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Oct 27, 2023

Doble bloqueo de ambos PD

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2472 (2023) Citar este artículo

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El cáncer colorrectal es un mal inmunogénico. Dicha propiedad se puede revertir mediante el uso de ICD. Sin embargo, los inductores de ICD también pueden inducir la expresión de los receptores de punto de control inhibidores CD47 y PD-L1 en las células tumorales, lo que hace que los tumores CRC sean resistentes principalmente a la destrucción de células T CD8 y a la fagocitosis mediada por macrófagos. En este estudio, examinamos el efecto terapéutico del régimen de oxaliplatino y FOLFOX en combinación con anticuerpos bloqueadores contra CD47 y PD-L1. El tratamiento con FOLFOX y oxaliplatino conduce a un aumento en la expresión de CD47 y PD-L1 en células CT-26 in vitro e in vivo. La combinación de anticuerpos bloqueadores contra CD47 y PD-L1 con FOLFOX conduce a un aumento significativo en la supervivencia y una disminución en el tamaño del tumor. Este régimen de combinación triple también conduce a una disminución significativa en Treg y MDSC y un aumento significativo en linfocitos CD8 + INF-γ + y proporción de macrófagos M1/M2 en el microambiente tumoral. Nuestro estudio mostró que la terapia de combinación triple con FOLFOX, CD47 y PD-L1 es un régimen de tratamiento efectivo en el modelo de tumor de ratones CT-26 y puede considerarse como un potencial para traducir a la clínica.

A pesar de años de investigación avanzada, el cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo uno de los tipos de tumores sólidos más comunes y agresivos. Como tratamiento de primera línea en el CCR avanzado, FOLFOX (5-fluorouracilo más oxaliplatino) se usa de forma rutinaria como régimen de quimioterapia combinada. Sin embargo, la farmacorresistencia adquirida limita su efecto antitumoral; por lo tanto, los regímenes de quimioterapia no se administran con fines curativos1,2.

Aunque el bloqueo del eje de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1)/ligando de muerte programada 1 (PDL-1) condujo a un cambio de paradigma en la inmunoterapia contra el cáncer y mostró un gran potencial en el tratamiento del cáncer, no se puede generalizar a todos los tipos de cánceres3,4. Estudios recientes enfatizan la importancia de la contextura inmune del microambiente tumoral en la respuesta heterogénea al bloqueo del punto de control inmunitario (ICB)5. El CCR, especialmente los tumores estables a microsatélites (MSS), es uno de los que tienen una respuesta deficiente a la terapia de punto de control debido a su baja inmunogenicidad y al bajo infiltrado de células T CD8+ en el tumor4,6,7. Los pacientes con CCR con microsatélite inestable (MSI) mostraron una mayor cantidad de células T CD8+ infiltradas en el tumor preexistente y una mejor respuesta a la terapia anti-PD-17,8.

Una forma de mejorar la escasa inmunogenicidad de los tumores y la infiltración de células T CD8+ es utilizar un inductor de muerte celular inmunológica (DCI) como agente quimioterapéutico1,9,10. Se demostró que el régimen FOLFOX y el oxaliplatino inducen el DAI de manera eficaz, aunque aumentan la expresión de los receptores de puntos de control tanto en las células tumorales como en los linfocitos1,11. Entre los receptores de punto de control, PD-L1 y CD47 se sobreexpresan después del tratamiento con FOLFOX y oxaliplatino en pacientes1.

La regulación positiva de CD47, un mecanismo por el cual las células cancerosas aumentan su "personalidad", juega un papel importante en la inhibición de la fagocitosis de las células tumorales por macrófagos y células dendríticas (DC). Además, un aumento en su expresión conduce al bloqueo de la presentación cruzada por DCs12,13. Se observa una mayor expresión de CD47 en amplios tipos de cánceres asociados con un pronóstico más bajo y un aumento de la mortalidad. El bloqueo de CD47/proteína reguladora de la señal α (SIRPα) es una nueva era emergente en la inmunoterapia contra el cáncer14. Varios estudios de ensayos clínicos investigan el beneficio clínico de este receptor de punto de control inmunitario innato, con algunos ensayos de fase I publicados15,16. Sin embargo, se espera que las monoterapias que bloquean CD47/SIPR-α no actúen como tratamiento curativo, y la combinación de la terapia de BCI innatos con adaptativos y quimioterapias está en el centro de atención14,17,18,19.

