPADE14 y Monocle15 (Datos extendidos). Fig. 3, Tabla Suplementaria 2).

Generamos organoides AT2 puros a partir de cultivos mixtos mediante la absorción de tintes lisosomales en cuerpos lamelares (Datos extendidos Fig. 4a, b, Fig. 1 complementaria). Las células EPCAM+LysoTracker+ AT2 se expandieron clonalmente hasta por 180 días (Fig. 1l, m, Datos extendidos Fig. 4c, d). El medio EGF/NOGGIN definido químicamente fue suficiente para la proliferación clonal de referencia de los organoides AT2, que se atenuó al bloquear la biosíntesis endógena global de WNT (datos ampliados, Fig. 4e), en consonancia con el requisito de señalización WNT autocrina en células AT2 de ratón16. El crecimiento se mejoró mediante la adición de medio acondicionado de fibroblastos que contenía suero y agonistas de WNT (datos ampliados, Fig. 4f). La microscopía electrónica de transmisión reveló microvellosidades y cuerpos laminares característicos de las células AT2 maduras (Fig. 1n, Datos extendidos, Fig. 4g). Los organoides AT2 mostraron una regulación positiva de los marcadores AT1 cuando se cultivaron en vidrio con suero (Fig. 1o, p).

El ARN-seq de una sola célula de organoides de pulmón distal mixtos u organoides alveolares purificados reveló una expresión uniformemente alta de marcadores de células AT2 canónicas en poblaciones alveolares (Fig. 1i-k, q, Datos extendidos Fig. 2, Datos complementarios 1). Los subconjuntos de células AT2 no se observaron fácilmente, y los ARNm relacionados con el ciclo celular no se localizaron en una subpoblación AT2 específica (Fig. 1q, Datos complementarios 1, Tabla complementaria 3).

Los organoides de células basales en cultivo de pulmón distal mixto crecieron más rápidamente que los organoides alveolares e inicialmente formaron esferoides KRT5 + sólidos (Fig. 1a, b, f-h). Sin embargo, al cabo de un mes de cultivo, alrededor del 50 % de los organoides habían desarrollado lúmenes únicos u ocasionalmente múltiples (Fig. 2a, b, datos extendidos, Fig. 5a–c) con maza (SCGB1A1+KRT5–) y ciliados (AcTUB+KRT5–). ) células que recubren la superficie interior (Fig. 2a, b). Los cultivos basales purificados por sedimentación por densidad exhibieron crecimiento clonal en serie, dependencia de EGF y NOGGIN, y cavitación revestida por células ciliadas luminales SCGB1A1+ club y AcTUB+ (Fig. 2c, d, Datos extendidos Fig. 5d-h, Videos complementarios 1, 2). Se produjo una diferenciación similar cuando los organoides se transfirieron a cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) 2D (Fig. 2e).

a, b, Inmunofluorescencia que muestra diferenciación de organoide basal en cultivo mixto. Los lúmenes están revestidos con células ciliadas de tubulina+ acetilada (AcTUB), que expresan el receptor ACE2 del SARS-CoV-2 pero carecen de KRT5 (a) y células club SCGB1A1+ (b). Barra de escala, 20 μm. c-e, Cultivo de organoide basal sedimentado. c, diferenciación de células Club en organoides basales purificados después de 38 días en cultivo clonogénico 3D, mostrada por fluorescencia de montaje completo para anti-SCGB1A1 (rojo), faloidina (blanco) y DAPI (azul); barra de escala, 50 μm. d, diferenciación ciliada de organoides como en c. imagen de transmisión confocal; barra de escala, 20 μm. Recuadro blanco en el recuadro ampliado a la imagen principal; las puntas de flecha denotan cilios. e, Inmunofluorescencia que muestra células club AcTUB+ ciliadas y SCGB1A1+ en un organoide que se ha replacado en cultivo 2D ALI. Barra de escala, 50 μm. f, g, RNA-seq de una sola célula de células basales KRT5 + de la Fig. 1i. f, gráficos t-SNE que muestran los subgrupos Basal 1 y Basal 2. Basal 1 se subdivide en Basal 1.1 y 1.2, y este último expresa los ARNm proliferativos CDK1 y PCNA. g, Expresión génica diferencial en los subgrupos Basal 1 y Basal 2 de un total de 2303 células basales. h, superposiciones de t-SNE de t-SNE de marcador basal de f (número log10 de identificadores moleculares únicos (UMI)). i, Gráficas cinéticas de expresión génica relativa de f y g a lo largo de la trayectoria de pseudotiempo (n = 3721 células). j, Aislamiento FACS de células TNFRSF12Ahi frente a TNFRSF12Aneg de organoides de pulmón distal mixtos, prebloqueados en singletes vivos. k, Imagen de campo claro del cultivo de organoides de células de j en D14. l, Cuantificación de k (número de organoides por 1.000 células); ***P < 0,001 (P = 1,0 × 10−4), prueba t de Student de dos colas. Los datos en j, k representan n = 5 experimentos independientes para cada población TNFRSF12A.

Datos fuente

El agrupamiento de RNA-seq de una sola célula de células basales organoides KRT5 + de múltiples individuos identificó de manera reproducible dos poblaciones: Basal 1 y Basal 2 (Fig. 2f, g, Datos extendidos Fig. 6a, Datos complementarios 1). Basal 1 incluía una subpoblación de ciclo activo (Basal 1.2) que estaba enriquecida en marcadores de proliferación (PCNA, CDK1) y procesos relacionados con el ciclo celular del análisis de enriquecimiento de células génicas (GSEA) (Fig. 2f, g, Datos extendidos Fig. 6a-c , Tabla complementaria 3). Basal 1, pero no Basal 2, expresó ARNm canónicos de células basales de pulmón como TP6317, integrina-α6 (ITGA6) e integrina-β4 (ITGB4, que codifica un compañero de unión de ITGA618 y marca progenitores epiteliales negativos de linaje de ratón (LNEP)) 7 (figura 2h). Basal 2 se enriqueció en la expresión de genes relacionados con el transporte vesicular, los procesos del retículo endoplásmico y los marcadores escamosos (Fig. 2g, Tabla complementaria 3).

Examinamos el gen Basal 1 expresado diferencialmente TNFRSF12A (también conocido como Fn14, TWEAKR), que codifica un receptor de membrana (Fig. 2g, h, Tabla complementaria 4) debido a su utilidad potencial para el aislamiento de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y su homología con el marcador de células madre intestinales TNFRSF1919. El análisis de pseudotiempo imparcial reveló una trayectoria continua de una sola célula que conecta las células KRT5+ Basal 1 con las células del club SCGB1A1+, con el ARNm de TNFRSF12A fuertemente asociado con el gen marcador de proliferación MKI67 (Fig. 2i, Datos extendidos Fig. 3e). Cuando las células Basal 1 que coexpresan EPCAM, ITGA6 e ITGB4 se dividieron en tres fracciones (que expresan niveles bajos, medios y altos de ARNm de TNFRSF12A), un módulo génico proliferativo20 se enriqueció significativamente en la fracción más alta (TNFRSF12Ahi) frente a la más baja (TNFRSF12Alo) ( Datos extendidos Fig. 6d–f). Para determinar si este enriquecimiento reflejaba el potencial proliferativo intrínseco, fraccionamos los organoides pulmonares distales totales por FACS en células EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + Basal 1 y luego en los subconjuntos TNFRSF12Ahi y TNFRSF12Aneg (Fig. 2j). Cuando se cultivó, el subconjunto TNFRSF12Ahi mostró una capacidad de formación de organoide clonogénico de 4 a 12 veces mayor que el subconjunto TNFRSF12Aneg (Fig. 2k, l).

Examinamos las relaciones de linaje entre Basal 1 y Basal 2 fraccionando organoides basales KRT5+ sedimentados por densidad mediante FACS en poblaciones EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi (Basal 1) y EPCAM+ITGA6−ITGB4−TNFRSF12Aneg (Basal 2) (Datos extendidos Fig. 7a). La formación de organoide clonogénico se enriqueció fuertemente en Basal 1 versus Basal 2 de tres individuos separados (Datos extendidos Fig. 7b-d). Los genes SPRR1B y TMSB4X enriquecidos en basal 2 (Fig. 2g, Tabla complementaria 3) se indujeron transitoriamente en organoides de células Basal 1 (Datos extendidos Fig. 7e, f), lo que sugiere que las células Basal 2 podrían diferenciarse de Basal 1.

El gen objetivo de NOTCH HES1 fue uno de los loci más expresados ​​​​diferencialmente en los organoides Basal 1, en los que las redes de genes incluían NOTCH1, NOTCH2 y JAG1 (Fig. 2g, Tabla complementaria 3). La inhibición de NOTCH aumentó significativamente la proliferación de organoides basales de las células TNFRSF12AhiEPCAM+ITGA6+ITGB4+ (Datos ampliados Fig. 7g, h), lo que sugiere que la señalización de NOTCH restringe el crecimiento en estas células. Por el contrario, el agonismo de NOTCH no afectó la proliferación, pero indujo la expresión de SCGB1A1, similar a las células de las vías respiratorias superiores21,22 (Datos ampliados Fig. 7i).

