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Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7959 (2023) Citar este artículo

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Los métodos actuales para evaluar la proliferación celular en andamios 3D se basan en cambios en la actividad metabólica o el ADN total; sin embargo, la cuantificación directa del número de células en andamios 3D sigue siendo un desafío. Para abordar este problema, desarrollamos un enfoque de estereología imparcial que utiliza muestreo aleatorio sistemático y seccionamiento óptico de plano focal delgado de los andamios seguido de la estimación del número total de células (StereoCount). Este enfoque se validó frente a un método indirecto para medir el ADN total (contenido de ADN); y la cámara de recuento de Bürker, el método de referencia actual para cuantificar el número de células. Evaluamos el número total de células para la densidad de siembra celular (células por unidad de volumen) en cuatro valores y comparamos los métodos en términos de precisión, facilidad de uso y demanda de tiempo. La precisión de StereoCount superó notablemente el contenido de ADN en casos con ~ 10 000 y ~ 125 000 células/andamio. Para los casos con ~ 250 000 y ~ 375 000 células/armazón, tanto StereoCount como el contenido de ADN mostraron una menor precisión que el Bürker, pero no difirieron entre sí. En términos de facilidad de uso, StereoCount supuso una gran ventaja debido a la salida en términos de números absolutos de celdas junto con la posibilidad de obtener una descripción general de la distribución de celdas y el uso futuro de la automatización para análisis de alto rendimiento. En conjunto, el método StereoCount es un enfoque eficiente para la cuantificación celular directa en andamios de colágeno 3D. Su principal beneficio es que StereoCount automatizado podría acelerar la investigación utilizando andamios 3D centrados en el descubrimiento de fármacos para una amplia variedad de enfermedades humanas.

La cuantificación del número de células en un volumen definido es una métrica esencial para las comunidades mundiales de biocientíficos e investigadores preclínicos. En disciplinas que involucran la dispersión de células en volúmenes 3D, por ejemplo, andamios de colágeno 3D, se requieren estimaciones confiables de células para el lanzamiento de experimentos, es decir, la siembra de células y la evaluación de la proliferación y muerte celular a lo largo del tiempo. La enumeración del número de células en estos casos se limita a dos enfoques principales: la cámara de Bürker para recuentos celulares directos a partir de suspensiones celulares homogéneas (fase líquida); y enfoques basados en fluorescencia para la estimación del ADN total, por ejemplo, CyQuant®1,2. Los inconvenientes del enfoque de ADN total son la lisis celular del preprocesamiento de la muestra, como la digestión del andamio por colagenasa, y la necesidad de una curva de calibración para cada experimento para garantizar la lectura correcta y las correlaciones entre la linealidad de la intensidad de la señal y el número de células. Por lo tanto, no existe un método cuantitativo directo para la estimación de recuentos de células en andamios 3D.

Para abordar este problema, presentamos StereoCount™, un método novedoso basado en estereología para la cuantificación directa de recuentos absolutos de células en andamios de colágeno 3D (Fig. 1).

Andamio de colágeno 3D sembrado con células y utilizado para la cuantificación de recuentos de células.

Demostramos el enfoque usando microscopía de fluorescencia seguida de un corte óptico y análisis de imágenes, como se detalla en Materiales y Métodos y en la Fig. 2. En segundo lugar, para evitar el sesgo introducido por el conteo manual y mejorar el rendimiento, presentamos un flujo de trabajo automatizado usando FIJI-ImageJ3 que utiliza dos secuencias de comandos macro y un paso intermedio basado en aprendizaje automático superficial (NL). Entre los beneficios se encuentran que el método no requiere la digestión del andamio o el seccionamiento con micrótomos y, como un enfoque basado en el microscopio, proporciona una descripción general de la distribución celular en el andamio como información adicional. Aquí comparamos y contrastamos StereoCount con el método de contenido de ADN basado en la detección de fluorescencia del ADN total; y recuentos de células utilizando el método de cámara de recuento (Bürker), un método generalmente fiable para la cuantificación de células.