En el estudio actual, buscamos investigar el potencial de la terapia combinada usando oxaliplatino (OXP) como un inductor efectivo de ICD y liberando patrones moleculares asociados al daño (DAMP) que actúan como una vacuna intrínseca con anti-CD47 y anti-PD- L1. Presumimos que al proporcionar una señal de "cómeme" y bloquear la señal de "no me comas", a través del inductor ICD y el bloqueo de CD47 respectivamente, las CD y los macrófagos fagocitarían las células tumorales e inducirían una respuesta inmune. En el brazo efector de las células T CD8+, el bloqueo de PD-L1 mejora su función efectora y destruye las células tumorales. Utilizando el modelo de ratón CT-26, examinamos más a fondo la sustitución de oxaliplatino por FOLFOX en nuestra terapia de combinación diseñada para evaluar la fuente de sinergia potencial. Nuestros datos revelaron que en ratones con tumores CT-26, FOLFOX en una combinación de anti-CD47 y anti-PD-L1 dio como resultado un aumento significativo en la supervivencia y una reducción en el tamaño del tumor.

Para evaluar si el régimen OXP y FOLFOX afecta la expresión de CD47 y PD-L1 en células CT-26 in vitro, analizamos su expresión con el citómetro de flujo después del tratamiento con agentes quimioterapéuticos. Seis horas después del tratamiento de las células con OXP o FOLFOX en el medio de cultivo celular, se extrajeron las células de los pocillos y se analizaron con un citómetro de flujo. Tanto el régimen OXP como el FOLFOX aumentan la expresión de CD47 y PD-L1 en la superficie celular CT-26 (Fig. 1A-F). FOLFOX incluso aumenta la expresión de CD47 y PD-L1 más que OXP (P < 0,0001).

FOLFOX y OXP aumentaron la expresión de CD 47 y PD-L1 en la superficie celular de las líneas celulares CT-26. (A–D) Estrategias de activación para el análisis de la expresión de la superficie celular de CD47 y PD-L1 en la línea de células tumorales CT-26 después del tratamiento con OXP y FOLFOX. (E) Las células tumorales CT-26 se trataron con OXP o FOLFOX y la expresión de CD47 se analizó mediante citometría de flujo. (F) las células tumorales se trataron con OXP o FOLFOX y la expresión de PD-L1 se analizó mediante citometría de flujo.

A continuación, examinamos el efecto del régimen OXP y FOLFOX en la expresión de CD47 y PD-L1 Invivo (Fig. 2A-G). Ratones que portaban el tumor CT-26, tratados con OXP o FOLFOX, y 3 días después del tratamiento, los ratones se sacrificaron y se obtuvieron células individuales a partir de la masa del tumor. El régimen FOLFOX y OXP aumentaron significativamente la expresión de PD-L1 en células tumorales extraídas de ratones (P < 0,0001 y P = 0,048, respectivamente). además, como se muestra en la Fig. 2C, FOLFOX también aumenta la expresión de PD-L1 en comparación con OXP. La expresión de CD47 solo aumentó significativamente cuando los ratones fueron tratados con FOLFOX (P < 0,0001), pero OXP no logró aumentar significativamente la expresión de CD47.

Efecto de FOLFOX y OXP sobre la expresión en la superficie celular de CD47 y PD-L1 en tumores inoculados con CT-26. (A–E) Estrategias de activación para el análisis de la expresión de la superficie celular de CD47 y PD-L1 en el tumor CT-26 en ratones después del tratamiento con OXP y FOLFOX. (F) Las células tumorales CT-26 se trataron con OXP o FOLFOX y la expresión de CD47 se analizó mediante citometría de flujo. (G) Las células tumorales se trataron con OXP o FOLFOX y la expresión de PD-L1 se analizó mediante citometría de flujo.