La inmunotinción del tejido pulmonar distal humano mostró células basales TNFRSF12A+ que se enriquecieron de forma intermitente en las puntas o bases de los surcos bronquiolares (Fig. 3a, Datos extendidos Fig. 8a, b); estos últimos se reconocen como un nicho de células caliciformes23. Encontramos TNFRSF12A en diversas células epiteliales y del estroma pulmonar, pero marcó claramente una población menor de células basales KRT5+ y p63+ (Fig. 3a, Datos extendidos Fig. 8a-c). El subconjunto TNFRSF12A+ de células basales KRT5+ tenía un índice mitótico más alto que el total de células KRT5+ in vivo (Fig. 3b, c), de acuerdo con los resultados del organoide scRNA-seq (Fig. 2i). El análisis FACS de células pulmonares distales humanas confirmó que TNFRSF12A se expresó en el 10,9 % de las células basales (Datos ampliados, Fig. 8d, arriba).

a, Izquierda, inmunofluorescencia anti-KRT5 y anti-TNFRSF12A de pulmón distal humano. El área encuadrada en amarillo se expande con (centro) y sin (derecha) DAPI. Barras de escala, 100 μm. b, Inmunofluorescencia de la proliferación de células basales TNFRSF12A+ de las vías respiratorias distales que muestra KRT5, TNFRSF12A, KI67 y DAPI. Barra de escala, 100 μm. c, índice mitótico de células TNFRSF12A+KRT5+ de b; tres experimentos independientes. K5+, total KRT5+; K5+T+, TNFRSF12A+KRT5+. Los diagramas de caja representan el primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil; los bigotes muestran el mínimo y el máximo. **P < 0,01 (P = 4,4 × 10−3), prueba t de Student de dos colas. d, inmunofluorescencia de campo claro y anti-KRT5 de cultivos de organoides TNFRSF12Aneg y TNFRSF12Ahi aislados por FACS en D14; barras de escala, 500 μm. e, Cuantificación de d (número de organoides por 1.000 células); los datos representan n = 5 experimentos independientes para cada población TNFRSF12A. Los diagramas de caja representan el primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil; los bigotes muestran el mínimo y el máximo. P = 1,1 × 10−3, prueba t de Student de dos colas. f, H&E y anti-KRT5, anti-TNFRSF12A, anti-SCGB1A1 y anti-AcTUB inmunotinción de organoides de la fracción TNFRSF12Ahi de células pulmonares distales EPCAM+ITGA6+ITGB4+ clasificadas por FACS. Barras de escala, 50 μm. g, inmunofluorescencia H&E y anti-SCGB1A1 y anti-AcTUB de cultivos 2D ALI de organoides de células basales de células basales TNFRSF12Ahi como en f. Barras de escala, 50 μm.

Datos fuente

Tras el cultivo prospectivo directamente del pulmón humano sin un intermediario organoide, las células EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi aisladas por FACS (células TNFRSF12Ahi Basal 1; Datos extendidos Fig. 8d, abajo) mostraron un aumento de 15 veces en la formación de organoide KRT5+ en comparación con EPCAM Células +ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Aneg (células TNFRSF12neg Basal 1; Fig. 3d, e). Los organoides basales TNFRSF12Ahi también se diferenciaron en células ciliadas SCGB1A1+ club y AcTUB+ en cultivo prolongado (Fig. 3f) o cuando se cultivaron como monocapas 2D ALI (Fig. 3g).

El virus de la influenza H1N1 infectó con avidez los organoides pulmonares distales, que también expresaron receptores de influenza (datos extendidos Fig. 9a-d), similares a los organoides de las vías respiratorias proximales24,25. La infección de organoides con influenza H1N1 PR8 fue inhibida por análogos de nucleósidos, de acuerdo con estudios previos26 (Datos extendidos Fig. 9e), y la detección de diversas clases de compuestos antivirales en formato de 48 pocillos reveló actividad diferencial (Datos extendidos Fig. 9f), lo que sugiere que este sistema podría usarse para el descubrimiento de terapias escalables.

En la neumonía por COVID-19, la infección grave por SARS-CoV-2 del pulmón distal induce daño alveolar e insuficiencia respiratoria27. El scRNA-seq organoide en puntos de tiempo antes de la diferenciación ciliada identificó la expresión del receptor ACE2 del SARS-CoV-2 y el procesamiento de los ARNm de la proteasa TMPRSS2 predominantemente en células club y AT2 (Datos extendidos Fig. 10a), consistente con la expresión de ACE2 en el interior diferenciado de KRT5 células luminales (Fig. 2a). Para facilitar el acceso del SARS-CoV-2 a las células luminales que expresan ACE2, adaptamos un método de polarización de cultivo en suspensión apical hacia afuera28 a organoides de pulmón distal (datos extendidos, figura 10b). Dentro de las 48 h en suspensión, los organoides se reorganizaron en esferoides epiteliales apicales con microvellosidades, uniones apicales y cilios móviles que miran hacia el exterior del organoide. La diferenciación de las células ciliadas orientadas hacia el exterior se aceleró durante cinco días y progresó durante semanas (Fig. 4a, Datos extendidos, Fig. 10c-f, Video complementario 3). Los organoides basales apicales también mostraron un aumento en las células club que miran hacia afuera con gránulos secretores apicales (Fig. 4a, Datos extendidos Fig. 10g), y los organoides AT2 apicales mostraron diferenciación en células AT1 (Datos extendidos Fig. 10h-j) . De manera crucial, en los organoides apicales, ACE2 se localizó en las membranas celulares apicales en la superficie externa del organoide (Fig. 4b, Datos extendidos, Fig. 10k).

a, Inmunofluorescencia que compara la polarización y la localización superficial de las células club SCGB1A1+ (verde) y las células ciliadas AcTUB+ (blancas) en crecimiento no polarizado integrado en ECM (izquierda) o cultivo en suspensión apical (derecha). b, Secciones transversales de organoide basal con salida apical como en un teñido con anti-ACE2, anti-SCGB1A1 y DAPI. c, PCR cuantitativa para ARN genómico no empalmado (gRNA, izquierda) y sgRNA empalmado (derecha) de SARS-CoV-2 en organoides de pulmón distal apical, 72 h después de la infección (hpi), normalizado a U3 snoRNA; n = 2 experimentos independientes. d, Inmunofluorescencia anti-dsRNA de organoides pulmonares distales humanos apicales, infectados de forma simulada o infectados con SARS-CoV-2, 48 hpi. e, Inmunofluorescencia para la proteína de la nucleocápsida (NP) del SARS-CoV-2 en organoides apical-out infectados o simulados a 96 hpi. f, Inmunofluorescencia de organoides AT2 apical-out infectados con SARS-CoV-2 con los anticuerpos indicados a las 96 hpi. g, colocalización de inmunofluorescencia de SARS-CoV-2 NP y SCGB1A1 en organoides basales de pulmón distal apical a 96 hpi. h, Inmunofluorescencia que muestra especificidad de tipo celular en organoides apical-out infectados con SARS-CoV-2. Inf, célula infectada por SARS-CoV-2. En c–h, los organoides estuvieron en suspensión durante 6–10 días (basal) o 3 días (AT2) antes de la infección. Barras de escala, 20 μm excepto f, h (10 μm).

Organoides pulmonares distales mixtos apical-out infectados con SARS-CoV-2, con inducción de ARN genómico de SARS-CoV-2 no empalmado que alcanza niveles similares a los del ARN nucleolar pequeño U3 expresado abundantemente (Fig. 4c, izquierda). Además, los organoides infectados mostraron ARN subgenómico empalmado de SARS-CoV-2 específico de replicación (sgRNA; Fig. 4c, derecha) y producción de viriones infecciosos con formación de placas de células VeroE6 (35 PFU ml-1 de lisados ​​de organoides y 65 PFU ml- 1 de sobrenadantes de organoide). En los organoides basales infectados con SARS-CoV-2, apareció el ARN de doble cadena (dsRNA) 48 h después de la infección (Fig. 4d) y la proteína de la nucleocápside (NP) del SARS-CoV-2 a las 96 h (Fig. 4e). Aproximadamente el 10% de los organoides AT2 mostraron una expresión prominente de SARS-CoV-2 NP en células SFTPC+; los organoides restantes estaban desprovistos de infección (Fig. 4f). De manera similar, el SARS-CoV-2 infectó alrededor del 10% de los organoides basales. En 2.621 células basales de las vías respiratorias distales totales que representan cultivos de cuatro individuos (Tabla complementaria 5), ​​no se detectó infección por SARS-CoV-2 en células ciliadas basales KRT5+ o AcTUB+ (odds ratio 0, P < 0,05), en contraste con la infección de las células ciliadas superiores células ciliadas de las vías respiratorias por SARS-CoV-2 en cultivo 2D ALI29,30. Sin embargo, la inmunofluorescencia de SARS-CoV-2 NP y dsRNA estuvo presente principalmente en las células del club SCGB1A1 + (Fig. 4g, h) que estaban fuertemente asociadas y representaban el 79% de las células positivas para NP o dsRNA (odds ratio 19.33, P < 0,0001); El 21% de las células infectadas carecían de SCGB1A1 (Fig. 4g, h, Tabla complementaria 5). En general, estos estudios indican que las células AT2 se infectaron directamente con el SARS-CoV-2 y sugieren que las células club son una población diana del pulmón distal.

Hemos aplicado cultivos de organoides de pulmón distal humano a largo plazo para el descubrimiento de progenitores y el modelado de enfermedades infecciosas. Nuestros hallazgos se basan en métodos anteriores de cultivo de pulmón adulto a corto plazo y dependientes del alimentador4,10,11 y presentan una alternativa a las técnicas que implican la diferenciación de células madre pluripotentes inducibles31,32,33,34. Los organoides contenían dos subtipos relacionados de células basales de pulmón distal humano KRT5+: Basal 1 y Basal 2. En particular, la fracción Basal 1 que expresa TNFRSF12A poseía una actividad progenitora clonogénica enriquecida, lo que establece un precedente funcional para un subtipo de células basales enriquecidas con proliferación. Aunque TNFRSF12A no está presente exclusivamente en las células basales, dentro de la capa basal a menudo se localiza en un nicho postulado en las bases y puntas de los surcos de las vías respiratorias23, lo que amplía las nociones recientes de que el epitelio pulmonar muestra una especialización espacial35. Es posible que TNFRSF12A o marcadores análogos puedan distinguir subconjuntos de progenitores de células basales en otros tejidos. Nuestros organoides también permiten una fácil exploración de la infección pulmonar distal por SARS-CoV-2, que es relevante para la neumonía27 asociada con COVID-19, e implican a las células club SCGB1A1+ como un objetivo cuya infección podría comprometer los glicosaminoglicanos pulmonares protectores y precipitar un círculo vicioso de infección. No observamos infección de células ciliadas, a diferencia de los estudios de pulmón 2D ALI29,30; esto podría requerir condiciones de cultivo alternativas. Las poblaciones negativas para SCGB1A1 también se infectaron y están bajo investigación adicional; por ejemplo, las células secretoras transitorias bronquiales expresan ACE2 y TMPRSS236.

