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Oct 26, 2023

Evaluación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas tempranas a la vacuna contra la tuberculosis Mycobacterium bovis BCG y la vacuna candidata BCGΔBCG1419c

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12377 (2022) Citar este artículo

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La vacuna Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) provoca una respuesta inmune que protege contra ciertas formas de tuberculosis (TB); sin embargo, debido a que la eficacia de la BCG es limitada, es importante identificar candidatos alternativos a vacunas contra la TB. Recientemente, se demostró que el mutante por deleción de BCG y el candidato a vacuna BCGΔBCG1419c sobreviven más tiempo en ratones BALB/c infectados por vía intravenosa debido a una mayor formación de biopelícula, y protegen mejor a los ratones BALB/c y C57BL/6 contra la patología pulmonar inducida por TB durante las etapas crónicas de infección, en relación con los controles de BCG. La protección provocada por BCGΔBCG1419c también se asoció con niveles más bajos de citoquinas proinflamatorias (es decir, IL6, TNFα) en el sitio de infección en ratones C57BL/6. Dados los distintos perfiles inmunitarios de los ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c durante la TB crónica, nos propusimos determinar si existen eventos inmunológicos tempranos que distingan a estos dos grupos, utilizando análisis de citometría de flujo multidimensional de los pulmones y otros tejidos poco después de la inmunización. . Nuestros resultados demuestran una serie de diferencias de respuesta innatas y adaptativas entre los ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c que son consistentes con que este último es más duradero y potencialmente menos inflamatorio, incluidas frecuencias más bajas de células auxiliares T CD4+ agotadas (TH) y frecuencias más altas de IL10 -células T productoras, respectivamente. Estos estudios sugieren que el uso de BCGΔBCG1419c puede ser ventajoso como candidato alternativo a la vacuna contra la TB.

La tuberculosis (TB) es una de las principales causas de muerte por una enfermedad infecciosa1. La TB está causada por la transmisión aerogénica de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), una especie bacteriana que infecta a los macrófagos alveolares y puede diseminarse a los tejidos extrapulmonares por vía linfática o hematógena2. La TB tiene un espectro de manifestaciones clínicas que varían según la respuesta del huésped, incluidas formas graves, activas, crónicas, subclínicas y latentes3. Las mejores condiciones socioeconómicas, las prácticas de salud pública y el uso de tratamientos farmacológicos efectivos han reducido las tasas globales de TB; sin embargo, estas tasas no alcanzaron el objetivo de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de revertir la incidencia de TB para 20154, y no están en el objetivo de alcanzar los puntos de referencia de la OMS para poner fin a la epidemia de TB para 20305. Por estas razones, es importante que haya una vacuna segura que promueve de manera efectiva la resistencia a la TB.

La vacuna antituberculosa Bacillus Calmette-Guerin (BCG) es una cepa viva atenuada de Mycobacterium bovis cuya virulencia humana se ha atenuado mediante múltiples pases en cultivo artificial. La BCG se administra en todo el mundo como vacuna neonatal contra formas graves de TB infantil6; sin embargo, el uso de BCG en niños es controvertido debido a su eficacia variable7, así como a la cantidad de eventos adversos que se derivan de su inmunogenicidad temprana8. Dentro de las primeras 2 semanas posteriores a la inmunización, casi todos los receptores de BCG experimentan efectos adversos leves, que van desde la formación de pápulas en el lugar de la vacunación, que pueden ulcerarse o dejar una cicatriz, hasta la inflamación de los ganglios linfáticos que drenan. Los eventos adversos graves incluyen formas más pronunciadas de lesiones cutáneas (p. ej., BCG lupus vulgaris), linfadenitis con supuración y osteítis. Debido a la cantidad de eventos inflamatorios adversos que acompañan a la inmunización con BCG y al aumento de la reticencia a la vacunación entre los padres en países endémicos de TB9,10,11,12 que son reacios a exponer a sus hijos a vacunas antiinflamatorias (independientemente de su eficacia), es Es importante identificar vacunas candidatas contra la TB que, en relación con la BCG, tengan una reactogenicidad temprana reducida pero una eficacia protectora comparable o mejor contra la TB.

Recientemente, se demostró que la vacuna candidata BCGΔBCG1419c confiere igual y/o mejor protección contra la TB experimental en comparación con su cepa parental, BCG Pasteur, en una variedad de modelos de ratón (BALB/c13,14, C57BL/615,16 y B6D2F1 [ C57BL/6J × DBA/2J]13), incluido un modelo BALB/c de diabetes tipo 217, mientras que en cobayas fue más eficaz que BCG para reducir la diseminación hematógena a los 2 meses de la infección18. El gen BCG1419c de M. bovis codifica una actividad de fosfodiesterasa que hidroliza bis-(3′-5′)-GMP dimérico cíclico (c-di-GMP), una molécula que reduce la motilidad bacteriana y aumenta la formación de biopelículas (las biopelículas son bacterias sésiles encerradas dentro de una matriz de una sustancia polimérica extracelular)19. Como consecuencia de la eliminación de BCG1419c, la cepa BCGΔBCG1419c tiene una mayor capacidad para producir biopelículas y persiste más tiempo en ratones inmunocompetentes en comparación con BCG Pasteur después de la infección intravenosa20. Es importante destacar que los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c también muestran menos patología pulmonar después de la infección por Mtb, en relación con los ratones inmunizados con BCG que luego se infectaron con Mtb15. Curiosamente, a los 60 días después de la vacunación, los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c mostraron un mayor número de células T CD3+ CD4+ y T CD3+CD4+CD44+ en BALF obtenidas de C57BL/6 en comparación con BCG16 original. Además, en bazos de ratones BALB/c, BCGΔBCG1419c aumentó las células T CD3+CD4+IFNγ+ y T CD3+CD8+IFNγ+ con respecto al BCG13 original. Además, hemos observado que BCGΔBCG1419c promueve una presencia diferencial en los pulmones de células T productoras de IFNγ y macrófagos activados en un modelo BALB/c de TB13 activa y crónica mientras cambia la presencia relativa en pulmones de células B, CD8+ y dendríticas. , en un modelo BALB/c de diabetes TB-tipo 217. Todos estos hallazgos muestran que BCG y BCGΔBCG1419c afectan la composición relativa de las células inmunes adaptativas antes y después de la infección en diversos órganos y tejidos de los huéspedes vacunados.