A continuación, nuestro objetivo fue determinar si la terapia combinada con anti-CD47, anti-PD-L1 y agentes quimioterapéuticos inductores de muerte inmunológica (OXP o FOLFOX) podría generar una respuesta antitumoral en comparación con la quimioterapia o la terapia combinada con quimioterapia y bloqueadores de puntos de control. Cuando se estableció el modelo de tumores de ratones CT-26, cada grupo recibió los agentes terapéuticos correspondientes. el programa detallado para la inyección de agentes quimioterapéuticos y/o anti-CD47 y anti-PD-L1 se resume en la Fig. 3A. Para controlar los efectos secundarios y la posible toxicidad de nuestro régimen de combinación, se pesaron los ratones durante el estudio. No se observó una pérdida de peso significativa en ninguno de los grupos terapéuticos (Fig. 3B).

La combinación de FOLFOX, anti-CD47 y anti-PD-L1 mostró el mejor potencial en el modelo de tumor singénico CT-26. (A) Calendario detallado para la inyección de agentes terapéuticos. (B) Cambios en el peso corporal medio (g) de ratones portadores de tumores en grupos de control y diferentes tratados. (C) Supervivencia de los ratones en días, mostrándose la mediana de supervivencia. Las significaciones se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico (MantelCox); n = 5 ratones por grupo. (D) Se inyectó a ratones BALB/c portadores de tumor CT-26 el régimen terapéutico correspondiente de acuerdo con el programa indicado. El volumen del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados. (E-K) volumen tumoral de cada ratón en todos los grupos terapéuticos.

La combinación de anti-CD47 y anti-PD-L1 con el régimen OXP o FOLFOX condujo a un aumento significativo en la supervivencia de los ratones que recibieron tres regímenes combinados en comparación con las monoterapias con agentes quimioterapéuticos y el régimen bicombinado (anti-CD47 o anti-PD-L1 con OXP) (Fig. 3C). Estos datos también están respaldados por los datos de tiempo para alcanzar el punto final (TTE) y % de retraso en el crecimiento del tumor (TTG) en la Tabla 1. El análisis del tamaño del tumor también mostró que los ratones que recibieron anti-CD47, anti-PD-L1 y FOLFOX tenían el tumor más lento. tasa de crecimiento (Fig. 3D-K).

Para determinar los posibles factores que condujeron a una mejor respuesta terapéutica al régimen de combinación triple en ratones con tumor CT-26, examinamos el contenido de células T Treg y CD8+/INF-γ+ en el bazo y los ganglios linfáticos. El perfil de células inmunitarias en los ganglios linfáticos que drenan el tumor no mostró cambios significativos entre los grupos terapéuticos (Figura complementaria S1). En el bazo, la monoterapia con OXP y FOLFOX provocó un aumento de la población de Treg, aunque este aumento de la población de Treg no fue significativo. La combinación de OXP con anti-CD47 o anti-PD-L1 no tiene un impacto significativo en la población Treg. Tanto el régimen de combinación triple disminuyó significativamente el contenido de Treg en comparación con la monoterapia con OXP y FOLFOX (Fig. 4A, B). Las células T CD8+/INF-γ+ también aumentan en el bazo de los ratones que reciben OXP o FOLFOX + anti-CD47 y anti-PD-L1 en comparación con los ratones del grupo de control y los ratones que reciben OXP o FOLFOX. Además, FOLFOX + anti-CD47 y anti-PD-L1 aumentaron las células T CD8+/INF-γ+ en comparación con OXP + anti-PD-L1 (Fig. 4C,D).