En general, el análisis de una sola célula de cultivos de organoides, como se describe aquí, puede representar una estrategia general para identificar y validar funcionalmente las células madre candidatas en tejidos de proliferación lenta. El cultivo de progenitores para todos los linajes epiteliales de pulmón distal humano adulto, incluidos los alvéolos, debería permitir sustancialmente el modelado de enfermedades como las neoplásicas y las afecciones pulmonares intersticiales12 y permitir aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina de precisión. Finalmente, este sistema organoide debería facilitar diversas investigaciones de patógenos pulmonares, incluida la infección pulmonar distal por SARS-CoV-2 que se asocia con insuficiencia respiratoria fulminante.

Los detalles experimentales adicionales se encuentran en los Métodos complementarios. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de los resultados.

Todos los experimentos realizados en este trabajo fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford y se realizaron bajo el protocolo no. 28908. Se obtuvo el consentimiento informado estándar para la investigación por escrito de todos los pacientes que contribuyeron a este estudio antes de la obtención del tejido y todos los experimentos siguieron las pautas y regulaciones pertinentes. Se obtuvo tejido pulmonar periférico dentro de 1 cm de la pleura visceral a partir de tejido quirúrgico descartado de lobectomías. Para los pacientes con sospecha de cáncer de pulmón, los casos con enfermedad clínica T4 (Comité Conjunto Estadounidense del Cáncer, 6.ª edición) (por ejemplo, características como invasión bronquial o nódulo satélite parenquimatoso/metástasis) fueron diferidos. El tejido normal se eliminó del margen pulmonar anatómicamente más distal a las lesiones palpablemente bien definidas, o de lóbulos no afectados en el caso de neumonectomías. Las muestras con tumores que contenían márgenes mal definidos fueron diferidas. El tejido se procesó fresco o se almacenó a 4 °C durante la noche y se procesó a la mañana siguiente.

Para aislar las células de las vías respiratorias distales, el parénquima pulmonar de 1 cm de la pleura visceral se disoció mecánicamente con tijeras de Castro, se lavó y se incubó con 5 unidades por ml de elastasa porcina (Worthington), 100 unidades de Kunitz por ml de ADNasa I (Worthington) y normocina ( InvivoGen) y resuspendido en dos volúmenes de tejido de medio organoide pulmonar, que comprende DMEM/F12 avanzado (Invitrogen) suplementado con nicotinamida 10 mM, N-acetilcisteína, suplemento 1× B27 menos vitamina A, NOGGIN humana recombinante (100 ng ml−1 , R&D Systems), EGF humano recombinante (50 ng ml−1, R&D Systems) e inhibidor de TGF-β A83-01 (100 nM, Tocris). Este medio organoide de pulmón se usó para todos los experimentos, excepto para los que se muestran en Datos extendidos Fig. 4f. Luego, el tejido se agitó durante 1 h a 37 ° C y la suspensión celular resultante se filtró a través de filtros de células de 100–40 μm y se sometió a lisis de glóbulos rojos con cloruro de amonio. A continuación, el sedimento celular se lavó y se resuspendió en 10 volúmenes de extracto II de membrana basal de factor de crecimiento reducido (Trevigen). A continuación, las células de la matriz se sembraron en placas de 24 pocillos en gotitas de 50 μl y se añadió medio tibio después de que las gotitas se solidificaron durante 10 min a temperatura ambiente. El medio se cambió cada 3 o 4 días y los organoides se pasaron cada 3 o 4 semanas. por disociación con TrypLE. El paso se basó en la durabilidad e integridad de ECM y la confluencia estimada de organoides, a juzgar por el volumen estimado de organoides a volumen de la gota de ECM. Los organoides pulmonares distales se pudieron pasar durante aproximadamente 6 meses y los organoides basales exhibieron inicialmente 6-7 duplicaciones cada 2 semanas. Los organoides alveolares se expandieron más lentamente con una tasa inicial de 3 a 4 duplicaciones cada 2 semanas, pero predominaron sobre los organoides basales después de varios meses. Calculados a partir de las tasas iniciales de división celular, los límites superiores de expansión basal y alveolar fueron 219 (524 288 veces) y 216 (65 536 veces), respectivamente. Para descartar la contaminación por células malignas, un patólogo certificado por la junta evaluó sistemáticamente los cultivos a largo plazo para detectar la presencia de displasia o carcinoma. Además, cinco cultivos de organoides a largo plazo (de 2 a 6 meses) se sometieron a secuenciación de próxima generación específica para excluir variantes de nucleótidos patogénicos (ver más abajo). Los detalles completos se proporcionan en los métodos complementarios.

El pulmón distal se disoció como se indicó anteriormente y todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en hielo. Incubamos 107 células con Fc Block (Biolegend 422301) y las diluimos 1:100 en tampón FACS (EDTA 2 mM y suero bovino fetal al 0,2 % en PBS 1x, pH 7,4), durante 10 min. Luego, las células se mezclaron con anticuerpos anti-CD45 conjugados con APC a 1 μg ml-1 en tampón FACS durante 30 min, se lavaron y se sometieron a dos rondas de agotamiento con perlas magnéticas de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi: anti-fibroblastos humanos). 130-050-601, anti-CD31 130-091-935, anti-APC 130-090-855, columna LS 130-042-401). A continuación, las células sin marcar se centrifugaron a 300 gy se marcaron con un cóctel de 1 μg ml−1 de anticuerpo anti-EPCAM PerCP-Cy5.5 y tinción de viabilidad Zombie Aqua (Biolegend 423101) diluido 1:400 a partir de la concentración madre en tampón FACS.

Para la crioconservación y recuperación, las gotas de ECM se disociaron pipeteando en tres volúmenes de PBS con EDTA 5 mM y luego se incubaron en hielo durante 1 hora. Las células se sedimentaron a 300 g durante 5 min y se resuspendieron en medio de congelación (suero de ternera fetal (Gibco), DMSO al 10 % v/v), se colocaron en crioviales y luego en recipientes Mr. Frosty (Thermo Fisher) y se almacenaron a –80 °C. durante la noche, seguido de transferencia a fase de vapor de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Los organoides se recuperaron mediante descongelación rápida en un baño de agua a 37 ° C, seguido de lavado en medio organoide y placas en ECM con medio organoide más 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 (Tocris).

Las células de las vías respiratorias distales se aislaron y colocaron en placas como se indicó anteriormente, con las siguientes excepciones: se utilizó DMEM/F12 avanzado en lugar de medio organoide durante la digestión con elastasa del tejido pulmonar, y las células se diluyeron en serie y se filtraron a través de un filtro de células de 40 μm y se contaron con un hemocitómetro. . Mil células epiteliales viables (por exclusión, tamaño y morfología de azul tripano) por μl de ECM se sembraron en placas por 5 μl de gotas de Matrigel por pocillo. El medio base consistía en un medio organoide que carecía de A83-01, EGF, NOGGIN, WNT3A o RSPO1. EGF (50 ng ml−1 finales, I+D), NOGGIN (100 ng ml−1 finales, I+D), WNT3A (100 ng ml−1 finales, I+D), RSPO1 (500 ng ml−1 finales, Peprotech) o el PORCUPINE inhibidor C59 (final 1 μM, Biogems) solo o en combinación con el medio base. Las imágenes se obtuvieron diez días después del enchapado primario con un microscopio de luz invertida con un aumento de 5x. Cada condición se sembró en placas por cuadruplicado y la formación de organoides se cuantificó utilizando el complemento de análisis de partículas (umbral, 4902 píxeles) en ImageJ (consulte Métodos complementarios).

Los cultivos de organoides pulmonares de individuos separados se disociaron 4 semanas después del enchapado primario y se sometieron a scRNA-seq basado en gotas con la plataforma 10x Genomics Single Cell 3 'con un UMI de 5 nucleótidos, de acuerdo con el protocolo del fabricante. La captura de células, la preparación de la biblioteca y la secuenciación se realizaron como se describió anteriormente37. Para el análisis de scRNA-seq en la Fig. 1k, se realizó una prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis modificada para determinar la importancia de la expresión génica del marcador diferencial para las células AT2 (SFTPC), basales (KRT5) y club (SCGB1A1), con todos P < 0,001. El análisis de componentes principales, t-SNE, agrupamiento basado en gráficos no supervisados, pruebas estadísticas y la trayectoria de pseudotiempo para todos los análisis de scRNA-seq se describen en Métodos complementarios y Datos complementarios 1.

Las células LysoTracker+ AT238 de organoides no fraccionados se purificaron mediante FACS y se cultivaron durante dos meses con un solo paso. Estos se disociaron y se sometieron a scRNA-seq basado en gotas con la plataforma v2 10x Genomics Chromium Single Cell 3 'de acuerdo con el protocolo del fabricante. La biblioteca se secuenció mediante secuenciación emparejada (lectura 1 de 26 pb y lectura 2 de 98 pb) con un índice de muestra único (8 pb) en un Illumina NextSeq 500. El preprocesamiento de datos y el análisis de componentes principales se llevaron a cabo con CellRanger v1.2. El análisis posterior se describe en Métodos complementarios y Datos complementarios 1.

Los cultivos de organoides se fijaron en MEC con glutaraldehído al 2,5 % en tampón de cacodilato 0,1 M (pH 7,4), se deshidrataron, se incluyeron en resina epoxi y se visualizaron con un microscopio electrónico de transmisión JEOL (modelo JEM1400) con un emisor LaB6 a 120 kV.

Los organoides se fijaron con paraformaldehído al 2 % a 4 °C durante la noche, se incluyeron en parafina y se seccionaron (10–20 μm) como se describió anteriormente37. Las secciones se desparafinaron y se tiñeron con H&E para el análisis histológico. Los anticuerpos utilizados para la tinción inmunocitoquímica siguiendo los protocolos de tinción estándar39 se enumeran en Métodos complementarios y las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal Leica-SP8.

La hibridación in situ de ARN se realizó como se describe 40 y las secuencias de sonda se proporcionan en Métodos complementarios.