Procedimiento de muestreo StereoCount durante la microscopía. Los andamios de colágeno tridimensionales (3D) se muestrean en 9 campos visuales XY y 30 pilas Z. El recuento de células se determina para cada columna utilizando un escaneo óptico de plano focal delgado (método disector óptico). El recuento de células de las columnas se vuelve a calcular para el volumen total del andamio de colágeno.

Con fines de validación, comparamos la precisión, la facilidad de uso, los requisitos de equipo y las demandas de tiempo para la preparación de muestras de los recuentos de células para la densidad de siembra de células (células por unidad de volumen) en cuatro valores estimados por los tres métodos: StereoCount, DNA contenido y Bürker (estándar de referencia). La precisión de los métodos se evalúa mediante estos indicadores (Fig. 3): (i) sesgo (subestimación o sobreestimación sistemáticas de los números de celdas en relación con la media del método de Bürker), (ii) dispersión de las estimaciones (desviación absoluta/cuadrada de la estimación media del método dado, en otras palabras, cómo los datos están juntos) y (iii) precisión general (desviación absoluta/cuadrada del valor teórico [es decir, la estimación media del método de Bürker], en otras palabras, el sesgo y la dispersión tomados en cuenta mutuamente).

Indicadores de la precisión de los métodos. Estos incluyen sesgo (subestimación o sobreestimación sistemática de los recuentos de células en relación con la media del método de Bürker), indicadores que reflejan la dispersión alrededor de la media (desviación absoluta/cuadrada de la estimación media de un método dado) y, finalmente, indicadores de precisión general (desviación absoluta/cuadrada del valor teórico [tv]) reflejando tanto el sesgo como la dispersión (a). Tanto la alta dispersión como el sesgo disminuyen colectivamente la precisión de los métodos (b).

El método de Bürker evaluó el recuento total de células en las suspensiones de células antes de la infusión en los andamios de colágeno 3D. Se dispersaron cuatro concentraciones de suspensiones celulares (10 000; 125 000; 250 000 y 375 000 células) en los andamios 3D. Se utilizaron dos métodos (StereoCount y contenido de ADN) para estimar el número total de células un día después de la siembra de células de distintos andamios.

La precisión de StereoCount y el contenido de ADN en los andamios de colágeno 3D se compararon con los recuentos en las suspensiones celulares mediante el método de Bürker (Tabla complementaria S1). Las comparaciones se realizaron utilizando el método de mínimos cuadrados generalizados (GLS) como se muestra en la figura 4 y la tabla 1. Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Números determinados de celdas en andamios 3D con la densidad de siembra de celdas en cuatro valores (a) 10 000, (b) 125 000, (c) 250 000 y (d) 375 000 celdas/andamio (parte superior) y desviación del valor teórico (tv, definido como media del método de Bürker; mostrado en línea discontinua roja), ambos mostrados en miles de celdas. La línea horizontal negra muestra la media.

Los valores de referencia se basaron en estimaciones medias del método de Bürker. Los recuentos de Bürker fueron de 13 450 ± 2477 células (media ± DE) para la concentración de 10 000 células/andamio (Fig. 4a, Tabla 1a). La estimación por StereoCount no mostró diferencias con Bürker en términos de precisión o dispersión (variación) de las estimaciones. Por el contrario, el método de contenido de ADN carecía de sensibilidad para la estimación en esta baja densidad celular.

Para los andamios infundidos con aproximadamente 125 000 células, Bürker estimó 125 400 ± 18 536 células (Fig. 4b, Tabla 1b) y ni StereoCount ni el contenido de ADN mostraron diferencias con Bürker. Sin embargo, el método StereoCount coincidió estrechamente con el método de referencia (Bürker) en términos de precisión y dispersión generales. Por el contrario, el contenido de ADN mostró una diferencia estadísticamente mayor de ~ 30 400 células (IC del 95 % [20 200; 40 700], p < 0,001) de la estimación media del método de referencia en comparación con StereoCount y una desviación mayor del valor teórico en 32 200 células ( IC [24.300; 40.100], p = 0,001). Curiosamente, los resultados de StereoCount mostraron una dispersión incluso menor que la de Bürker (método de referencia), ya que la desviación de la media fue menor en 7200 celdas (IC [1700; 12600], p = 0,021), es decir, más cerca del número inicial de celdas sembradas ( 125.000 celdas/andamio).