La combinación de la terapia con OXP o FOLFOX con anti-CD47 y anti-PD-L1 disminuyó la Treg en las células CD4+ y aumentó las células CD8+/INF-γ+ en la población CD45+ en el bazo. (A) Estrategia de activación utilizada para el análisis de Treg en el bazo. (B) OXP y FOLFOX aumentaron Treg en células CD4+, sin embargo, este aumento no fue significativo. Tanto OXP como FOLFOX combinados con anti-CD47 y anti-PD-L1 redujeron la Treg en las células CD4+, y esta disminución fue significativa en comparación con los ratones que recibieron el régimen OXP o FOLFOX solo. (C) Estrategia de activación utilizada para el análisis de CD8+/INF-γ+ en la población de bazo CD 45+. (D) Tanto OXP como FOLFOX combinados con anti-CD47 y anti-PD-L1 aumentaron CD8+/INF-γ+ en la población CD45+. Este aumento fue significativo en comparación con la mayoría de los otros grupos terapéuticos.

Con base en la evidencia mencionada anteriormente, es muy probable que la terapia combinada condujera a un cambio en el microambiente del tumor a favor de la activación del sistema inmunitario. Así que investigamos el cambio en diferentes poblaciones de células inmunitarias en el microambiente tumoral después de los tratamientos. El número de Treg por gramo de tumor solo aumentó después de la monoterapia con quimioterapia, pero este aumento en el contenido de Treg fue significativo en los ratones que recibieron FOLFOX. Cuando se administran anti-CD47 y anti-PD-L1 simultáneamente con OXP y FOLFOX, se produce una disminución del contenido de Treg tumorales en comparación con la monoterapia con agentes quimioterapéuticos. Sin embargo, esta disminución en el contenido de Treg solo fue significativa en los ratones que recibieron FOLFOX + anti-CD47 y anti-PD-L1 en comparación con los ratones que recibieron FOLFOX solo (Fig. 5A).

Análisis de células inmunitarias en el microambiente tumoral de ratones con tumor CT-26. (A) Número de Treg por gramo de tumor. El número de Treg aumentó en el microambiente tumoral después del tratamiento con el régimen OXP y FOLFOX; sin embargo, solo fue significativo en el grupo que recibió FOLFOX. La combinación de anti-CD47 y anti-PD-L1 con FOFOX conduce a una disminución significativa de Treg por gramo de tumor en comparación con los ratones que reciben FOLFOX solo. (B) Número de células T CD8+ por gramo de tumor. OXP y FOLFOX y FOLFOX no cambiaron, el número de células T CD8+, pero en los grupos que recibieron anti-CD47 como parte de su tratamiento, el número de células T CD8+ por gramo de tumor aumentó significativamente. (C) Número de MDSC por gramo de tumor. (C) OXP y FOLFOX aumentaron el número de MDSC; sin embargo, solo fue significativo en el grupo que recibió FOLFOX cuando agregamos anti-CD47 en el régimen de combinación, lo que conduce a una disminución significativa en el número de MDSC en comparación con los ratones que recibieron OXP, FOLFOX y OXP + PD -L1. D, proporción de macrófagos M1/M2 en el microambiente tumoral. Agregar anti-CD47 a los regímenes combinados aumenta la proporción de macrófagos M1/M2 en comparación con otros grupos.

Las células T CD8+ por gramo de tumor aumentaron de manera anti-CD47; casi todos los grupos terapéuticos que recibieron anti-CD47 en el régimen terapéutico mostraron un aumento significativo de células T CD8+ en comparación con los grupos que no lo recibieron (Fig. 5B). MDSC por gramo de tumor también aumentó significativamente después de los tratamientos con OXP y FOLFOX. Además, la monoterapia con FOLFOX aumentó el contenido de MDSC en los tumores en comparación con la monoterapia con OXP. Este aumento de MDSC por gramo de tumor se revirtió usando anti-CD47 de acuerdo con su efecto sobre el contenido de Treg en el tumor (Fig. 5C). También investigamos el efecto de un régimen terapéutico en la relación M1/M2 en el microambiente tumoral. La monoterapia con FOLFOX u OXP no afecta significativamente la relación M1/M2 en un tumor. Pero en ratones que recibieron anti-CD47 en forma de terapia bicombinada con OXP y terapia tricombinada con OXP o FOLFOX, la relación M1/M2 aumentó significativamente (Fig. 5D).