Los organoides intactos y no infectados se fijaron en paraformaldehído al 2 % en tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) (paraformaldehído al 4 % para los organoides infectados) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron con PBS con glicina 100 mM, se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,5 %. en PBS durante 1 h, luego se incuba en tampón de tinción (BSA al 4 %, Tween-20 al 0,05 % en PBS pH 7,4, suero de burro/cabra al 10 %) durante una hora más, seguido de incubación con el anticuerpo primario durante 24 h a temperatura ambiente en tampón de tinción. A continuación, los montajes completos se lavaron con PBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes, faloidina y DAPI, durante 4 horas a temperatura ambiente en tampón de tinción. Después de lavados adicionales, los montajes completos se sumergieron en medio de montaje (Vectashield, Vector Laboratories) y se montaron en cubreobjetos con cámara para obtener imágenes en cuatro canales utilizando microscopios confocales Zeiss LSM 700 o 900. La representación 3D de pilas de imágenes confocales se realizó utilizando el software Volocity Image Analysis (Quorum Technologies Inc., Guelph, Ontario). Para la Fig. 4h, que requería cinco colores, los cilios se distinguieron tiñéndolos con dos anticuerpos secundarios fluorescentes y fusionando los vóxeles colocados en un canal pseudocoloreado utilizando el software Volocity. La tinción con lectina (FITC-Sambuca Nigrin, Vector Labs FL-1301; Biotin-Maackia Amurensis, Vector Labs FL-1301) se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante después de la fijación de los organoides con paraformaldehído al 0,1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. bloqueando con avidina/biotina (Vector Labs SP-2001). La lectina de biotina-Maackia Amurensis se marcó con conjugado de estreptavidina-PE (Thermo Fisher SA10041) y, después de lavar, se tomaron imágenes de la tinción de lectina en un Keyence BZ-X700.

Se secuenciaron diez cultivos de organoides mediante un ensayo comercial de resecuenciación dirigida con cobertura de extremo a extremo de 131 genes de cáncer y software complementario (TOMA COMPASS Tumor Mutational Profiling System, Foster City, CA) para determinar la presencia de mutaciones oncogénicas en organoides a largo plazo. culturas Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina NextSeq 500. Las variantes no sinónimas se enumeran en la Tabla complementaria 6. Los archivos de llamadas de variantes se proporcionan en los Datos complementarios 2.

Los cultivos de organoides dentro de las 2 a 3 semanas posteriores a la siembra primaria se disociaron con 1 U ml-1 de proteasa neutra (Worthington, Cat LS02100) y 100 KU DNasa I en medio de organoide de pulmón. Luego, los organoides basales se recolectaron por sedimentación por gravedad y el sobrenadante se aspiró o se recolectó para su uso posterior. Luego, los organoides basales se fraccionaron adicionalmente en un gradiente de Ficoll-Paque personalizado (4 vol Ficoll-Paque a 1 vol PBS) y se centrifugaron a 300 g durante 10 min a temperatura ambiente. Se aspiró el sobrenadante y el sedimento de organoide se resuspendió en 10 ml de PBS en un tubo cónico de 15 ml, se recogió por sedimentación por gravedad y se sembró en ECM como se describe anteriormente.

Los organoides se disociaron con TrypLE seguido de neutralización con suero de ternera fetal al 10 % en volumen, se sometieron a DNasa a 100 KU ml−1, se lavaron con medio organoide pulmonar y luego se incubaron con 100 volúmenes de sedimentos celulares de medio organoide pulmonar con 10 nM LysoTracker Red DND- 99 (Thermo Fisher L7528) a 37 °C durante 30 min. Luego, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS como se describe anteriormente, se incubaron con bloque Fc y luego se incubaron en hielo con un cóctel de marcado que constaba de 1 μg ml-1 de anticuerpo anti-EPCAM PerCP-Cy5.5 y tinción de viabilidad Zombie Aqua (Biolegend 423101) diluido 1:400 a partir de la concentración madre en tampón FACS. Las células EPCAMhi y LysoTrackerhi se clasificaron en medio organoide pulmonar con Y-27632 10 μM (Tocris 1254) y se cultivaron en ECM y medio organoide pulmonar con Y-27632 durante 24 h, seguido de medio organoide pulmonar sin Y-27632. El crecimiento del organoide AT2 puro se mejoró mediante la adición de medio acondicionado de células L que contenía suero 1:1 vol:vol (L-WRN CM) que contenía WNT3A, R-SPONDIN3 y NOGGIN y se complementó con EGF41 recombinante. La estrategia de selección completa se proporciona en la Fig. 1 complementaria. Todos los anticuerpos FACS se compraron en Biolegend. También se podrían obtener resultados cualitativamente idénticos con la purificación FACS anti-HTII-280 (marcador AT2, Terrace Biotech) en lugar de LysoTracker. Las células organoides AT2 se transdiferenciaron en células AT1 mediante la disociación de TrypLE de la MEC y la siembra en cubreobjetos de vidrio con cámaras, seguido de cultivo con DMEM/F12 avanzado y suero fetal de ternera al 5 %42.

Los organoides sin estroma FACS EPCAM+ en D14 se infectaron con lentivirus a un MOI estimado de 0,9, como se describió anteriormente43 con vectores lentivirales de tercera generación (PGK-GFP T2A Puro, SBI cat. n.º CD550A-1; mCherry modificado de pLentiCRISPRv1 (Addgene n.º . 49545) para incorporar un casete EF-1a-mCherry P2A Puro, regalo de Paul Rack). Noventa y seis horas después de la infección, los organoides se trataron con puromicina a una concentración de 600 ng ml-1 durante 48 h para seleccionar las células transducidas. Dos semanas después de la selección, los organoides que expresan GFP o los organoides que expresan mCherry se disociaron en células individuales y se mezclaron en una proporción de 1: 1 y se calificaron como monocromáticos o mixtos después de 28 días de cada paso. Se empleó el mismo enfoque para AT2 purificado y cultivos basales después de las respectivas estrategias de aislamiento a partir de un cultivo iniciador de organoide empobrecido en estroma, EPCAM+, purificado con FACS inicial.

Se obtuvo tejido pulmonar humano adulto y se disoció como se indicó anteriormente, pero las células se marcaron con Zombie Aqua live:dead tinción como se indicó anteriormente, se lavaron con tampón FACS y luego se fijaron en PFA al 2 % en PBS durante la noche a 4 °C. A continuación, las células se tiñeron usando el procedimiento de montaje completo como se describe anteriormente con la omisión del lavado con PBS-glicina. A continuación, las células fijadas y permeabilizadas se incubaron con una dilución 1:400 de anticuerpo anti-citoqueratina 5 humana de ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (Abcam) durante 24 h a 4 °C en tampón de permeabilización. A continuación, las células se lavaron con tampón FACS y se marcaron con anticuerpo TNFRSF12A antihumano de ratón conjugado con PE (clon ITEM-4, Biolegend) durante 30 min en hielo, seguido de lavado y análisis en un instrumento BD Aria Fusion. La estrategia de selección completa y la validación de qPCR del anticuerpo ITEM-4 se detallan en la Fig. 1 complementaria.

Las suspensiones unicelulares de pulmón distal humano fresco o cultivo de organoides primarios aproximadamente a las 4 semanas de cultivo se disociaron como se indicó anteriormente, se trataron con Fc Block (BioLegend) y se incubaron en tampón FACS con Zombie Aqua 1:400, 1 μg ml-1 EpCAM antihumano PerCP-Cy5.5 (CD326), 1 μg ml−1 APC antihumano ITGA6 (CD49f), 2 μg ml−1 FITC antihumano ITGB4 (CD104) y 1 μg ml−1 PE anti- TNFRSF12A humano (CD266). Treinta minutos después del marcaje, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se clasificaron según EPCAMhi, ITGA6/ITGB4hi, TNFRSF12Ahi y TNFRSF12Aneg. La estrategia de activación completa se proporciona en la figura complementaria 1. Se clasificaron más de 5000 células en tubos Eppendorf con medio organoide de pulmón e inhibidor de ROCK Y-27632 10 μM. Todos los anticuerpos FACS se adquirieron de Biolegend.

Las células se sembraron en ECM y se sumergieron en medio organoide de pulmón con inhibidor de ROCK Y-27632 10 μM. La densidad de siembra para las células aisladas por FACS del cultivo de organoides fue de 1000 células por pocillo a una densidad de 100 células por μl de ECM. La densidad de siembra para células aisladas por FACS de pulmón distal humano fresco fue de 3000 células por pocillo a una densidad de 300 células por μl de ECM. Después de 24 h, se cambió el medio para eliminar el inhibidor de ROCK, luego se cambió cada 72 h. La formación de organoide se cuantificó manualmente 14 días después de la siembra por dos observadores independientes.

Los cultivos no fraccionados que contenían tipos de células AT2, basales y club a las 2-3 semanas se infectaron por triplicado con la cepa PR8 de H1N1 modificada para expresar GFP tras la replicación viral44 después de 24 h de pretratamiento con compuestos antivirales. La ECM se dispersó mediante la adición de EDTA 5 mM en PBS, seguida de lavado e inoculación con el virus informador PR8-H1N1-GFP a una MOI estimada de 1 en medio que contenía vehículo o antivirales. Después de 12 h (un ciclo de infección de influenza), la expresión de GFP de organoide intacto se visualizó mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio automatizado Keyence BZ-X700, o se disoció en células individuales y se fijó con PFA al 0,1 % en PBS seguido de cuantificación FACS de células GFP+ ( La estrategia de activación se proporciona en la figura complementaria 1). Las curvas de respuesta a la dosis antiviral se generaron mediante el ajuste de la curva de regresión no lineal de cuatro parámetros con GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). El tropismo H1N1 se evaluó de manera similar a la anterior, con la excepción de que la fracción de células basales sedimentadas con Ficoll frente a las fracciones no basales se disociaron en células individuales, se contaron y se infectaron con un MOI estimado de 1 en medio organoide durante 1 h a 37 ° C, seguido de lavado y resiembra en ECM, cultivo durante 16 h y luego se somete a disociación y FACS como se indicó anteriormente.

Los organoides de pulmón que crecieron incrustados en gotas de ECM de 50 μl se transfirieron a un cultivo en suspensión como se describe28 con modificaciones. En resumen, los organoides integrados en ECM se desalojaron suavemente pipeteando con puntas LoBind estériles (Eppendorf 22493008) y se colocaron en tubos cónicos LoBind de 15 ml (Eppendorf 30122216) que contenían EDTA 5 mM enfriado con hielo en PBS. Se usaron cinco mililitros de solución de EDTA por gota de ECM (3 gotas de ECM por tubo cónico de 15 ml) rotando durante 1 hora a 4 °C en una plataforma giratoria. Los organoides se centrifugaron a 200 g durante 3 min a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en medio de crecimiento en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos de unión ultrabaja (Corning Costar 3471). Los organoides suspendidos se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante diferentes tiempos (rango de 0 a 30 días) para caracterizar la polaridad apical, la ciliogénesis y la diferenciación, y preparar organoides apical para experimentos de infección con SARS-CoV-2.