Para los andamios de 250 000 celdas, Bürker estimó 253 200 ± 6197 celdas (Fig. 4c, Tabla 1c). Los métodos de contenido de ADN y StereoCount mostraron diferencias con respecto a estos valores de referencia en términos de precisión general y dispersión. Específicamente, la desviación de Bürker fue mayor para StereoCount en 31 600 células [IC 14 900; 48.300] y para contenido de ADN por 51.000 células [CI 32.200; 69,900]. Aunque solo el contenido de ADN subestimó el recuento de células en 38.000 células [CI -72.200; -3800], p = 0,044), la dispersión y la precisión general tanto de StereoCount como del contenido de ADN no fueron diferentes entre sí (p > 0,05).

Finalmente, para los recuentos de células de mayor densidad en los andamios (375 000 células), Bürker estimó 349 200 ± 37 542 células (Fig. 4d, Tabla 1d). Tanto el contenido de StereoCount como el de ADN difieren de estos valores de referencia y no difieren entre sí en términos de precisión general. Sin embargo, el contenido de ADN tendió a producir una menor dispersión de las estimaciones que StereoCount: mientras que la desviación de la media fue mayor en StereoCount en 77 500 células [29 100; 125.800] en comparación con Bürker (p = 0,005), el contenido de ADN mostró una desviación de la media comparable a la de Bürker (la diferencia de 2300 células [-11.200; 15.700] p = 0,743). Aunque el contenido de ADN mostró sesgo (subestimación) de -86.000 células [IC -123.400; -49 100] (p = 0,003), el método tendió a una menor dispersión de las estimaciones que StereoCount (la desviación del contenido de ADN de la media fue menor en 79 800 células [32 200; 127 300] en comparación con StereoCount (p = 0,005). La Tabla complementaria S2 proporciona más resultados de los análisis de la desviación al cuadrado de la media y la desviación al cuadrado del valor teórico.

Además de la precisión en relación con el método de referencia, otros factores a considerar incluyen la facilidad de uso, los costos, los requisitos de equipo y las demandas de tiempo para cada método.

El contenido de ADN es un método basado en fluorescencia ampliamente utilizado que es rápido y fácil de realizar. Se necesita un lector de microplacas con detección de señal de fluorescencia. El enfoque se adapta bien al formato de múltiples pozos, mientras que más andamios requieren un tiempo de procesamiento similar al de la estimación de celdas para un solo andamio. Por ejemplo, el análisis de uno o diez andamios lleva unas tres horas (Fig. 5). Sin embargo, debido al requisito de la digestión de andamios, la información sobre la distribución celular se pierde y no es posible ningún procesamiento o análisis adicional. Otro inconveniente es que el resultado no es el recuento de células sino una unidad de fluorescencia relativa del ADN total por pocillo (Tabla 2) que requiere una curva estándar de referencia para convertir los valores de fluorescencia de la muestra en números de células.

Esquema de procesos de contenido de ADN (panel superior) y StereoCount (panel inferior) con demandas de tiempo de cada enfoque paso a paso. La duración del proceso no depende del tamaño de la muestra (azul). Duración del proceso de un análisis de andamiaje (naranja). Duración del proceso de diez análisis de andamios (verde). Duración del proceso cuando se utiliza la automatización (script) para el procesamiento de datos (amarillo). Las demandas de tiempo totales para una o diez muestras para cada método se dan en marcos rojos.