Dado que BCGΔBCG1419c es una vacuna eficaz en múltiples modelos de TB experimental, superando a BCG en la prevención de la enfermedad de TB medida como patología pulmonar y diseminada al bazo, llevamos a cabo una serie de experimentos para determinar si la inmunogenicidad temprana de BCGΔBCG1419c es comparable o distinta de la provocada por BCG, cuyos efectos inflamatorios adversos se observan típicamente dentro de las 2 a 3 semanas posteriores a la inmunización. Específicamente, inmunizamos ratones de tipo salvaje y una cepa de ratón reportero IL10 transgénico con BCG o BCGΔBCG1419c, y posteriormente realizamos un inmunofenotipado profundo para identificar de manera integral los eventos inmunitarios innatos y adaptativos que ocurren dentro de las primeras 2 a 3 semanas posteriores a la inmunización, así como el celular. fuentes de IL1021,22,23,24. Nuestros datos demuestran eventos inmunológicos tempranos desconocidos hasta ahora inducidos por BCG, así como diferencias fenotípicas y funcionales entre las respuestas inmunes provocadas por BCG y BCGΔBCG1419c. Se discute la relevancia de nuestros datos para los mecanismos de BCG de inmunogenicidad temprana, así como la comprensión de la eficacia de BCGΔBCG1419c.

Este estudio y sus experimentos asociados fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad Estatal de Ohio (OSU), así como por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la OSU (IACUC). El estudio se realizó de acuerdo con las pautas institucionales relevantes y se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Viales congelados de M. bovis BCG cepa Pasteur (BCG) y su derivado isogénico, BCGΔBCG1419c, que carece de una fosfodiesterasa di-GMP cíclica codificada por el gen BCG1419c20, se recibieron de la Universidad Estatal de Colorado (Ft. Collins, CO) de un estudio anterior15 y almacenado a -80 °C. Después de descongelar, la suspensión bacteriana (1 ml) se transfirió a 9 ml de medio 7H9 (suplementado con OADC, Tween 80 al 0,1 %), en un tubo de cultivo de vidrio estéril con tapa roscada de 150 × 25 mm; Se añadió una barra de agitación magnética recubierta de plástico muy pequeña para la aireación y agitación del cultivo. Esta suspensión de bacterias/7H9 se colocó en un agitador magnético y se cultivó durante 15 días a 37 °C, 5 % de CO2 (durante este período se aplicó la fuerza magnética mínima necesaria para agitar la barra de agitación). Después de este período inicial de 15 días, se transfirieron 5 ml de la suspensión de bacterias/7H9 a 50 ml de medio Proskauer Beck sintético (modificado de Youmans y Karlson25, PB: KH2PO4 al 0,5 %, monohidrato de l-asparagina al 0,5 %, MgSO4·7H2O al 0,06 %). , citrato de magnesio al 0,25 %, glicerol al 2 %, Tween 80 al 0,05 %) en un frasco de cultivo de vidrio estéril y se cultivó durante 17 días adicionales a 37 °C, 5 % de CO2 (los cultivos se agitaron suavemente a 30 RPM durante este período). Al final de este período de 17 días, BCG y BCGΔBCG1419c se dividieron en alícuotas y se congelaron rápidamente en tubos de microcentrífuga con tapa roscada a -80 °C. Después de 5 días de congelación a -80 °C, se descongelaron alícuotas individuales de BCG y BCGΔBCG1419c y se sembraron diluciones en serie en 7H10 (suplementado con OADC, l-asparagina al 0,1 %) y TCA (para probar la contaminación). Los recuentos de colonias demostraron que las alícuotas de BCG y BCGΔBCG1419c eran de 5 × 104/mL; Las placas de TCA no mostraron crecimiento (es decir, ni BCG ni BCGΔBCG1419c contenían contaminantes).

Se adquirieron ratones C57BL/6 de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME); El Dr. Weiguo Cui (Instituto de Investigación de la Sangre, Centro de Sangre de Wisconsin, Milwaukee, WI) proporcionó generosamente ratones indicadores de IL10 (antecedentes C57BL/6)26. Todos los ratones se mantuvieron dentro de los recursos de animales de laboratorio universitarios (ULAR) de la Universidad Estatal de Ohio (OSU) y se les suministró agua estéril y ad libitum. Todos los métodos y procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos y procedimientos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Institución OSU (IACUC).

El día de la inmunización (día 0), se descongelaron alícuotas de BCG y BCGΔBCG1419c y se cargaron directamente en jeringas de tuberculina. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea (sc) en la parte posterior del cuello con 1 × 104 CFU de BCG o BCGΔBCG1419c (es decir, 200 µl de una alícuota de 5 × 104 CFU/ml). El día 14 posterior a la inmunización, se recolectaron los ganglios linfáticos cervicales y el bazo de ratones indicadores IL10 sacrificados y se usaron para el análisis de citometría de flujo. El día 18 posterior a la inmunización, se recogieron sangre, bazo y pulmones de ratones C57BL/6 sacrificados y se usaron para análisis de citometría de flujo. Como se describe en nuestros Resultados, nuestro análisis de los ratones indicadores de IL10 se realizó antes que el de los ratones C57BL/6 (día 14 frente al día 18) para determinar si las diferencias de expresión de IL10 preceden a las diferencias fenotípicas entre los ratones C57BL/6 inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c.