En este estudio, evaluamos el potencial de combinar la quimioterapia con el bloqueo de los receptores de puntos de control inmunitarios innatos y adaptativos en el modelo de ratón CT-26. La importancia de combinar bloqueadores de puntos de control tanto innatos como adaptativos se destacó en varios informes publicados. La lógica detrás de la combinación de bloqueadores de puntos de control innatos con adaptativos es orquestar las respuestas de DC, macrófagos y células T contra las células tumorales20,21. Tanto los regímenes OXP como FOLFOX se informan como inductores efectivos de DAI y están en la clínica para el tratamiento de rutina de los pacientes con CCR.

De acuerdo con numerosos estudios que informaron un aumento en los receptores de puntos de control después del tratamiento con quimioterapia, encontramos un aumento en la expresión de CD47 y PD-L1 después del tratamiento con OXP y FOLFOX11,22. Debido a la toxicidad del régimen de quimioterapia OXP y FOLFOX, el análisis de expresión de CD47 y PD-L1 in vitro solo pudo evaluarse seis horas después de que se trataron las células CT-26. Teniendo en cuenta esta limitación, la expresión de PD-L1 aumentó tanto con OXP como con FOLFOX en experimentos in vitro e in vivo, y se encontró un aumento en la expresión de CD47 en la superficie celular de CT-26 después del tratamiento con OXP y FOLFOX, in vitro. En ratones con tumores, solo FOLFOX indujo un aumento en la expresión de CD47, e incluso aunque el tratamiento con OXP aumentó la expresión de CD47 en la superficie de las células CT-26, este aumento fue insignificante. Varios estudios han revelado que la digestión enzimática influye en la expresión de marcadores de superficie celular; por lo tanto, la ausencia de un aumento significativo en la expresión de CD47 por OXP puede atribuirse a una pérdida parcial de CD47 después de la digestión enzimática del tumor23,24. Varios mecanismos podrían estar involucrados en el aumento de la expresión del receptor del punto de control después de las quimioterapias. En un estudio reciente, Samanta et al. informaron un mecanismo dependiente de HIF para un aumento en la expresión de PD-L1 y CD47 después del tratamiento con agentes quimioterapéuticos11. Además, las quimioterapias inductoras de ICD aumentan la infiltración de células T y el INF-γ secretado por los linfocitos infiltrados. Este aumento en la infiltración de células efectoras y la secreción de INF-γ sugirió ser otro factor que aumenta la expresión de puntos de control inhibitorios, como PD-L1 y CD47 en células tumorales25,26,27,28.

Tanto el anti-CD47 como el anti-PDL-1 se usaron en combinación con diferentes regímenes de quimioterapia y mostraron resultados prometedores en ratones y ensayos clínicos. Sin embargo, nuestro estudio es el primero en investigar la posible sinergia usando la combinación triple de quimioterapia e inmunoterapia. OXP combinado con anti-CD47 y anti-PD-L1 aumentó la supervivencia de los ratones y redujo el crecimiento tumoral en comparación con OXP solo. Este resultado es consistente con un aumento en la expresión de CD47 y PD-L1 después del tratamiento con OXP que conduce a una supresión de la fase de activación y la fase efectora de la respuesta inmune. Mediante el uso de anti-CD47 y anti-PD-L1, pudimos suprimir la señal del punto de control negativo y orquestamos una respuesta inmunitaria contra el tumor. FOLFOX incluso mostró más potencial cuando se usó en combinación con anti-CD47 y anti-PD-L1. La razón detrás de esta observación podría ser una mayor liberación de DAMP por parte de las células tumorales después de la quimioterapia con FOLFOX sobre OXP, lo cual fue informado por Dosset et al.1.