El nuevo enfoque StereoCount propuesto aquí se basa en principios de estereología imparciales para la estimación del número de células en andamios de colágeno 3D. Se requiere microscopio de fluorescencia para la adquisición de imágenes. Entre las ventajas de StereoCount están el enfoque (i) proporciona un recuento absoluto de células por andamio (Tabla 2); y (ii) no requiere digestión de andamios, por lo que conserva información sobre distribuciones celulares en 3D. En términos de tiempo, el análisis StereoCount de un andamio y diez andamios toma alrededor de 3 y 10 h, respectivamente. Se espera que la automatización reduzca el tiempo de procesamiento de datos a aproximadamente 10 minutos o menos dependiendo de las especificaciones de la computadora (Fig. 5). El script para el análisis de alto rendimiento se puede encontrar en la Macro complementaria S1.

Aquí revisamos varios métodos para evaluar la proliferación celular en andamios 3D. Una estrategia común para estimar la proliferación celular se basa en la conversión de varios sustratos por enzimas celulares en productos altamente fluorescentes, por ejemplo, MTT4,5, WST-16, WST-8/CCK-8, CCK-87 y ensayo AlamarBlue8. Dado que estos métodos dependen de la actividad de las enzimas mitocondriales, los resultados reflejan la actividad metabólica de las células, en lugar del recuento de células individuales per se. Además, este proceso pierde sensibilidad a medida que cambia la actividad metabólica, como en el caso de células senescentes o de crecimiento lento9.

Los métodos basados en el marcado del contenido de ADN, por ejemplo, CyQuant1,2, son independientes de la actividad metabólica de las células. Sin embargo, estos enfoques solo estiman la unidad de fluorescencia relativa, que requiere curvas estándar de ADN para la conversión al contenido de ADN por célula, es decir, una curva estándar generada a partir del contenido de ADN para un número conocido de células sembradas en una placa. Otra complicación es que, en comparación con los cultivos 2D habituales, la estimación en andamios 3D requiere la digestión con hidrogel de colágeno antes de la detección de una señal fluorescente del ADN celular marcado. Aunque esta estrategia es común, el enfoque solo proporciona información sobre la cantidad de ADN presente y no proporciona información sobre el recuento absoluto de células o la distribución de células en los andamios 3D.

Para abordar esta necesidad, desarrollamos una nueva estrategia basada en la estereología, StereoCount, para cuantificar el número de células en un andamio 3D, sin necesidad de digestión o curvas de calibración para cada experimento. Evaluamos StereoCount en comparación con un método actual y de uso común, el contenido de ADN, utilizando la cámara de recuento (Bürker) como método de referencia. Finalmente, como una extensión, desarrollamos un flujo de trabajo automatizado (tubería) para evitar la introducción de errores de subjetividad del conteo manual. La eficiencia del flujo de trabajo automatizado podría mejorarse potencialmente al cambiar los scripts de macro y automatizarse aún más al combinar todos los pasos en una macro o cambiar a diferentes plataformas para cada paso. Nuestro flujo de trabajo fácil de aplicar brinda resultados confiables con el mismo error aplicado a cada imagen, evitando el error entre evaluadores causado por diferentes investigadores que realizan cada tarea de manera manual.

Nuestros datos muestran que para cantidades bajas de células (10 000 células/andamio), el contenido de ADN no se puede utilizar debido a que la señal de fluorescencia de fondo supera la señal del ADN teñido con fluorescencia. Por lo tanto, para densidades celulares bajas, StereoCount es la opción preferida, ya que el enfoque se basa en el recuento simple de células en una fracción conocida del volumen total. Para números de células más altos (125 000 y 250 000 células/andamio), tanto StereoCount como el contenido de ADN proporcionan resultados útiles, aunque StereoCount refleja más fielmente el número de carga de células utilizando el método de Bürker de referencia. Para densidades celulares más altas (250 000 células/andamio y más) tanto el contenido de ADN como StereoCount son igualmente efectivos. La limitación de StereoCount es el tiempo adicional y el cuidado necesarios para evitar la superposición de celdas a medida que aumenta la densidad de celdas. La falta de atención a este problema podría conducir a un error sistemático (sesgo) que favorece los recuentos insuficientes a medida que aumenta la densidad celular. De manera similar, nuestros resultados muestran una subestimación de los recuentos de células por contenido de ADN como una función directa del aumento de la densidad celular, lo que sugiere que también puede ser necesaria una corrección de sesgo para este enfoque. La diferencia es que para StereoCount estos recuentos insuficientes pueden evitarse prestando especial atención a la alta densidad celular, mientras que esta estrategia no está disponible para el método de contenido de ADN.