Los tejidos del bazo y de los ganglios linfáticos se presionaron suavemente a través de un tamiz de malla usando la parte del émbolo de una jeringa de 1 ml. Los pulmones se procesaron de manera similar después del tratamiento con colagenasa/DNasa. Las suspensiones de células resultantes se transfirieron a un tubo de 15 ml filtrando a través de un filtro de 100 micras utilizando medio R10 enfriado con hielo (RPMI 1640 de Gibco® Thermo Fisher, 10% FBS, 2 mM de l-glutamina, 100 U/ml de penicilina G, estreptomicina 100 μg/mL). Los tubos se centrifugaron a 250 × g durante 7 min a 4 °C. El sedimento celular se resuspendió con medio R10. Después de descartar el sobrenadante, el sedimento celular se lavó nuevamente y se incubó con 1 ml de tampón de lisis de RBC a temperatura ambiente. La reacción de lisis de RBC se detuvo después de 10 min usando 1 ml de medio R10 y se centrifugó a 250 xg durante 7 min a 4 °C.

Se transfirieron células recién aisladas de tejidos de bazo, pulmón y sangre a medio R10 precalentado y se lavaron. Luego, las células se resuspendieron a 1–2 millones de células por ml en medio R10 y se estimularon en tubos FAC con PMA/ionomicina (concentración final de 2 μg/mL) en presencia de GolgiPlug, a una concentración final de 10 μg/mL; (BD Biosciences, San Jose, California) durante 12 h en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. Al final de la incubación, se realizó el procedimiento de tinción intracelular. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales: FITC anti-CD3 (clon 17A2), Alexa Fluor 532 anti-CD4 (clon RM4-5), PE anti-CD127 (clon SB/199), PE-eFluor 610 anti-PD1 (clon J43 ), PE-Cy5 anti-CD11b (clon M1/70), PerCP-Cy5.5 anti-CD44 (clon IM7), PerCP-eFluor 710 anti-CXCR5 (clon SPRCL5), PE-Cy7 anti-CD117 (clon 2B8) , Alexa Fluor 647 anti-CRTH2 (clon No3m1scz), Alexa Fluor 700 anti-TNFα (clon MP6-XT22), Brilliant Violet 421 anti-CD45 (clon 30-F11), Super Bright 436 anti-CD62L (clon MEL-14) , eFluor 450 anti-Granzyme b (clon NGZB), BD Horizon BV480 anti-IFNγ (clon XMG1.2), Brilliant Violet 570 anti-CD8 (clon 53-6.7), Brilliant Violet 605 anti-IL17 (clon TC11-18H10. 1), Brilliant Violet 650 anti-Gr1 (clon RB6-8C5), Brilliant Violet 711 anti-CD19 (clon 6D5), Brilliant Violet 750 anti-CD27 (clon LG.3A10), Brilliant Violet 785 anti-NK1.1 (clon PK136). Las muestras se tiñeron con Fixability Viability Dye (tinción Aqua Live/Dead) y se incubaron durante 15 min. Luego, las células se lavaron y luego se añadió un cóctel de anticuerpos de superficie. Después de incubar durante 30 min, las células se lavaron y fijaron con tampón de fijación (Nº de catálogo: 420801 Biolegend) durante 20 min y se permeabilizaron con 1 × tampón de lavado de permeabilización de tinción intracelular (Nº de catálogo: 421002 Biolegend). Se añadieron las cantidades recomendadas de anticuerpos primarios directamente conjugados para la detección de antígenos intracelulares y se incubaron durante 25 min a 4 °C en la oscuridad. Todos los pasos de lavado se llevaron a cabo a 700 g durante 6 min a 4 °C. Todos los anticuerpos fueron previamente titulados para determinar la concentración óptima. Finalmente, después de lavar y filtrar las células a través de tubos FAC tapados con filtro, las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo Cytek Aurora o FACS Canto y se analizaron con FlowJo versión 10.6.1 (Becton Dickinson, Ashland, OR).

Las cifras se prepararon utilizando GraphPad Prism, versión 7. Los análisis estadísticos utilizaron el software incluido. Las barras en las figuras muestran las medias más las desviaciones estándar (DE). Los números que se muestran entre los puntos de datos representan valores p para las comparaciones indicadas en las figuras. Antes de realizar las comparaciones estadísticas, se utilizó la prueba de Shapiro Wilk para determinar si la distribución de datos era normal. Las comparaciones estadísticas que involucran a más de dos grupos experimentales utilizaron análisis de varianza (ANOVA). Todas las demás comparaciones estadísticas utilizaron la prueba t de Student. Los datos que se muestran en cada figura son representativos de 3 experimentos separados, con al menos 3 ratones por grupo experimental (PBS, BCG, BCGΔBCG1419c).

Para identificar las poblaciones inmunes innatas y adaptativas tempranas que responden a BCG, así como identificar qué efecto tiene la eliminación de BCG1419c en estas respuestas, inmunizamos ratones C57BL/6 con 104 UFC de BCG Pasteur vivo y su derivado isogénico, BCGΔBCG1419c (Fig. .1A). Los ratones inmunizados con PBS solo sirvieron como controles negativos. En el día 18 posterior a la inmunización, se recolectaron múltiples tejidos (sangre, bazo y pulmón), se procesaron en suspensiones de células individuales y se analizaron mediante citometría de flujo multidimensional para identificar las diferencias fenotípicas y funcionales entre los subconjuntos inmunes innatos y adaptativos (Fig. 1B).