Las células VeroE6 se obtuvieron de ATCC como stocks libres de micoplasma y se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10 %. El SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020) se pasó en células VeroE6 en DMEM con FBS al 2 %. Los títulos se determinaron mediante un ensayo de placas en células VeroE6 utilizando Avicel (biopolímero FMC) y cristal violeta (Sigma), se verificó la secuencia del genoma viral y todas las infecciones se realizaron con el virus del pase 3. Los organoides se contaron y se pasaron a medio de suspensión durante 6 a 8 días y luego se resuspendieron en medio de virus o en un volumen igual de medio simulado a una MOI de 1 en relación con el total de células organoides en la muestra, y luego se incubaron a 37 °C por debajo del 5 %. CO2 durante 2 h. Luego, los organoides se colocaron en placas en suspensión en medio de organoides de pulmón (organoides con salida apical). En los puntos de tiempo indicados, los organoides apicales se lavaron con medio de organoide de pulmón y PBS y se resuspendieron en TRIzol LS (Thermo Fisher), PFA al 4 % recién preparado en PBS o 250 μl de medio de organoide de pulmón. Las células resuspendidas en medio organoide de pulmón se lisaron por congelación a -80 °C. Los sobrenadantes de cultivo se conservaron en TRIzol LS o se agregaron directamente a monocapas de ensayo de placa. Todo el trabajo de SARS-CoV-2 se realizó en un gabinete de bioseguridad de clase II en condiciones BSL3 en la Universidad de Stanford.

El ARN de los organoides infectados con SARS-CoV-2 se extrajo agregando 750 μl de TRIzol (Thermo Fisher Scientific), incubando a 55 °C durante 5 min y luego agregando 150 μl de cloroformo. Después de mezclar cada muestra con vortex durante 7 s, las muestras se incubaron a 25 °C durante 5 min y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 min a 4 °C. La capa acuosa se eliminó cuidadosamente de cada muestra, se mezcló con dos volúmenes de etanol al 100 % y se purificó usando un kit RNA Clean & Concentrator-25 (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras de ARN se trataron con ADNasa (kit sin ADN Turbo, Thermo Fisher Scientific). Se usó Brilliant II SYBR Green QRT–PCR 1-Step Master Mix (VWR) para convertir el ARN en ADNc y para amplificar regiones específicas de ARN en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). La reacción de transcripción inversa se realizó durante 30 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, seguido de qPCR de dos pasos con 95 °C durante 10 s y 55 °C durante 30 s, para un total de 40 ciclos. Se usaron dos conjuntos de cebadores para amplificar el ARN genómico (ARNg) del SARS-CoV-2 no empalmado que abarca las posiciones de nucleótidos 14221–14306, o el ARNg30 del SARS-CoV-2 empalmado. Las secuencias de cebadores se encuentran en la Tabla complementaria 7.

La tinción óptima del tejido pulmonar distal humano se logró a partir de muestras fijadas dentro de los 30 minutos de las resecciones quirúrgicas primarias en paraformaldehído al 4% en PBS. Las muestras se incubaron en fijador durante la noche a 4 °C, se transfirieron a sacarosa al 30 % y se incluyeron en OCT. Las secciones congeladas se cortaron a 10 μm, se sometieron a recuperación de antígeno basada en citrato (Vector Labs) a 70 °C durante 30 min y luego se bloquearon durante 1 h con suero de cabra al 10 % en tampón de lavado IF como se describió anteriormente. Se usó anti-TNFRSF12A de ratón (clon ITEM-4, Biolegend) para la Fig. 3a y anti-TNFRSF12A policlonal de conejo (ThermoFisher PA5-20275) para la Fig. 3b, f y Fig. 845 de datos ampliados.

Los organoides vivos se mantuvieron entre dos cubreobjetos en una cámara de visualización (cubreobjetos de dos cámaras Lab-Tek II) y se filmaron con un microscopio Nikon TE2000E con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) con un objetivo de 63x. Las muestras se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2 durante la toma de imágenes. Los videos digitales fueron recopilados por una cámara digital Hamamatsu ORCA-285 de alta resolución y renderizados usando el software OpenLab 5.5.2 (Improvision). Después del registro, las muestras se fijaron y tiñeron sin retirarlas de las cámaras y se transfirieron al microscopio confocal para microscopía de inmunofluorescencia.

A menos que se indique lo contrario, todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes con cada experimento independiente realizado utilizando un cultivo organoide derivado de un individuo. Los límites del diagrama de caja abarcan del primer al tercer cuartil, las líneas horizontales representan los valores de la mediana y los bigotes representan los mínimos o máximos del rango de datos o, en el caso de los valores atípicos, 1,5 veces el rango intercuartílico con los valores atípicos representados por puntos de datos. Las pruebas t fueron de dos colas y los valores de P se indican como *P < 0,05, **P ≤ 0,01 y ***P ≤ 0,001. Los detalles completos se proporcionan en Métodos complementarios.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Los conjuntos de datos de scRNA-seq se han depositado en Gene Expression Omnibus con el código de acceso GSE106850. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Las secuencias de comandos para realizar análisis de datos scRNA-seq se proporcionan con este documento. El código personalizado está disponible en GitHub (https://github.com/ameen-salahudeen/lung_organoid).

Hogan, B. & Tata, PR Organización celular y biología del sistema respiratorio. Nat. Biol celular. https://doi.org/10.1038/s41556-019-0357-7 (2019).

Rawlins, EL et al. El papel de las células Scgb1a1+ Clara en el mantenimiento y la reparación a largo plazo de las vías respiratorias pulmonares, pero no del epitelio alveolar. Célula madre celular 4, 525–534 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kathiriya, JJ, Brumwell, AN, Jackson, JR, Tang, X. & Chapman, HA Distintas células madre epiteliales de las vías respiratorias se esconden entre las células del club, pero se movilizan para promover la regeneración alveolar. Cell Stem Cell 26, 346–358.e4 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barkauskas, CE et al. Las células alveolares tipo 2 son células madre en el pulmón adulto. J. Clin. Invertir. 123, 3025–3036 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desai, TJ, Brownfield, DG y Krasnow, MA Células madre y progenitoras alveolares en el desarrollo, la renovación y el cáncer de los pulmones. Naturaleza 507, 190–194 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q. et al. Regeneración pulmonar por células madre multipotentes que residen en la unión del conducto bronquioalveolar. Nat. Gineta. 51, 728–738 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vaughan, AE et al. Los progenitores de linaje negativo se movilizan para regenerar el epitelio pulmonar después de una lesión importante. Naturaleza 517, 621–625 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Zuo, W. et al. Las células madre p63+Krt5+ de las vías respiratorias distales son esenciales para la regeneración pulmonar. Naturaleza 517, 616–620 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Juul, NH, Stockman, CA & Desai, TJ Células de nicho y señales que regulan las células madre alveolares pulmonares in vivo. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a035717 (2020).

Sucre, JMS et al. Establecimiento exitoso de epitelio alveolar primario tipo II con cocultivo organotípico 3D. Soy. J. Respir. Mol celular. Biol. 59, 158–166 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zacharias, WJ et al. Regeneración del alvéolo pulmonar por un progenitor epitelial conservado evolutivamente. Naturaleza 555, 251–255 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nikolić, MZ & Rawlins, EL Lung organoides y su uso para estudiar la interacción célula-célula. actual Patobiol. Rep. 5, 223–231 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Evans, KV & Lee, JH Guerras alveolares: el surgimiento de modelos in vitro para comprender el mantenimiento, la regeneración y la enfermedad de los alveolos pulmonares humanos. Traducción de células madre. Medicina. 9, 867–881 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Anchang, B. et al. Visualización e inferencia de jerarquía celular de datos de una sola celda usando SPADE. Nat. Protocolo 11, 1264–1279 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cao, J. et al. El panorama transcripcional unicelular de la organogénesis de los mamíferos. Naturaleza 566, 496–502 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nabhan, AN, Brownfield, DG, Harbury, PB, Krasnow, MA & Desai, TJ Los nichos de señalización de Wnt de una sola célula mantienen el tallo de las células alveolares de tipo 2. Ciencia 359, 1118–1123 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roca, JR et al. Células basales como células madre de la tráquea de ratón y del epitelio de las vías respiratorias humanas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 12771–12775 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kajiji, S., Tamura, RN y Quaranta, V. Una nueva integrina (alfa E beta 4) de células epiteliales humanas sugiere una cuarta familia de receptores de adhesión de integrina. EMBO J. 8, 673–680 (1989).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stange, DE et al. Las células principales Troy+ diferenciadas actúan como células madre de reserva para generar todos los linajes del epitelio del estómago. Celda 155, 357–368 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Whitfield, ML, George, LK, Grant, GD y Perou, CM Marcadores comunes de proliferación. Nat. Rev. Cáncer 6, 99–106 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Roca, JR et al. Diferenciación dependiente de muescas de células madre basales de las vías respiratorias adultas. Célula madre celular 8, 639–648 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pardo-Saganta, A. et al. La lesión induce la segregación directa del linaje de subpoblaciones de células madre/progenitoras basales de las vías respiratorias funcionalmente distintas. Cell Stem Cell 16, 184–197 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quinton, PM Ambas formas a la vez: mantener limpias las vías respiratorias pequeñas. Fisiología (Bethesda) 32, 380–390 (2017).