Finalmente, consideramos la viabilidad, el material, los requisitos de la máquina y las demandas de tiempo de los métodos de contenido de ADN y StereoCount. Una gran ventaja del contenido de ADN es la opción de formato de pocillos múltiples que es un método que requiere menos tiempo en comparación con StereoCount, aunque el procesamiento de datos (especialmente el análisis de muestras múltiples) se acorta sustancialmente mediante el uso de un flujo de trabajo automatizado para StereoCount. Sin embargo, el análisis más rápido de los datos del contenido de ADN se ve compensado por la necesidad de construir una curva de calibración para estimar el recuento de células a partir de unidades fluorescentes relativas para cada experimento. La mayor ventaja de StereoCount es la capacidad de realizar recuentos celulares directos y la visualización de la distribución celular en 3D utilizando imágenes microscópicas simples, sin necesidad de digestión en andamios o cortes con micrótomos. Aunque el enfoque StereoCount se ilustra aquí usando células teñidas con fluorescencia, el mismo enfoque es aplicable para diferenciar entre células vivas y muertas cuando se combina la tinción DAPI y Calcein-AM, así como enfoques que usan tinción inmunohistoquímica de células en los andamios 3D.

Aunque los andamios de hidrogel son hoy en día un tipo ordinario de cultivo celular 3D, sigue existiendo una gran y creciente necesidad de herramientas cuantitativas para evaluar la proliferación celular y otros parámetros después de diferentes manipulaciones experimentales. Nuestro novedoso enfoque de software gratuito basado en estereología, StereoCount, utiliza el corte óptico de células teñidas en hidrogeles de colágeno no digeridos con un rendimiento más rápido mediante el flujo de trabajo automatizado proporcionado. Informamos que StereoCount es más adecuado para densidades celulares más bajas (~ 10 000 y ~ 125 000 células/andamio), donde el método de contenido de ADN carecía de la sensibilidad para estimar una densidad celular tan baja, mientras que el contenido de ADN por el método indirecto basado en fluorescencia puede ser preferible para una mayor densidad celular (~ 250.000 y ~ 375.000 células/andamio).

Se aislaron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) de la piel luego de intervenciones de cirugía plástica después de la aprobación del comité de ética local del Hospital Universitario de Pilsen, E. Benese 13, 305 99 Pilsen, República Checa, decisión del 5 de noviembre de 2015. Las pautas en la Declaración de Helsinki fueron seguidos. Todos los donantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención. Las muestras se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) que contenía penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (0,1 mg/ml) (Biochrom, Cambridge, Reino Unido) y gentamicina (50 μg/ml). ) (Biocromo). Las muestras se cortaron y digirieron durante la noche a 37 °C en HBSS que contenía colagenasa tipo I (100 U/ml, Merck KGaA). Al día siguiente, la suspensión se agitó intensamente y se filtró a través de un filtro celular de nailon de 100 µm (Falcon™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). A continuación, la suspensión celular se transfirió a un matraz de cultivo (TPP) que contenía medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa (DMEM) (Merck KGaA), suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10 % (Merck KGaA), penicilina (100 U/ml). )/estreptomicina (0,1 mg/ml) (Biochrom), L-glutamina al 0,5 % (Biosera, Nuaille, Francia) y aminoácidos no esenciales al 1,0 % (Biosera). Los NHDF se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2 hasta un 80 % de confluencia y luego se pasaron. Solo se utilizaron en los experimentos aquellos NHDF de los pasajes 2 al 5.