Resumen del experimento. (A) Programa de vacunación y (B) estrategia de activación para identificar subconjuntos innatos y adaptativos.

Para evaluar exhaustivamente si la eliminación de BCG1419c altera el panorama inmunitario inducido por BCG en ratones, se diseñó un panel de citometría de flujo de 27 colores para caracterizar las poblaciones inmunitarias pulmonares y sistémicas. Aplicamos citometría de flujo convencional y gráficos de reducción de dimensionalidad de incrustación estocástica distribuida en t (tSNE) de células CD45+ del bazo, pulmón y sangre, lo que permitió la identificación de 19 poblaciones de células inmunitarias (Fig. 2). El algoritmo de agrupamiento permitió la definición automática de 8 metaclusters inmunitarios innatos en los que la expresión de CD3 y CD19 estaba ausente (Fig. 2A), y 11 metaclusters inmunitarios adaptativos en los que estaba presente la expresión de CD3 y CD19 (Fig. 2B; los mismos gráficos tSNE que se muestran en la Fig. . 2A pero con la superposición de células T y B). Las distinciones entre las distribuciones de los grupos de pulmón, bazo y sangre se pueden observar comparando las filas superior, media e inferior de la Fig. 2A, B, así como entre los ratones inmunizados con control de PBS, BCG y BCGΔBCG1419c (compare las columnas izquierda, media y derecha de la Fig. . 2). Con respecto a los linajes innatos, observamos reducciones en la representación de las células NK entre las células CD45+ en los bazos de ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c en comparación con los controles de PBS (Fig. 2A panel superior, puntos de datos rojos), así como los pulmones (Fig. 2A panel central) y sangre (Fig. 2A panel inferior). Por el contrario, la representación de monocitos entre CD45+ aumentó en la sangre después de la inmunización con BCG y BCGΔBCG1419c en comparación con los controles de PBS (Fig. 2A panel inferior, puntos de datos azul claro). Con respecto a los linajes adaptativos, el análisis tSNE reveló además una elevación del grupo de células B en el bazo, así como grupos elevados de células T CD4+ y CD8+ en los pulmones del grupo inmunizado con BCG o BCGΔBCG1419c (Fig. 2B).

Agrupación basada en gráficos de poblaciones inmunitarias inducidas por PBS, BCG y BCGΔBCG1419c visualizadas mediante la incorporación de vecinos estocásticos distribuidos en T (tSNE). Mapas representativos de tSNE de células CD45+ en (A) sangre, (B) bazo y (C) pulmones de control, ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. En cada parcela t-SNE, los grupos están codificados por colores y se les asigna una identificación de linaje basada en los marcadores que se definen en la Fig. 1B.

Mientras que el análisis tSNE permite la visualización de datos de alto nivel, utilizamos el análisis de citometría de flujo tradicional para examinar más de cerca y cuantitativamente las poblaciones innatas y adaptativas que se vieron afectadas de manera diferente por BCG y BCGΔBCG1419c. Dado que el análisis tSNE demostró que las respuestas pulmonar y sistémica a la vacunación eran distintas, las diferencias entre el bazo (paneles izquierdos de las Figs. 3, 4, 5, 6), pulmón (paneles centrales de las Figs. 3, 4, 5, 6) y sangre ( los paneles de la derecha de las figuras 3, 4, 5, 6) se consideraron por separado.