Como esperábamos, nuestros protocolos de tratamiento afectaron significativamente el perfil de células inmunitarias en el microambiente del bazo y del tumor. En el bazo, tanto el régimen OXP como el FOLFOX aumentaron la frecuencia de Treg; sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo. Pero cuando usamos anti-CD47 y anti-PD-L1 combinados con OXP o FOLFOX resultó en una disminución significativa en la frecuencia de Treg en comparación con el tratamiento con OXP y FOLFOX solos. No observamos esta disminución de Treg cuando los ratones fueron tratados con OXP en agente doble combinado con anti-CD47 o anti-PD-L1. En el microambiente del tumor, el cambio en el número de Treg por gramo de tumor siguió el mismo patrón que el cambio en la frecuencia de Treg en el bazo. Pero solo FOLFOX realizó cambios estadísticamente significativos. Tanto anti PD-L1 como anti CD47 han sido capaces de suprimir la función Treg y reducir el número de Treg en tumores y órganos linfáticos en estudios previos29,30. En nuestro estudio, su efecto beneficioso solo se observó cuando los anti-CD47 y anti-PD-L1 se utilizaron en un régimen de combinación triple con agentes quimioterápicos.

Mostramos que la infiltración de células T CD8+ aumentó significativamente en el microambiente tumoral de los ratones que recibieron anti-CD47 como uno de sus regímenes de tratamiento. En estudios recientes, el bloqueo de CD47/SIPR-α condujo a un aumento en la frecuencia y función de las células T CD8+ en el microambiente tumoral30,31. Liu et al. informaron que en el bloqueo de CD47, el efecto antitumoral depende del cebado cruzado de las células T CD8+ por las células DC32. Un aumento en el número de células T CD8+ por gramo de tumor en el estudio actual respalda el beneficio de supervivencia y la disminución en los resultados del tamaño del tumor, excepto que no observamos el beneficio en la supervivencia de los ratones que recibieron OXP y anti-CD47. OXP y anti-CD47 no lograron reducir el contenido de Treg en el microambiente del bazo y del tumor; este fracaso podría ser la razón por la que en esta estrategia de tratamiento, a pesar de un aumento de células T CD8+, no observáramos la respuesta terapéutica.

Además de su efecto citotóxico, los agentes quimioterapéuticos aumentan la frecuencia de MDCS a través de la acción de mediadores inflamatorios, incluidos GM-CSF, G-CSF, IL1β, IL6 y CCL233,34. También analizamos el número de MDSC por gramo de tumor y la relación M1/M2 en el microambiente tumoral. El número de MDSC por gramo de tumor aumentó después de la monoterapia con el régimen OXP y FOLFOX. Cuando agregamos anti-CD47 en el régimen de terapias combinadas, este aumento en MDSC se revirtió y el número de MDSC por gramo de tumor disminuyó. De acuerdo con nuestro estudio, Wu et al. también informaron una disminución en la población de MDSC después del tratamiento con anti-CD4735. Los macrófagos M2 juegan un papel importante en la progresión del cáncer al proporcionar un microambiente inmunosupresor para el crecimiento tumoral36. Zhang et al. comunicaron la repolarización de los macrófagos M2 a M1 tras el tratamiento con anti-CD4737. En nuestro estudio en tres grupos de ratones que recibieron anti-CD47 en tratamientos combinados, se incrementó la relación de macrófagos M1/M2.

Nuestros resultados validaron el concepto de usar bloqueadores de puntos de control tanto innatos como adaptativos en combinación con agentes quimioterapéuticos. Sobre la base de numerosos estudios, entre diferentes agentes quimioterapéuticos, aquellos con capacidad de inducir ICD parecen encajar mejor en terapias combinadas con inhibidores de puntos de control. Si no para todos los cánceres, al menos en el modelo de tumor CT-26 parece que se necesita bloquear tanto el eje CD47 como el PD-L1 para obtener la mejor respuesta terapéutica.