El colágeno tipo I utilizado para preparar el andamiaje de colágeno 3D se aisló de colas de rata. La recolección de colas de rata para el aislamiento de colágeno fue aprobada por el Comité Asesor de Bienestar Animal del Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa (aprobación ID MSMT-249/2017-2) y se llevó a cabo bajo la supervisión del Asesor de Bienestar Animal. Comité de la Facultad de Medicina de la Universidad Charles en Pilsen siguiendo los estándares tecnológicos, higiénicos, de bienestar y éticos dados por la Directiva 2010/63/UE y las Directrices y Recomendaciones de FELASA (la acreditación laboral número 4891/2015-MZE-17214). La cepa de ratas era Wistar, el género era macho y la edad era de 6 a 7 meses. Las ratas se utilizaron en otro estudio independiente sin ningún efecto sobre las colas. Por lo tanto, las colas se recolectaron después del sacrificio de animales aprobado por el protocolo anterior (aprobación ID MSMT-249/2017-2). El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE. Los tendones se extrajeron de las colas de rata y se mantuvieron 3 × 24 h en PBS en un agitador de laboratorio a temperatura ambiente. PBS se intercambió todos los días. Posteriormente se repitió el procedimiento con tampón citrato (0,08 M, pH 3,7). Posteriormente, los tendones fueron digeridos en ácido acético 0,1 M durante 48 h a 4 °C. El colágeno digerido en ácido acético se homogeneizó con una licuadora y la suspensión se ultracentrifugó a la máxima velocidad (aprox. 46.000 × g) durante 1 h para eliminar los restos de tejido. El sobrenadante que contenía el colágeno tipo I se liofilizó y almacenó a -20 °C. La solución de colágeno para la preparación del andamio de colágeno 3D se preparó disolviendo el colágeno liofilizado en ácido acético 0,02 M a 4 °C durante al menos 5 días hasta una concentración de 5 mg/ml y se almacenó a 4 °C como solución madre para máximo 1 mes.

Se prepararon andamios de colágeno 3D que contenían células de la siguiente manera. Se mezclaron adecuadamente 600 µl de solución madre de colágeno (5 mg/ml) con 290 µl de medio de cultivo, 10 µl de bicarbonato de sodio (Merck KGaA) y 100 µl de suspensión celular en medio sobre hielo. Se sembraron 0,5 ml de suspensión de colágeno con células en la placa de 24 pocillos. La concentración final de colágeno fue de 3 mg/ml y el recuento final de células sembradas fue de 10.000; 125.000; 250.000 y 375.000 células por 0,5 ml. Se sembraron 0,5 ml de suspensión de colágeno con células homogéneamente distribuidas en la placa de 24 pocillos. La polimerización ocurrió a 37 °C, 5% CO2 y atmósfera humidificada después de 20 min. El cambio de pH de ácido a neutro y 37 °C hizo que el colágeno se polimerizara y se autoensamblara en un gel. Después de la polimerización del colágeno, se añadieron cuidadosamente 0,5 ml de medio de cultivo encima de los hidrogeles. El medio de cultivo se cambió 2-3 veces por semana.

El día después de su preparación, se fijaron los andamios de colágeno sembrados con células (N = 25 para 10 000 células/andamio; N = 19 para 125 000 células/andamio; N = 17 para 250 000 células/andamio; N = 7 para 375 000 células/andamio). con paraformaldehído al 4% (Merck KGaA) durante 30 min. Después de lavar con PBS, los armazones de colágeno se mantuvieron en Triton X-100 al 0,2 % (Merck KGaA) durante 30 min, seguidos de 30 min en BSA al 5 % (Merck KGaA). Los núcleos de NHDF en andamios de colágeno se tiñeron con DAPI (1:1000) durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente. El proceso de seccionamiento óptico de andamios de colágeno sembrados con células fue el siguiente. Nueve columnas del eje Z se ubicaron a través de los ejes XYZ de cada andamio de colágeno (Fig. 2). Las columnas incluían 30 pilas Z separadas con una distancia de 0,02 mm entre cada pila dando un volumen total de cada columna de 1,4 mm3 = 1,4 μl. Así, el volumen total de las 9 columnas fue de 12,6 mm3. El coeficiente medio de varianza (CV) para el muestreo de 9 columnas estuvo en el rango de 9 a 20 % y es comparable con el CV del contenido de ADN y los métodos de Bürker (Tabla complementaria S1) y con otros estudios10,11. Se tomaron imágenes 2D de cada sección con el objetivo Olympus UPlanFL N 10x/0.30 y las imágenes de las columnas se guardaron como secuencia de imágenes (archivo *.stk) con el software VisiView®. El número de células se volvió a calcular para el volumen total del andamiaje de colágeno.