Frecuencias de subconjuntos inmunes innatos en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Las frecuencias del subconjunto inmunitario innato (es decir, ILC, células NK, monocitos y células Gr1) en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c, así como controles con PBS, se midieron en el bazo, los pulmones y la sangre el día 18 posterior a la inmunización. Se muestran los frecuencias de (A) ILC3, (B) ILC1, (C) células NK, (D) monocitos y (E) células Gr1 en el bazo (columna izquierda), pulmón (columna central) y sangre (columna derecha), como sincronizadas a partir de células CD45+ individuales vivas. Las ILC se separaron de CD3-CD19-CD127+, y se determinaron diferentes subconjuntos de acuerdo con la expresión de CRTH2 frente a cKit: ILC1, CRTH2-cKit-; ILC2, CRTH2+cKit+/−; ILC3, CRTH-cKit+. Los cuadros representan datos de 3 ratones por grupo; los asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa entre las filas indicadas (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Frecuencias de subconjuntos inmunes adaptativos en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Las frecuencias del subconjunto inmunitario adaptativo (es decir, células T y B) en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c, así como controles con PBS, se midieron en el bazo, los pulmones y la sangre el día 18 posterior a la inmunización. Se muestran las frecuencias de (A) Células T CD4+, (B) células T CD8+ y (C) células B en el bazo (columna de la izquierda), pulmón (columna del medio) y sangre (columna de la derecha), como resultado de células CD45+ individuales vivas. Los cuadros representan datos de 3 ratones por grupo; los asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa entre las filas indicadas (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Frecuencias del subconjunto de células T CD4+ en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Las frecuencias del subconjunto de células T CD4 (TH) en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c, así como controles con PBS, se midieron en el bazo, los pulmones y la sangre, en función de su expresión de CD62L, CD44, PD1 y CXCR5 (sin tratamiento previo, CD62LHICD44LO; efector, CD62LLOCD44HI; memoria, CD62LHICD44HI; agotado, PD1+; folicular, CXCR5+PD1+). Se muestran las frecuencias de (A) células TH vírgenes, (B) células TH efectoras, (C) células TH de memoria, (D) células TH agotadas y (E) células TH foliculares en el bazo (columna izquierda), pulmón ( columna del medio) y sangre (columna de la derecha), como si fueran células individuales CD45+ vivas. Los cuadros representan datos de 3 ratones por grupo; los asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa entre las filas indicadas (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Frecuencias del subconjunto de células T CD8+ en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Las frecuencias del subconjunto de células T CD8 (TC) en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c, así como controles con PBS, se midieron en el bazo, los pulmones y la sangre, en función de su expresión de CD62L y CD44 (sin tratamiento previo, CD62LHICD44LO; efector, CD62LLOCD44HI; memoria, CD62LHICD44HI; agotada, PD1+). Se muestran las frecuencias de (A) células TC vírgenes, (B) células TC efectoras, (C) células TC de memoria y (D) células TC agotadas en el bazo (columna izquierda), pulmón (columna central) y sangre (columna derecha). ), como bloqueo de células CD45+ individuales vivas. Los cuadros representan datos de 3 ratones por grupo; los asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa entre las filas indicadas (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Entre los linajes innatos (ILC3, ILC1, células NK, monocitos y células Gr1), casi todos cambiaron en respuesta a la inmunización con BCG y/o BCGΔBCG1419c, el grado en que varió entre bazo, pulmón y sangre (Fig. 3). En todos los tejidos, las frecuencias de células NK disminuyeron después de la inmunización con BCG o BCGΔ1419c (Fig. 3C), mientras que las frecuencias de ILC1 no cambiaron (Fig. 3B). Otros cambios fueron específicos del tejido: mientras que las frecuencias de las ILC3 del bazo, los monocitos y las células Gr1 no se vieron afectadas por la inmunización, sus frecuencias disminuyeron en el pulmón de los animales inmunizados con BCG o BCGΔBCG1419c (Figs. 3A, D, E). Las únicas frecuencias innatas que se vieron afectadas positivamente por la inmunización fueron los monocitos sanguíneos en animales inmunizados con BCGΔBCG1419c (Fig. 3D) y células Gr1 sanguíneas en animales inmunizados con BCG (Fig. 3E). En conjunto, estos datos demuestran que la inmunización con BCG y BCGΔBCG1419c tiene efectos generalmente negativos en la frecuencia de células innatas en el bazo y los pulmones, pero efectos únicos en las frecuencias de monocitos y células Gr1 en la sangre.

Las células T αβ convencionales son fundamentales para la eficacia a largo plazo de la vacunación con BCG27,28 y, aunque históricamente se ha considerado que las células B son prescindibles para la eficacia de BCG, su presencia puede dar forma a la respuesta de las células T de forma independiente a los anticuerpos29,30. Las frecuencias de células T CD4+ y CD8+ de pulmón aumentaron en animales inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c, con las correspondientes disminuciones en el bazo y la sangre (probablemente como consecuencia de la redistribución de células T de la circulación) (Fig. 4A, B); la capacidad de BCG administrado por vía subcutánea para aumentar el número de células T pulmonares se ha informado previamente31. La respuesta de las células B a la inmunización también fue específica del tejido: aunque no se observaron diferencias en el pulmón o la sangre entre los grupos, se observaron frecuencias de células B aumentadas en los bazos de BCG y BCGΔBCG1419c -inmunizados en comparación con los controles de PBS (Fig. 4C). En conjunto, estos datos demuestran que la inmunización con BCG y BCGΔBCG1419c provoca aumentos similares en las frecuencias de células T de pulmón y células B de bazo.

Un componente importante de la inmunidad mediada por BCG es la capacidad de las células T para el desarrollo de la memoria. A diferencia de otros modelos de infección pulmonar, la inmunidad mediada por BCG se encuentra dentro de las células T que mantienen un fenotipo de superficie ingenuo y sin experiencia con antígenos31. Mostrado en las Figs. 5, 6, respectivamente, son las frecuencias de las células T CD4 y CD8 que exhiben un fenotipo superficial ingenuo (CD62LHICD44LO), efector (CD62LLOCD44HI) y memoria central (CD62LHICD44HI). También se examinó la frecuencia de células TH foliculares (es decir, células Tfh).

En relación con los controles de PBS, proporciones más altas de células T CD4 de pulmón en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c expresaron un fenotipo de superficie ingenua (Fig. 5A) o un fenotipo de superficie de memoria (Fig. 5C), con las correspondientes disminuciones en el bazo y la sangre. BCG y BCGΔBCG1419c provocaron disminuciones significativas en las frecuencias de células TH efectoras de sangre (Fig. 5B) y Tfh de bazo (Fig. 5E); sin embargo, y curiosamente, BCG y BCGΔBCG1419c tuvieron efectos diferentes en la proporción de células TH efectoras de pulmón y agotadas: mientras que solo BCGΔBCG1419c provocó una disminución significativa en las frecuencias de células TH efectoras de pulmón (Fig. 5B), solo BCG provocó un aumento significativo en las células TH agotadas de pulmón. Frecuencias de células TH (Fig. 5D). Se observaron patrones similares en el compartimento de células T CD8 (TC): en el compartimento pulmonar, BCG y BCGΔBCG1419c provocaron un aumento de la frecuencia de células T CD8 con un fenotipo de superficie vírgen (y la correspondiente disminución en el bazo), así como disminuciones en frecuencias del efector CD8 en el pulmón y la sangre (Fig. 6). En conjunto, estos datos demuestran que, si bien tanto BCG como BCGΔBCG1419c provocan aumentos en la proporción de células T que se sabe que retienen la memoria, las células T provocadas por BCG tenían más probabilidades de tener un fenotipo agotado, y las células T provocadas por BCGΔBCG1419c tenían menos probabilidades de tener un fenotipo agotado. fenotipo efector.