CAS Google Académico

Zhou, J. et al. Organoides diferenciados de las vías respiratorias humanas para evaluar la infectividad del virus de la influenza emergente. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, 6822–6827 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Imai, M. & Kawaoka, Y. El papel de la especificidad de unión al receptor en la transmisión entre especies de los virus de la influenza. actual Opinión Virol. 2, 160–167 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumaki, Y., Day, CW, Smee, DF, Morrey, JD y Barnard, DL Eficacia in vitro e in vivo de los análogos de fluorodesoxicitidina contra infecciones por el virus de la influenza aviar altamente patógena H5N1, estacional y pandémica H1N1. Res. antivirales. 92, 329–340 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Un nuevo coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019. N. Engl. J.Med. 382, 727–733 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Co, JY et al. Control de la polaridad epitelial: un modelo enteroide humano para las interacciones huésped-patógeno. Informe celular 26, 2509–2520.e4 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamers, MM et al. SARS-CoV-2 infecta productivamente los enterocitos intestinales humanos. Ciencia 369, 50–54 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hou, YJ et al. La genética inversa del SARS-CoV-2 revela un gradiente de infección variable en el tracto respiratorio. Celda 182, 429–446.e14 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tinte, BR et al. Generación in vitro de organoides de pulmón derivados de células madre pluripotentes humanas. eLife 4, e05098 (2015).

Artículo PubMed Central Google Académico

Chen, YW et al. Un modelo tridimensional del desarrollo y la enfermedad de los pulmones humanos a partir de células madre pluripotentes. Nat. Biol celular. 19, 542–549 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jacob, A. et al. Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en células epiteliales alveolares pulmonares funcionales. Cell Stem Cell 21, 472–488.e10 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, Y., Korogi, Y., Hirai, T. & Gotoh, S. Un método para generar organoides alveolares utilizando células madre pluripotentes humanas. Métodos Cell Biol. 159, 115–141 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Montoro, DT et al. Una jerarquía epitelial de las vías respiratorias revisada incluye ionocitos que expresan CFTR. Naturaleza 560, 319–324 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lukassen, S. et al. El receptor ACE2 y TMPRSS2 del SARS-CoV-2 se expresan principalmente en células secretoras transitorias bronquiales. EMBO J. 39, e105114 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yan, KS et al. No equivalencia de los ligandos Wnt y R-spondin durante la autorrenovación de células madre intestinales Lgr5+. Naturaleza 545, 238–242 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van der Velden, JL, Bertoncello, I. & McQualter, JL LysoTracker es un marcador de células alveolares tipo II diferenciadas. Respirar Res. 14, 123 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Chang, J. et al. Gpr124 es esencial para la integridad de la barrera hematoencefálica en la enfermedad del sistema nervioso central. Nat. Medicina. 23, 450–460 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagendran, M., Riordan, DP, Harbury, PB & Desai, TJ Clasificación automatizada de tipos de células en tejidos intactos mediante perfiles moleculares unicelulares. eLife 7, e30510 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Neal, JT et al. Modelado organoide del microambiente inmune tumoral. Celda 175, 1972–1988.e16 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobbs, LG, Williams, MC & Brandt, AE Cambios en las características bioquímicas y patrón de unión de lectina de células alveolares tipo II con el tiempo en cultivo. bioquimica Biografía. Acta 846, 155–166 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Van Lidth de Jeude, JF, Vermeulen, JL, Montenegro-Miranda, PS, Van den Brink, GR y Heijmans, J. Un protocolo para la transducción lentiviral y el análisis posterior de organoides intestinales. J. Vis. Exp. 98, e52531 (2015).

Google Académico

Manicassamy, B. et al. Análisis de la dinámica in vivo de la infección por el virus de la influenza en ratones usando un virus reportero GFP. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 11531–11536 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karaca, G. et al. La señalización TWEAK/Fn14 es necesaria para la regeneración del hígado después de una hepatectomía parcial en ratones. PLoS ONE 9, e83987 (2014).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Descargar referencias

Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Kuo y Desai para los debates; el Banco de Tejidos de Stanford, J. Shrager, M. Berry y W. Trope para la adquisición de tejidos; S. Plevritis para análisis de trayectoria; y la instalación FACS de células madre de Stanford, P. Chu, A. McCormick, D. Mendoza, F. de la Vega y J. Zengel por su experiencia técnica. El coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislamiento USA-WA1/2020, NR-52281 fue depositado por los CDC y obtenido a través de BEI Resources, NIAID, NIH. Las becas que apoyan a los autores son las siguientes: AAS: AP Giannini, ECOG-ACRIN, P. Carbone, Stanford Cancer Institute; SSC: Beca del Programa de Capacitación de Científicos Médicos de Stanford T32 GM007365-44; JZ: Beca para Graduados de Stanford.; SMdlO: Puentes CIRM. El apoyo financiero es el siguiente: AR: subvención NIH T32 AI007502-23; RAF: Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon (DRG-2286-17); VvU: Subvención Rubicon de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (452181214); CS y JZ: NSF DMS 1712800 y Stanford Discovery Innovation Fund; KCG y MMD: Instituto Médico Howard Hughes; CAB: Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Grant 1016687. Este trabajo también fue apoyado por CIRM DISC2-09637 a CJK y TJD: Bill and Melinda Gates Foundation OPP1113682 a CJK, MRA y CAB; Beca Challenge de la Fundación Novo Nordisk para MRA y MM-C.; Fondo Mathers Foundation Covid para KCG; y NIH otorga K08DE027730 a AAS, U19AI057229 a MMD, R56AI111460 a JSG, 5R01HL14254902 a TJD, DK11572802 a CJK y KCG, R01AI157155 a RSB y U19AI116484, U01DK085527, U01CA217851, U01CA176299 y U01DE025188 a CJK. CAB es el erudito de la facultad de Tashia y John Morgridge e investigador de Chan Zuckerberg Biohub. TJD es el becario de la facultad dotado por la familia Woods en medicina traslacional pediátrica. CJK es el Profesor de Medicina Maureen Lyles D'Ambrogio.

Ameen A. Salahudeen

Dirección actual: División de Hematología y Oncología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi

División de Hematología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi, Sean M. de la O, António JM Santos, Jihang Ju, Arpit Batish, Tatsuya Usui, Daniel J. Hart & Calvin J. Kuo

División de Enfermedades Infecciosas y Medicina Geográfica, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Arjun Rustagi y Catherine A. Blish

Escuela de Ingeniería de la Universidad de Stanford, Departamento de Ingeniería Eléctrica, Stanford, CA, EE. UU.

Junjie Zhu

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar, Jeffrey S. Glenn, Mark M. Davis y Manuel R. Amieva

Instituto de Inmunidad, Trasplante e Infección de Stanford, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar & Mark M. Davis

Stanford ChEM-H, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

ryan a. flynn

Departamento de Química, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

ryan a. flynn

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Mar Margalef-Español & Manuel R. Amieva

10x Genómica, Pleasanton, CA, EE. UU.

Grace XY Zheng, Jessica M. Terry, Phillip Belgrader, Solongo B. Ziraldo y Tarjei S. Mikkelsen

Departamento de Epidemiología, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Caitlin E. Edwards y Ralph S. Baric

Departamento de Fisiología Molecular y Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Vincent Luca y K. Christopher García

División de Ciencia de Datos Biomédicos, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Benedict Anchang y Chiara Sabatti

División de Pulmonar, Alergia y Cuidados Críticos, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Mónica Nagendran y Tushar J. Desai

División de Gastroenterología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Khanh Nguyen y Jeffrey S. Glenn

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Pehr B Harbury

Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

K. Christopher García y Mark M. Davis

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Ralph S. Baric

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

Catalina A. Blish

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

AAS y SSC concibieron, diseñaron y realizaron experimentos, analizaron datos y escribieron el manuscrito. AR diseñó y realizó infecciones por SARS-CoV-2. JZ, VvU y CS diseñaron e interpretaron estudios de RNA-seq de una sola célula. RAF realizó qRT-PCR. MM-C., SMdlO, AJMS, TU, DJH, JJ y AB realizaron cultivos y análisis de organoides. Paneles FACS diseñados por LEW y MMD. VL y KCG contribuyeron con el mutante DLL4 E12. BA realizó el análisis SPADE. KN y JSG diseñaron y ejecutaron estudios de influenza. GXYZ, JMT, PB, SBZ y TSM diseñaron y ejecutaron experimentos de RNA-seq de una sola célula. CEE y RSB asesoraron sobre estudios de SARS-CoV-2. MN y PBH proporcionaron protocolos de hibridación in situ. MRA, CAB, TJD y CJK concibieron y diseñaron experimentos, analizaron datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Catherine A. Blish, Tushar J. Desai o Calvin J. Kuo.

CJK, AAS, SSC, CAB, AR, MRA, MM-C., SMdlO y TU figuran como inventores en la patente provisional 63/053.079 que describe los métodos de este documento. CJK es uno de los fundadores de Surrozen Inc. Todos los demás autores declaran no tener intereses en conflicto.

Información de revisión por pares Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Esquema del inicio del cultivo a partir del pulmón distal humano. b, Evaluación de microscopía de campo claro de los factores de crecimiento exógenos requeridos y cuantificación de organoide automatizado después del día 10 de cultivo de organoide definido químicamente con factores de crecimiento recombinantes especificados, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 4 por condición, los datos son la media ± sem, * = P < 0,05, prueba t de Student de dos colas, barra de escala = 500 μm. c, Arriba, esquema de purificación para aislar células epiteliales de pulmón humano distal que implica el agotamiento negativo de microesferas MACS de células hematopoyéticas CD45+, células endoteliales y fibroblastos, seguido de selección positiva por FACS para epitelio EPCAM+. Abajo a la izquierda, FACS representativo que demuestra una pureza de EPCAM+ >99,9 % (naranja) tras un nuevo análisis frente a controles no teñidos (gris). Abajo a la derecha, proliferación de células EPCAM+ purificadas de cultivos de pulmón distal después del día 10 de cultivo de organoide con factores de crecimiento específicos, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 3 por condición, los datos son media ± sem , ** = P < 0,01, prueba t de Student de dos colas. d, Imágenes confocales de transmisión de lapso de tiempo de organoides sólidos y quísticos que se originan a partir de células pulmonares distales humanas disociadas individuales, barra de escala = 100 μm. por ejemplo, estudios de mezcla de clonalidad. e, Esquema de estudios de mezcla de células que expresan lentivirus-GFP- y lentivirus-mCherry para determinar la clonalidad. f, Imágenes fluorescentes en vivo representativas de los organoides verdes y rojos resultantes de (e), barra de escala = 500 μm. g, Cuantificación de cultivos de organoides pulmonares distales rojos, verdes o quiméricos de dos individuos (1, 2) después del pase inicial y en serie (P1 = pase 1).