El número de células se contó dentro de las columnas usando el software FIJI-ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, EE. UU.) y el número de células en el volumen total de un andamio de colágeno se estimó de cada columna usando el principio del disector óptico12. Se pueden encontrar más detalles sobre el esquema en la figura complementaria S1.

Después de la adquisición, primero procesamos por lotes las imágenes para que sea más fácil trabajar con ellas. La primera macro corta provista (Macro Suplementaria S1) convierte automáticamente las imágenes adquiridas en imágenes de 8 bits y proyección Z de máxima intensidad (Fig. 6a). El siguiente paso intermedio requiere una entrada significativa del usuario al principio (Fig. 6b). Aquí usamos un complemento LABKIT13 en FIJI que utiliza un enfoque de aprendizaje automático superficial para segmentar imágenes, basado en el entrenamiento. Para generar un conjunto de datos de entrenamiento, concatenamos seis imágenes de muestra (preprocesadas con el paso A del flujo de trabajo) de diferente densidad de siembra celular. Posteriormente se aplicó un entrenamiento inducido por el usuario para generar un clasificador. Este clasificador se usó para procesar por lotes todas las imágenes preprocesadas del paso A y generar segmentaciones. Estas segmentaciones luego se analizaron en el paso C (Fig. 6c) del flujo de trabajo. Aplicamos una macro corta adicional (macro suplementaria S2) para analizar por lotes las máscaras e informar el recuento de objetos detectados por imagen. Aplicamos las macros para uso gratuito sin ninguna garantía y mantenimiento.

Esquema de un flujo de trabajo automatizado que consta de dos secuencias de comandos macro (a, c) y un paso intermedio (b), basado en aprendizaje automático superficial.

El volumen del andamio de colágeno se estimó según el principio de Arquímedes. El cilindro de medición de 5 ml con líneas marcadas de 0,1 ml se llenó con 3 ml precisos de PBS. Cada armazón de colágeno se puso en el cilindro con PBS y se leyó el volumen de PBS en la escala del cilindro. El aumento de volumen en el cilindro correspondió al volumen del andamio de colágeno.

El recuento de células en las secuencias de imágenes adquiridas (columna XYZ) se volvió a calcular para el andamio de colágeno sembrado con células completas, es decir, para la estimación del número de células en un andamio de colágeno, el recuento de células de 9 secuencias de imágenes (es decir, 9 columnas) se volvió a calcular para el colágeno total. volumen del andamio. Este cálculo se realizó a partir de las 9 columnas y se consideró como resultado la media de los valores (recuento total de células) para un andamio de colágeno.

Las placas de cultivo sembradas con NHDF se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de cultivo fresco. Una porción de la suspensión se diluyó con azul tripán (Merck KGaA) para la estimación del conteo de células (cinco repeticiones). La estimación media del número de células sirvió como recuento inicial de células para diluciones posteriores.

A partir de las suspensiones celulares iniciales se prepararon 5 × 0,5 ml (que contenían 10.000; 125.000; 250.000 y 375.000 células). A partir de estas suspensiones de 0,5 ml, la porción se diluyó con azul tripano y se estimó el número de células. Este conteo se realizó en 10 repeticiones por dos observadores independientes (N = 10 de cada densidad de siembra celular).

Los andamios de colágeno cargados con células (N = 4 para 10 000 células/andamio; N = 8 para 125 000 células/andamio; N = 9 para 250 000 células/andamio; N = 5 para 375 000 células/andamio) se prepararon de acuerdo con 5.3. Al día siguiente, los andamios se lavaron con PBS y se colocaron a -80 °C. El día del análisis, se descongelaron los andamios de colágeno.