Aunque no existe un correlato de citoquinas universalmente aceptado de la protección provocada por BCG contra la infección por M. tuberculosis32, la capacidad de los linfocitos para la secreción de IFNγ, IL17 y TNFα puede contribuir a la eficacia de la vacuna BCG33. Para comparar el perfil temprano de citocinas de los linfocitos provocados por BCG y BCGΔBCG1419c, se estimularon las mismas preparaciones celulares utilizadas para el análisis del fenotipo de superficie (Figs. 2, 3, 4, 5, 6) con un inmunógeno policlonal (PMA/ionomicina) y posteriormente se utiliza para la tinción de citoquinas intracelulares (ICS) de los compartimentos de linfocitos de células NK (Fig. 7), células T CD4 (Fig. 8) y células T CD8 (Fig. 9). Los resultados para cada compartimento se describen a continuación.

Producción de citoquinas de células NK en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Se inmunizaron sc ratones C57BL/6 con 104 CFU de BCG o BCGΔBCG1419c, o PBS como control; 18 días después, se prepararon células mononucleares de bazo, pulmón y sangre y se usaron para la tinción de citoquinas intracelulares, después de la estimulación con PMA/ionomicina. Se muestran (A) tinción representativa de IFNγ y (B) tinción representativa de TNFα de células mononucleares estimuladas y no estimuladas, células NK separadas; (C) Análisis de especias de células NK positivas simples (IFNγ+ y TNFα+) y positivas dobles (IFNγ+TNFα+) en el bazo, pulmón y sangre.

Producción de citoquinas de células T CD4 en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Se inmunizaron sc ratones C57BL/6 con 104 CFU de BCG o BCGΔBCG1419c, o PBS como control; 18 días después, se prepararon células mononucleares de bazo, pulmón y sangre y se usaron para la tinción de citoquinas intracelulares, después de la estimulación con PMA/ionomicina. Se muestran (A) tinción representativa de IFNγ, (B) tinción representativa de TNFα y (C) tinción representativa de IL17 de células mononucleares estimuladas y no estimuladas, separadas de células T CD4; (D) Análisis de especia de positivo único (IFNγ+, TNFα+, IL17+), doble positivo (IFNγ+IL17+, IFNγ+TNFα+, IL17+TNFα+) y triple positivo (IFNγ+, TNFα+, IL17+) CD4 T células en el bazo, pulmón y sangre.

Producción de citoquinas de células T CD8 en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Se inmunizaron sc ratones C57BL/6 con 104 CFU de BCG o BCGΔBCG1419c, o PBS como control; 18 días después, se prepararon células mononucleares de bazo, pulmón y sangre y se usaron para la tinción de citoquinas intracelulares, después de la estimulación con PMA/ionomicina. Se muestran (A) tinción representativa de IFNγ y (B) tinción representativa de TNFα de células mononucleares estimuladas y no estimuladas, separadas de células T CD8; (C) Análisis de especias de células T CD8 positivas simples (IFNγ+ y TNFα+) y positivas dobles (IFNγ+TNFα+) en el bazo, pulmón y sangre.

Las frecuencias de células NK disminuyen después de la inmunización con BCG o BCGΔBCG1419c (Fig. 3C); sin embargo, el perfil de citocinas de los que quedan es distinto al de los controles con PBS, en la medida en que hay una expansión de células NK IFNγ+TNFα+ en bazo, pulmón y sangre de ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c (Fig. 7). Los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c tenían más células IFNγ+ individuales y los ratones inmunizados con BCG tenían más células IFNγ+ dobles TNFα+ en los pulmones, mientras que BCG indujo una mayor proporción de células IFNγ+ individuales y BCGΔBCG1419c una presencia más equilibrada de IFNγ+ único, TNFα único +, y células dobles de IFNγ+TNFα+ en sangre.

En la Fig. 8A–C se muestran nuestros perfiles de activación para identificar y enumerar las células TH capaces de secretar IFNγ (Fig. 8A), IL17 (Fig. 8B) y TNFα (Fig. 8C) en respuesta a la estimulación policlonal. Con base en estos datos de citometría de flujo, pudimos distinguir 7 células TH productoras de citoquinas: aquellas que fueron positivas simples para una citoquina individual (es decir, IFNγ+, IL17+ o TNFα+), doblemente positivas para dos citoquinas (IFNγ+IL17+, IFNγ+TNFα+, IL17+TNFα+), o triple positivo para las tres citocinas (IFNγ+IL17+TNFα+). La proporción relativa de cada subconjunto entre las células TH CD4+ productoras de citoquinas se representa en la Fig. 8D para el bazo, pulmón y sangre de cada grupo experimental. Al inicio del estudio (es decir, en ratones de control con PBS), las células TH productoras de citoquinas en todos los tejidos eran principalmente TNFα+, con diferencias específicas de tejido en las que los subconjuntos eran de abundancia secundaria (bazo: IFNγ+TNFα+; pulmón y sangre: IFNγ+) . En el bazo, la inmunización con BCG amplió la representación de células IFNγ+IL17+TNFα+; curiosamente, la expansión de IFNγ+IL17+TNFα+ no fue tan grande en animales inmunizados con BCGΔBCG1419c y estuvo acompañada por una contracción de IFNγ+TNFα+ (Fig. 8D, fila superior). Se observó una contracción similar de células TH IFNγ+TNFα+ en la sangre en relación con los animales inmunizados con BCG (Fig. 8D, fila inferior). En el pulmón, BCG y BCGΔBCG1419c dieron como resultado de manera similar una expansión de IFNγ+IL17+TNFα+ e IFNγ+TNFα+, y una contracción de IFNγ+. Las células IL17+TNFα+ también aparecieron en pulmón BCG y BCGΔBCG1419c en relación con PBS. En conjunto, nuestro análisis de los perfiles de citoquinas de las células TH sugiere que la inducción de poblaciones sistémicas de IFNγ+IL17+TNFα+ e IFNγ+TNFα+ fue menos sólida en los animales inmunizados con BCGΔBCG1419c, en relación con los animales inmunizados con BCG, aunque en los pulmones, los animales inmunizados con BCGΔBCG1419c los animales aumentaron la presencia de poblaciones de IFNγ+IL17+ e IFNγ+TNFα+ que BCG; sin embargo, ninguna de las tendencias anteriores fue estadísticamente significativa.