Datos fuente

a–c, el agrupamiento no supervisado de poblaciones celulares totales demuestra consistencia en los principales genes expresados ​​diferencialmente correspondientes a células basales (KRT5/6), club (SCGB1A1) y AT2 (SFTPC). La fracción epitelial de estos cultivos osciló entre aproximadamente el 90 y el 99 % de todas las células, siendo el resto fibroblastos (VIM+) o células mononucleares (HLA-DR+, probablemente macrófagos alveolares). d – f, visualización de t-SNE y diagramas de violín para genes marcadores correspondientes a cada población. Tenga en cuenta que una población única enriquecida para los genes SPRR, que se ha descrito que marca la metaplasia escamosa, se encontró exclusivamente en el cultivo organoide de Lung 3, derivado de un individuo que era un fumador activo.

a, Gráfica de ESPADA de celdas agrupadas donde cada punto representa estados de celda que están más relacionados en la misma rama o en ramas adyacentes de un árbol de expansión mínima. Nota: Las células AT2 existen en una rama distal a las células basales y club, lo que sugiere que no hay una jerarquía de linaje entre las células AT2, basales y club. b, los gráficos SPADE de muestras agrupadas de scRNA-seq después de excluir las células AT2, VIM+ y HLA-DR+ respaldan las relaciones de linaje entre las poblaciones basal (azul) y club (roja) por ramas de células club que emanan de las células basales. c, parcelas SPADE de poblaciones Basal 1, Basal 2 y club. d, Izquierda, la expresión génica de SCGB1A1 muestra una mayor expresión en los linajes de células club frente a los basales (izquierda) en comparación con KRT5 (centro). A la derecha, mediana de la expresión génica de TNFRSF12A, que muestra un alto (contorno naranja) y un bajo (contorno azul) dentro de las ramas de las células basales e infiere una posible relación de linaje. e, análisis de trayectoria de pseudotiempo Monocle 3 de transcriptomas de células individuales de Basal 1 conectados a células club representadas con UMAP (número de celda, n = 3721), coloreadas por grupo de células (izquierda) y gradiente de pseudotiempo (derecha).

a, Izquierda, imágenes confocales de un organoide AT2 vivo a los 67 días de cultivo marcado con tinción nuclear Hoescht y LysoTracker Red DND-99. Arriba a la derecha, aislamiento de organoides AT2 purificados. Gráficos FACS representativos que muestran la purificación de LysoTracker Red AT2 a partir de cultivos de organoides no fraccionados. Abajo a la derecha, la inmunotinción de cytospin de células AT2 clasificadas con LysoTracker muestra alta pureza (100/100 células SPC+ SCGB1A1- KRT5); barra de escala = 50 μm). b, Esquema del aislamiento FACS de células AT2 de organoides de pulmón distal mixtos humanos como células EPCAM+LysoTracker+ AT2 seguidas de cultivo de organoides clonogénicos a largo plazo. c, Imagen representativa de estudios de mezcla clonal de células AT2 marcadas con lentivirus, EPCAM+LysoTracker+, sin estroma, que demuestran la presencia de organoides completamente mCherry+ o GFP+, pero no quiméricos, realizados como en Datos extendidos Fig. 1e-g, paso 1 después de la infección lentiviral , barra de escala = 200 μm. d, Cuantificación de cultivos de organoides AT2 rojos, verdes o quiméricos como en (c) de dos individuos (1, 2) después del pase inicial y en serie (P1 = pase 1). e, proliferación de organoide AT2 con diferentes combinaciones de factores de nicho recombinantes e inhibidor de PORCUPINE C59 (1 mM), NOGGIN (N), EGF (E), WNT3A (W), R-SPONDIN1 (R). n = 3 por condición, los datos son la media ± sem, * = P < 0,05, *** = P < 0,001, prueba t de Student de dos colas. f, Microscopía de campo claro que compara la mejora del crecimiento de organoides AT2 puros en medios de organoides de pulmón (EN) químicamente definidos versus medios acondicionados de células L que contienen suero que contienen WNT3A, NOGGIN y R-SPONDIN3 (L-WRN CM) suplementados con EGF recombinante, un experimento . Barra de escala = 200 μm. g, Imagen de microscopía electrónica de transmisión del organoide AT2 representativo a los 28 días de cultivo. Obsérvense las microvellosidades apicales (flechas negras) y los cuerpos lamelares (flechas rojas); barra de escala = 10 μm.

Datos fuente

a–c, Los organoides basales en cultivos mixtos forman progresivamente lúmenes internos, lo que no está asociado con la apoptosis. a, KRT5 IF, cultivo del día 26, barra de escala = 200 μm. b. Cuantificación del lumen, cultivo d12 frente a d26, determinación única. c, Ausencia de apoptosis en la luz interna del organoide de células basales d26, IF de caspasa escindida, de la Fig. 2b, barra de escala = 20 μm. d, e, Aislamiento de organoides de células basales purificados mediante sedimentación diferencial en Ficoll. d, Esquema y enriquecimiento a > 90 % de células KRT5+ según lo medido por KRT5 FACS intracelular de células organoides basales sedimentadas; barra de escala = 100 μm. e, la microscopía de lapso de tiempo en serie de organoides basales sedimentados revela cavitación espontánea dentro de las dos semanas posteriores al paso o dentro de las cuatro semanas posteriores al inicio del cultivo; barra de escala = 25 μm. f, g, estudios de mezcla clonal de células organoides basales marcadas con lentivirus, purificadas con Ficoll y sin estroma que demuestran completamente mCherry+ o GFP+ pero no organoides quiméricos como en Datos ampliados Fig. 1f, pasaje 1 después de infección lentiviral, barra de escala = 200 μm . f, Estudio de imagen de mezcla clonal representativo. g, cuantificación. h, evaluación del factor de crecimiento para organoides basales después de la sedimentación d14, disociación enzimática y cultivo clonogénico. El crecimiento no se vio afectado por el inhibidor de PORCUPINE C59 (1 μM). n = 4 por condición, los datos son la media ± sem, *** = P < 0,001, prueba t de Student de dos colas.

Datos fuente

a, El análisis de agrupamiento de alta resolución identifica una subpoblación de células basales activa reproducible con una expresión significativamente mayor de ARNm para TNFRSF12A, el marcador de la vía NOTCH HES1 y el marcador de proliferación MKI67. Prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis modificada valores p de dos colas: TNFRSF12A 4.15 × 10−8; HES1 2,4 × 10−10; MKI67 3,4 × 10−3. b, el agrupamiento de resolución fina de poblaciones KRT5+ identifica dos subgrupos Basal 1, Basal 1.1 y 1.2. c, Gene Ontology La sobrerrepresentación de PANTHER de genes expresados ​​diferencialmente enriquecidos en Basal 1.2 frente a 1.1 muestra que la mayoría de los procesos de Basal 1.2 implican el ciclo celular (asteriscos). El análisis completo se proporciona en la Tabla 3 complementaria. los tres genes) frente al resto de las células (gris), P < 0,001 Prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis de dos colas. e, visualización de t-SNE de la expresión de TNFRSF12A e ITGA6 de d entre células con expresión del gen EPCAM+ITGA6+ITGB4+ y subdivisión por expresión de ARNm alta (cuartil superior, naranja), media (rosa) y baja (cuartil inferior, azul marino). f, la expresión génica asociada a la proliferación se enriquece progresivamente para fracciones de células scRNA-seq en células EPCAM+ITGA6+ITGB4+ que se estratifican para una expresión baja, media o alta de ARNm de TNFRSF12A como en e. Los datos en f representan fracciones de población celular de un solo experimento. *** = P < 0,001, prueba de chi-cuadrado de dos colas.

a, Aislamiento de Basal 1 y Basal 2 mediante sedimentación diferencial de células KRT5+ seguido de clasificación FACS de EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12A+ (Basal 1) frente a EPCAM-ITGA6-ITGB4-TNFRSF12A- (Basal 2). b, medición de FACS intracelular de la expresión de la proteína KRT5 en las fracciones Basal 1 y 2 de a. c, Campo claro representativo de los cultivos de organoides del día 14 de a, b. d, Cuantificación de 3 experimentos independientes de a–c, el diagrama de caja representa el primer cuartil, la mediana, el tercer cuartil y los bigotes representan el mínimo y el máximo. *** P < 0,001, prueba t de Student de dos colas. e, medición de qPCR de dos genes Basal 2 regulados diferencialmente de las tres réplicas biológicas de scRNA-seq (Datos extendidos Fig. 6, SPRR1B, TMSB4X) después de un cultivo prolongado de células Basal 1 aisladas por FACS. Los datos son la media relativa ± sem de cultivos de tres experimentos independientes, ** = P < 0,01, prueba t de Student de dos colas. f, RNA FISH que demuestra transcripciones celulares de TMSB4X y SPRR1B dentro de organoides que se originan en células Basal 1 (flechas), barra de escala = 25 μm. g, inmunotinción de KRT5 y SFTPC y SCGB1A1 RNA FISH de células TNFRSF12Ahi Basal 1 aisladas por FACS bajo vehículo, agonismo de NOTCH (péptido JAG1) o antagonismo de NOTCH con el ligando similar a Delta mutante 4 (DLL4E12; E12) o el inhibidor de gamma secretasa DBZ; barra de escala = 50 μm. h, Cuantificación fluorescente de la reducción del colorante de resazurina para estimar la proliferación celular relativa en g, los datos se normalizan al vehículo (V) y representan la media ± sem de cinco experimentos independientes, * P < 0,05, prueba t de Student de dos colas. i, Cuantificación de la expresión génica de SCGB1A1 y SFTPC por RNA FISH en el contexto del agonismo o antagonismo de NOTCH de tres experimentos independientes, ** P < 0,01, *** P < 0,001, prueba t de Student de dos colas. La regulación al alza del ARNm de SFTPC no estuvo acompañada por la producción de proteínas de cuerpo lamelar o SFTPC (datos no mostrados).