En primer lugar, se añadió proteinasa K (0,2 mg/ml; 2,5 DMC-U/ml, Serva, Heidelberg, Alemania) en EDTA tamponado con fosfato (PBE) a andamios con células en una proporción de 1:1. A continuación, las muestras se incubaron durante 90 min a 50 °C. Posteriormente, el fluido de la muestra digerida se homogeneizó mediante pipeteo y agitación vorticial. Se transfirieron 462 µl del fluido de la muestra (la mitad del volumen de la muestra) a un tubo nuevo y 17,6 µl de ARNasa A (1 mg/ml, Serva), 1 µl de EDTA (0,5 M, Thermo Fisher Scientific) y 20 µl de NaCl - Se añadió solución tampón Tris-EDTA (TE) (10,5 mg de NaCl por muestra diluida en tampón TE 50 ×) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. El líquido de muestra procesado con ARNasa se transfirió a una placa negra de 96 pocillos (100 µl/pocillo) y se añadieron 50 µl de solución CyQuant (Thermo Fisher Scientific) en tampón TE (concentración final de tampón TE 1 ×, CyQuant: tampón TE 1:200 ). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente, se protegieron de la luz durante 10 minutos y se agitaron ocasionalmente. La señal de fluorescencia se midió con un lector de microplacas (Synergy HT, Biotek, Winooski, Vermont) a 520 nm/480 nm y se correlacionó con el patrón de ADN preparado según el folleto de fabricación de CyQuant.

El contenido de ADN en los andamios de colágeno sembrados con células se volvió a calcular en el número de células de acuerdo con la curva de calibración del número de células realizada a partir de las células sembradas normalmente en una placa.

Los datos se analizaron utilizando el software estadístico R14. Se utilizaron los paquetes R 'beeswarm'15 y 'vioplot'16 para la visualización de datos.

Las precisiones se compararon utilizando: (i) el sesgo de los valores teóricos, que indica cuánto difieren las estimaciones promedio de los estimadores de contenido de ADN y StereoCount del método de referencia de Bürker. A continuación, utilizamos dos medidas que reflejan la dispersión, ignorando el posible sesgo y, por lo tanto, permitiendo una comparación significativa de Bürker frente a otros métodos. Estos son (ii) la desviación de la media [específica del grupo] y (iii) la desviación al cuadrado de la media. Finalmente, otras dos medidas indican la precisión general de los métodos y reflejan tanto el sesgo como la dispersión: (iv) desviación del valor teórico y (v) desviación al cuadrado del valor teórico (Fig. 3).

Todas estas cinco medidas de precisión se compararon originalmente usando mínimos cuadrados generalizados (GLS), con una función de varianza que permite la varianza específica del estimador, usando el paquete 'nlme'17. Como los modelos de desviaciones al cuadrado exhibieron una distribución no normal de los residuos estandarizados (comprobados visualmente usando histogramas y gráficos QQ y mediante la prueba de Shapiro-Wilk), se volvieron a analizar usando modelos lineales generalizados con distribución Gamma y log-link (Gamma GLM).

En cada modelo, una de las cinco medidas antes mencionadas representaba el resultado (variable de respuesta), mientras que el tipo de método representaba un predictor (variable explicativa). El valor P (bilateral) se basó en la prueba t permutacional (sesgo y desviaciones absolutas) o Gamma GLM permutacional (desviaciones al cuadrado), de acuerdo con el guión mostrado anteriormente18 usando 5000 aleatorizaciones de Monte-Carlo. Se eligió el enfoque de permutación porque estima las significaciones estadísticas de forma fiable incluso si los tamaños de muestra son pequeños y no se cumplen los supuestos de los métodos completamente paramétricos (incluida la distribución normal de los residuos)19. Los valores P no se corrigieron para las comparaciones múltiples porque nos concentramos particularmente en la comparación única (StereoCount frente al contenido de ADN) y los intervalos de confianza del 95 % para el tamaño del efecto se derivaron de los modelos GLS y Gamma GLM.

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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