En la Fig. 9A, B se muestran nuestros perfiles de activación para identificar y enumerar las células TC capaces de secretar IFNγ (Fig. 9A) y TNFα (Fig. 9B) en respuesta a la estimulación policlonal; a diferencia de las células T CD4, no se detectaron células T CD8 que expresan IL17. En los controles de PBS, las células T CD8 productoras de citocinas en el bazo eran principalmente TNFα+ y, en segundo lugar, IFNγ+; en respuesta a la inmunización con BCG y BCGΔBCG1419c, la proporción de células T CD8 que eran TNFα+ se expandió aún más junto con IFNγ+TNFα, a expensas de las células T CD8+IFNγ. Se observaron expansiones similares de células TNFα+ e IFNγ+ TNFα+ (y contracciones acompañantes de células T CD8 IFNγ+) en el pulmón y la sangre de animales inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c. Similar a lo que observamos para las células NK, los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c tenían más células IFNγ+ simples y los ratones inmunizados con BCG tenían más células IFNγ+TNFα+ dobles en los pulmones; sin embargo, al igual que con las células TH, ninguna de las diferencias anteriores entre los animales inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c fue estadísticamente significativa.

IL10 suprime la diferenciación TH1/TH17 después de la inmunización con BCG34. En el día 18 posterior a la inmunización, BCGΔBCG1419c tendió (aunque de manera insignificante) a provocar menos células TH productoras de IFNγ e IL17 (Fig. 8D), así como un mayor alejamiento del fenotipo TH "efector" más proinflamatorio. (Figura 5B); por lo tanto, predijimos que los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c tendrían frecuencias más altas de células productoras de IL10 sistémicas antes del día 18, en relación con los ratones inmunizados con BCG. Expresión de IL1026, lo que permite la identificación de células productoras de IL10 mediante tinción de citometría de flujo con anti-Thy1.1 (Fig. 10A). Los ratones VertX se inmunizaron con BCG o BCGΔBCG1419c de manera idéntica a la utilizada para los ratones C57BL/6; el bazo se extrajo 14 días después de la inmunización. Los resultados de este estudio se muestran en la Fig. 10 y demuestran que BCGΔBCG1419c provoca frecuencias más altas de células IL10+ en el bazo (Fig. 10B), y que una mayor proporción de estas células IL10+ eran células T CD4+ y células T CD8+ (Fig. 10C). En general, estos datos demuestran que BCGΔBCG1419c provoca frecuencias más altas de células T productoras de IL10, lo que puede explicar una menor respuesta inflamatoria de los animales inmunizados con BCGΔBCG1419c en relación con los animales inmunizados con BCG de tipo salvaje.

La inmunización con BCGΔBCG1419c provoca una mayor frecuencia de células T productoras de IL10. Los ratones indicadores de IL10 se inmunizaron sc con 104 CFU de BCG o BCGΔBCG1419c; 14 días más tarde, los esplenocitos de cada grupo se tiñeron para Thy1.1 (el transgén informador de la producción de IL10) y los marcadores de células T CD4 y CD8. Se muestran (A) dispersión lateral representativa (SSC) y tinción Thy1.1 de ratones inmunizados con BCG, (B) la frecuencia de esplenocitos IL10+ en ratones inmunizados con BCG y BCGΔBCG1419c (media + DE; 3 ratones por grupo), y (C) la proporción relativa de células IL10+ que son células T CD4, células T CD8 o células no T. Los asteriscos representan una diferencia estadísticamente significativa entre la comparación indicada (*p ≤ 0,05).

La BCG fue desarrollada como vacuna contra la TB a principios del siglo XX por Calmette y Guerin, luego de pases en serie de M. bovis durante once años (~ 230 pases) en rodajas de patata embebidas en bilis35. En relación con M. bovis, la cepa resultante (es decir, BCG) fue avirulenta en múltiples especies animales y no pudo causar tuberculosis. Ahora sabemos que esta atenuación se debe en parte a la pérdida de tres regiones genómicas de diferencia (RD1, RD2 y RD3) que codifican varios factores de virulencia (p. ej., ESX)36. A pesar de varios inicios y paradas debido a problemas de seguridad, los ensayos de BCG en humanos avanzaron en varios países (Reino Unido, EE. UU., India) con conclusiones diferentes con respecto a su eficacia protectora, que varía de 0 a 80 % según el estudio37. Todavía un tema de debate, las razones de la eficacia variable de BCG en diferentes países y poblaciones incluyen diferentes métodos de preparación, deriva genética a lo largo del tiempo y micobacterias ambientales que confieren cierta protección contra la TB y, por lo tanto, enmascaran cualquier efecto de BCG38. Independientemente de la(s) razón(es), existe un acuerdo casi universal de que, a pesar del éxito de la BCG, se necesita una vacuna contra la TB con mayor eficacia para cumplir con los puntos de referencia de la OMS para reducir la prevalencia de la TB5. En parte debido a la falta de eficacia total de la BCG actual, se cree que aproximadamente 2 000 millones de personas albergan una infección latente por M. tuberculosis (LTBI). Se ha estimado que para 2050, hasta el 75% por ciento de los nuevos casos de TB se deberán a la reactivación de LTBI, en lugar de nuevas infecciones, en China, uno de los países con el mayor número de casos de TB (incluyendo MDR-TB) 39. De hecho, un modelo que incluye datos de China, Sudáfrica e India sugirió que las vacunas que previenen la enfermedad en las poblaciones infectadas por M. tuberculosis tendrían el mayor impacto para 2050 (10 años, 70 % de eficacia contra la enfermedad, reducción de la tasa de incidencia 51%, 52% y 54% en China, Sudáfrica e India, respectivamente)40.