Datos fuente

a, b, inmunotinción de KRT5 y TNFRSF12A en vías respiratorias distales humanas de dos individuos, barra de escala = 100 μm. c, inmunotinción de KRT5, TNFRSF12A y p63 en vías respiratorias distales humanas, barra de escala = 100 μm. d, análisis FACS de pulmón distal humano recién fijado con anti-KRT5 (intracelular) y anti-TNFRSF12A monoclonal (superficie celular) (arriba), o aislamiento FACS secuencial de pulmón distal humano recién disociado de células EPCAM+ITGA6+ITGB4+ seguido de fraccionamiento en subconjuntos TNFRSF12Ahi o TNFRSF12Aneg (abajo), seleccionados previamente en singletes vivos y utilizados para experimentos de cultivo en la Fig. 3d-g.

a, b, modelado de organoides de pulmón distal de infección por influenza H1N1. a, Transmisión combinada e imágenes confocales de GFP de organoides AT2 purificados (izquierda) y basales purificados (derecha) 12 h después de la infección con el virus de la influenza PR8-GFP H1N1, cuantificados por FACS para el % de células GFP+. El gráfico de barras representa el porcentaje medio de células infectadas de tres repeticiones técnicas, P = 0,57, prueba de chi-cuadrado. Barras de escala = 50 μm. b, Cuantificación del genoma viral a lo largo del tiempo de sobrenadantes mixtos de cultivo de organoides de pulmón distal sometidos a infección inicial de H1N1 de tipo salvaje a una multiplicidad de infección (MOI) estimada de 0,01, qRT-PCR, los datos representan la media de tres experimentos independientes ± sem c , d, tinción de lectina con lectinas de M. amurensis (a2-3) y S. nigra (a2-6) o controles negativos sin lectina para caracterizar los residuos de ácido siálico que sirven como moléculas de superficie para la entrada del virus de la influenza en la célula huésped. Organoides AT2 (c) y organoides basales (d). Barra de escala = 25 μm. e, Curvas de respuesta a la dosis para dos clases diferentes de medicamentos antivirales sobre la infectividad y la replicación de la influenza. El análogo de nucleósido FdC demostró una actividad dependiente de la dosis con una IC50 de 340 nM en comparación con el inhibidor de la neuraminidasa zanamivir, que solo afecta la excreción viral pero no la infectividad ni la replicación. n = 3 por condición, los datos representan la media ± sem f, micrografía de fluorescencia de la detección de múltiples pocillos de varios agentes antivirales seleccionados después de la infección por organoide H1N1 PR8-GFP en formato de 48 pocillos. FdC = análogo de nucleósido 2'-desoxi-2'-fluorocitidina. Cpd = compuesto #.

Datos fuente

a, gráficos de scRNA-seq de la expresión génica de ACE2 y TMPRSS2 en organoides de pulmón distal mixtos integrados en ECM como en la Fig. 1a-h. b, Diagrama de extracción de ECM y cultivo en suspensión que conduce a la polaridad apical hacia fuera de los organoides pulmonares. c, Microscopía confocal representativa que muestra la reorganización de microfilamentos (faloidina) y microtúbulos acetilados (AcTUB) tras la extracción de ECM. Barra de escala = 10 μm. d-f, polarización y diferenciación ciliar acelerada de organoides basales apical-out. d, Secciones 3D confocales (paneles superiores) y reconstrucciones de superficie (paneles inferiores) de organoides pulmonares apicales en diferentes días después de la extracción de ECM. En el día 0 (d0), la organización de microfilamentos (verde, faloidina) y microtúbulos (rojo, tubulina acetilada) no está polarizada, mientras que las cadenas de unión (ZO-1, blanco) están polarizadas. Para el día 2 en suspensión (d2), ZO-1 (blanco) forma anillos de unión en la periferia apical de cada célula que mira hacia el lado externo de los organoides y el citoesqueleto de actina forma microvellosidades (verde) que miran hacia afuera (polaridad apical hacia afuera). Además, en d2 algunas células inician la polarización de microtúbulos. Para el día 5 (d5) muchas más células tienen cilios móviles mirando hacia afuera. Los cilios móviles maduros se pueden observar durante varias semanas, por ejemplo, en el día 14 (d14). e, reconstrucción confocal 3D de un organoide incrustado en ECM que consiste principalmente en células madre basales (KRT5+, blanco). f, A medida que se establece la polaridad apical hacia fuera en el cultivo en suspensión y comienza la ciliogénesis, se encuentran células basales KRT5+ debajo del epitelio polarizado. g, las células SCGB1A1+ Club con polaridad apical hacia fuera están presentes en la superficie exterior. En todos los paneles, los núcleos se tiñen de azul con DAPI y la organización de los microfilamentos de actina se visualiza con faloidina (verde). Barras de escala = 10 μm. h–j, Cultivo en suspensión prolongado de organoides AT2 (día 10 después de la suspensión) induce polarización apical y diferenciación AT1. h, Las secciones ópticas a través de organoides derivados de alveolos después de 10 días en cultivo en suspensión muestran una disminución de la abundancia de células AT2, mientras que las células cuboidales individuales comienzan a expresar el marcador AT1 HTI-56 (rojo), una proteína transmembrana específica de la membrana apical del tipo alveolar 1 neumocitos (AT1). Barras de escala = 10 μm. i, j, Las vistas laterales de los organoides alveolares después de 10 días de cultivo en suspensión revelan células AT1 delgadas con complejos de unión apical reactivos con faloidina que miran hacia afuera (apical hacia afuera) (i) y expresión de HTI-56 en la membrana apical (j). Barras de escala = 10 μm. k, Inmunofluorescencia de microscopía confocal representativa de organoide basal humano apical después de 10 días en suspensión que expresa el receptor ACE2 del SARS-CoV-2 (verde), cilios (AcTUB, rojo) y DAPI (azul). Barra de escala = 20 μm.

Estrategias de puertas. a, EPCAM+Lysotracker+ estrategia de activación para purificar células AT2. La pureza se confirmó con 100/100 células clasificadas que se tiñeron positivamente para la proteína SFTPC (correspondiente a los datos extendidos, Fig. 4a). b, EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi/estrategia de activación negativa. La pureza se confirmó con 100/100 células clasificadas agrupadas que se tiñeron positivamente para la proteína KRT5 (correspondiente a la Fig. 2j-k). c, estrategia de activación para analizar las células KRT5+ y las poblaciones TNFRSF12A+ correspondientes dentro de las células recién disociadas de los pulmones humanos distales (correspondientes a los datos extendidos, Fig. 8d). d, correlación de RT-PCR de TNFRSF12A y otros ARNm de células clasificadas por FACS en fracciones neg, med y hi de TNFRSF12A (Fig. 3d). e, Estrategia de activación para estimar la infectividad de H1N1 PR8 GFP en organoides de pulmón humano (correspondiente a Datos extendidos Fig. 9a).

Datos demográficos clínicos de 136 donantes de tejido pulmonar utilizados en este estudio. Cada fila corresponde a individuos únicos de los que se obtuvo un pulmón normal y las columnas corresponden a características como la edad, el sexo y la ubicación anatómica del pulmón.

Genes utilizados para el análisis SPADE. Los genes se utilizaron en SPADE en función de la anotación de agrupamiento basada en gráficos de células del análisis scRNA-seq de tres individuos. Los detalles completos de SPADE se proporcionan en Métodos complementarios.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de los principales genes expresados ​​​​diferencialmente de poblaciones de scRNA-seq. Las poblaciones corresponden a Basal 1, Basal 2, Basal 1.1, Basal 1.2 y Grupo 1 de conjuntos de datos purificados AT2 scRNA-seq. Los principales genes expresados ​​diferencialmente para cada población se enumeran en cada pestaña. Negrita = genes utilizados para el análisis GSEA (prueba de sobrerrepresentación de Panther, con corrección de Bonferroni, los valores de p son de dos colas).

Lista de genes de proteínas de membrana Basal 1. Los genes se identificaron mediante análisis ontológico de los genes Basal 1 expresados ​​diferencialmente superiores con el término GO 0031224, (componente intrínseco de la membrana).

Análisis de la infección por SARS-CoV-2 en cultivos de organoides pulmonares. Las células infectadas positivamente se cuantificaron mediante tinción con dsRNA y SARS-CoV-2 NP entre células basales KRT5+, células club SCGB1A1+ y células ciliadas AcTUB+ mediante microscopía confocal. Se realizaron análisis estadísticos (chi-cuadrado o prueba exacta de Fisher) como se indica.

Secuenciación de próxima generación de cinco cultivos de organoides de pulmón distal. Resumen y anotaciones de variantes no sinónimas con frecuencia de alelos > 0,10 para 130 genes de cáncer utilizando el Sistema de perfilado de tumores TOMA (TOMA, Foster City, CA).

Tablas de reactivos. Tablas individuales de componentes de medios organoides, reactivos de microscopía de inmunotinción y fluorescencia, reactivos de RT-PCR, cebadores de RT-PCR y sondas de hibridación de ARN utilizadas en este estudio.

Guía para el análisis de scRNA-seq de organoides de pulmón. Análisis scRNA-seq para pulmones 1, 2, 3 y organoides AT2 purificados proporcionados en formato .rmd y .html.

Secuenciación del cultivo de organoides de pulmón. Los datos de secuenciación de próxima generación para cada uno de los cinco cultivos de organoides de pulmón distal (Sistema de perfilado de tumores TOMA) se proporcionan en formato de llamada variante.

Los organoides basales diferenciados tienen cilios funcionales, Parte 1. Video de microscopía confocal de transmisión de cilios latiendo (aumento de 25X).

Los organoides basales diferenciados tienen cilios funcionales, Parte 2. Video de microscopía de campo brillante de cilios latiendo (ampliación 10x).

Los organoides basales diferenciados apicales tienen cilios funcionales. DIC y video de microscopía confocal 3D de cilios móviles en organoides basales apicales en cultivo en suspensión los días 5 y 14.

Reimpresiones y permisos

Salahudeen, AA, Choi, SS, Rustagi, A. et al. Identificación de progenitores e infección por SARS-CoV-2 en organoides de pulmón distal humano. Naturaleza 588, 670–675 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

Descargar cita

Recibido: 08 noviembre 2017

Aceptado: 18 de noviembre de 2020

Publicado: 25 noviembre 2020

Fecha de emisión: 24 de diciembre de 2020

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Investigación y terapia con células madre (2023)

Biología celular de la naturaleza (2023)

npj Medicina Regenerativa (2023)

Comunicaciones de la naturaleza (2023)

Protocolos de la naturaleza (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.