Los anticuerpos monoclonales de bloqueo IgG anti-ratón CD47 e IgG anti-ratón PD-L1 (clon: MIAP301 y 10F.9G2 respectivamente) se adquirieron de Bioxcell (NH, EE. UU.). PerCP Anticuerpo CD4 anti-ratón de rata (clon RM4-5), marcado con PE Anticuerpo CD8a anti-ratón de rata (clon 53-6.7), marcado con PE Anticuerpo CD25 anti-ratón de rata (clon PC61), marcado con Alexa-flour® 488 Anticuerpo Foxp3 anti-ratón de rata (clon MF-14), anticuerpo anti-CD47 de ratón Alexa Fluor® 488 (MIAP301), anticuerpo PE anti-CD274 de ratón (B7-H1, PD-L1) (clon 10F.9G2), anti-ratón PerCP /anticuerpo CD11b humano (clon M1/70), anticuerpo Alexa Fluor® 488 anti-CD80 de ratón (clon 16-10-A1), anticuerpo PE anti-CD206 de ratón (MMR) (clon C068C2), anticuerpo anti-CD45 de ratón marcado con APC (clon 30F11), NIR Zombie die (para discriminación vivo/muerto), así como anticuerpos de control de isotipo apropiados y un conjunto de tampones de factor de transcripción True-Nuclear™ se adquirieron de Biolegend (CA, San Diego). La colagenasa tipo I se adquirió de Gibco (NY, EE. UU.). La ADNasa tipo I se adquirió de Roche (EE.UU.). Los solventes y reactivos químicos restantes fueron de grado químico.

Para determinar el efecto de OXP y FOLFOX en la expresión de CD47 y PD-L1 en la superficie celular, se cultivó la línea celular CT-26 (Pasture Institute, Teherán, Irán) en RPMI 1560 Gibco (NY, EE. UU.) con 10 % de FBS Gibco (NY , EE. UU.), Penicilina y estreptomicina y luego se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de 24 h, las células se trataron con OXP 50 µM (Sobhan, Teherán, Irán) o OXP 50 µM (Sobhan, Teherán, Irán) más 5-fluorouracilo 10 µM (régimen FOLFOX), (Alhavi, Teherán, Irán). La concentración de agente quimioterapéutico utilizada para el estudio in vitro se basó en estudios previos, lo que condujo a la inducción máxima de DAI1. Seis horas después de que las células tumorales CT-26 se trataran con agentes quimioterapéuticos, las células se recolectaron, se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo y se analizaron para detectar la expresión de CD47 y PD-L1 en la superficie celular con un citómetro de flujo BD FACSlyric (Becton Dickinson, EE. UU.).

Se adquirieron ratones hembra BALB/c de seis a ocho semanas de edad del Instituto Pasteur, Thran, Irán, y se alojaron en condiciones apropiadas. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes y las pautas de ARRIVE. El estudio en animales también fue aprobado por el Comité Ético Institucional y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti con número de código ético: IR. SBMU. MSP.REC.1396.370. Un procedimiento detallado de inducción de tumores se describe previamente38,39. Brevemente, se inyectaron 106 células tumorales CT-26 en el flanco derecho de cada ratón BALB/c. Cuando el tumor alcanzó los 150 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento según el volumen de su tumor, de la siguiente manera: control (ratones que recibieron placebo), OXP (ratones que recibieron oxaliplatino, 6 mg/kg), FOLFOX (ratones que recibieron oxaliplatino, 6 mg/kg). /kg + 5FU, 50 mg/kg + Flavinina 90 mg/kg), OXP + anti-CD47 (100 µg por ratón), OXP + anti-PD-L1 (200 µg por ratón), OXP + anti-CD47 + anti -PD-L1 y FOLFOX + anti-CD47 + anti-PD-L1. La dosis y el esquema utilizados para el régimen OXP y FOLFOX se basaron en estudios previos, con máxima inducción de CDI y mínima citotoxicidad1. Comenzamos las inyecciones de agentes de quimioterapia después de que los tumores alcanzaran 150 mm3 (7 días después de la inoculación del tumor). El programa detallado para la inyección de agentes terapéuticos se ilustra en la Fig. 3A. El tamaño del tumor de los ratones con tumor CT-26 se midió con calibradores digitales cada tres días y el volumen del tumor se calculó como a × b2/2, donde a es el diámetro más grande yb el diámetro más pequeño. Se continuaron las mediciones del tamaño del tumor hasta que el tamaño del tumor alcanzó los 2000 mm3. El cálculo detallado del tiempo para alcanzar el punto final (TTE), el retraso del crecimiento tumoral (% TGD) y el aumento de la vida útil (ILS) de cada ratón se describió en nuestros estudios anteriores40,41.

Veintidós días después de la inoculación del tumor (7 días después de la última inyección en los grupos terapéuticos), se sacrificaron tres ratones de cada grupo mediante asfixia con CO2 bajo eutanasia con isoflurano, y se analizó la población de células inmunitarias en los ganglios linfáticos, el bazo y los tumores que drenaban. . En el caso de drenaje de ganglios linfáticos y bazo, se analizó la frecuencia de Treg y células T CD8+/INF-γ+ en la población de células vivas CD45+. Para la separación de células individuales, utilizamos un filtro de células de 70 µm (SPL, Corea del Sur) y todos los procedimientos de tinción para la citometría de flujo se basaron en las instrucciones del fabricante. Para el análisis del tumor digerimos el tumor con 2 mg/ml de colagenasa tipo I y 10 UI/ml de DNasa tipo I en medio RPMI. Después de 90 min de digestión, las células individuales se separaron de la suspensión celular utilizando un filtro de células de 70 µm. Para analizar el efecto de Oxaliplatino y FOLFOX sobre la expresión en superficie celular de CD 47 y PD-L1 Invivo, se analizó su expresión en CD45- live cell gate. También analizamos la población exacta de células T reg, CD8+/INF-γ+, MDCS y macrófagos M1/M2 en el microambiente tumoral. Para cuantificar el número exacto de células infiltradas, calculamos las células separadas por gramo de tumor. Usando la frecuencia de cada población celular en la puerta de entrada de la célula viva, pudimos cambiar la frecuencia de cada población celular al número de células específicas por gramo de tumor. La estrategia de activación utilizada para cada población celular se resume en las figuras correspondientes.

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism (CA, EE. UU.). Para las comparaciones de dos grupos, se utilizaron la prueba t y la prueba de Mann-Whitney. Para la comparación de grupos múltiples, se utilizó la prueba ANOVA de una o dos vías. Todas las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01). El análisis de supervivencia se realizó con una prueba de Mantel-Cox. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente, Seyed Amir Jalali, por correo electrónico ([email protected]).

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Este artículo ha sido extraído de la tesis escrita por el Sr. Reza Alimohammadi en la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti (número de registro: 364). ID de aprobación del comité de ética: IR. SBMU. MSP.REC.1396.370. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti (Concesión no: 10244).

Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, 198571-7443, Irán

Reza Alimohammadi, Esmail Mortaz, Nariman Mossafa y Seyed Amir Jalali

Grupo de Inmunoterapia Tumoral y Microambiente (TIME), Departamento de Oncología, Instituto de Salud de Luxemburgo (LIH), Ciudad de Luxemburgo, Luxemburgo

Ghanbar Mahmoodi Chalbatani

Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán

Masoumeh Alimohammadi

Departamento de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad, Mashhad, Irán

Haniyeh Ghaffari-Nazari

Departamento de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Tarbiat Modares, Teherán, Irán

Arezou Rahimi

JJP Biologics, Varsovia, Polonia

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Los autores RA & SAJ diseñaron el estudio. RA diseñó y realizó un experimento de citometría de flujo multicolor. RA, GMC, MA, HG & AR, realizaron los experimentos in vitro e in vivo. RA, MA & AR escribieron el manuscrito. RA, MA, EM, NM, LB, SAJ y AR editaron el manuscrito. SAJ proporcionó el fondo para el proyecto.

Correspondencia a Seyed Amir Jalali.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Alimohammadi, R., Mahmoodi Chalbatani, G., Alimohammadi, M. et al. El bloqueo dual de PD-L1 y CD47 mejora el efecto terapéutico del oxaliplatino y FOLFOX en el modelo tumoral de ratones CT-26. Informe científico 13, 2472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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Recibido: 24 agosto 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 11 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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