Como muchas especies de micobacterias, BCG es capaz de formar biopelículas que afectan el comportamiento in vitro y la persistencia in vivo. Los biofilms comprenden una comunidad de bacterias rodeadas por una matriz extracelular producida por las especies constituyentes, generalmente son más resistentes al estrés ambiental y permiten la persistencia en reservorios ambientales y biomateriales41. In vitro, la formación de biopelículas de micobacterias se manifiesta como películas en la interfaz medio-aire42,43, que en BCG siguen un programa genético definido44. Las películas tienen un perfil transcripcional alterado en relación con las bacterias planctónicas y están enriquecidas en células persistentes o resistentes a los antibióticos45,46,47. La contribución in vivo de la formación de biopelículas de micobacterias a la enfermedad pulmonar es a menudo un tema de debate, ya que su presencia no es evidente en el examen histopatológico de los pulmones infectados (p. ej., mediante tinción acidorresistente), y la patogenia de las micobacterias implica la supervivencia intracelular dentro de los fagocitos alveolares (en menos durante las primeras fases de la enfermedad) en lugar de la supervivencia extracelular en las superficies de las vías respiratorias, que es más típica de Pseudomonas aeruginosa y otros patógenos canónicos formadores de biopelículas. Dicho esto, las micobacterias que son deficientes en la formación de biopelículas, ya sea debido a la manipulación genética o a la variación natural, generalmente exhiben una virulencia atenuada y provocan diferentes respuestas inflamatorias durante los modelos de infección in vivo42,48. Por lo tanto, nuestra comprensión de la relación entre la formación de biopelículas y la patogénesis de las micobacterias está lejos de ser completa.

La cepa BCGΔBCG1419c se generó en parte para probar la relación entre la capacidad de BCG para formar biopelículas y su eficacia como vacuna20. El gen BCG1419c codifica una di-GMP fosfodiesterasa cíclica (PDE) que normalmente funciona para hidrolizar Bis-(3′-5′)-GMP dimérico cíclico (c-di-GMP), un segundo mensajero que promueve la fase de biopelícula del crecimiento bacteriano49 . En ausencia de BCG1419c, el mutante por deleción BCGΔBCG1419c exhibe una morfología de colonia alterada, una mayor producción de biopelículas y una mayor supervivencia en los pulmones y el bazo de ratones inmunocompetentes, en relación con BCG parental o mutantes complementados20 cuando se utiliza para la infección intravenosa de ratones BALB/c. En relación con los controles inmunizados con BCG y 6 meses después de la exposición a Mtb, los inmunizados con BCGΔBCG1419c también muestran puntuaciones histopatológicas pulmonares significativamente reducidas, así como niveles reducidos de proteína IL6 y TNFα pulmonar15. Dado que la IL-6 y el TNF-α pueden contribuir a la patología pulmonar en entornos de enfermedades crónicas, estos datos implican que la hidrólisis de c-di-GMP dependiente de BCG1419c condiciona la respuesta a la TB a largo plazo de los animales vacunados. Es importante destacar que el segundo mensajero bacteriano c-di-GMP es un ligando para la vía de señalización de los genes del estimulador de interferón (IFN) (STING) a través de la cascada del factor regulador de interferón 3 (IRF3) de la quinasa-1 de unión al tanque (TBK1), que da como resultado la producción de citocinas mediadas por IFN tipo I y NF-κB50,51. Estos agonistas de STING han mostrado un uso potencial como nuevos adyuvantes de vacunas, como lo demuestran sus propiedades inmunoestimuladoras, debido a su capacidad para aumentar las respuestas humorales y de células T específicas de antígeno52,53. Debido a la eliminación del gen BCG1419c54,55 que codifica la fosfodiesterasa c-di-GMP, esperamos que la vacuna candidata BCGΔBCG1419c produzca más c-di-GMP, modulando así la respuesta del IFN tipo I para posiblemente aumentar su eficacia contra la TB. Además de esto, BCGΔBCG1419c tiene un repertorio proteómico modificado en comparación con el BCG original, que incluye cambios en las proteínas antigénicas secretadas y celulares54 que también podrían conducir a una respuesta inmunitaria diferencial que, en última instancia, impactaría de manera positiva en la protección contra la TB pulmonar.

Dado que los ratones inmunizados con BCGΔBCG1419c tienen menos patología pulmonar después del desafío con TB, lo que sugiere una mejora para prevenir la enfermedad, realizamos el estudio anterior para determinar si hay eventos inmunológicos tempranos que coincidan con sus efectos a largo plazo. Nuestros resultados demuestran que, si bien existen muchas similitudes en la respuesta innata y adaptativa temprana a BCG y BCGΔBCG1419c, también existen diferencias notables en los compartimentos innato y adaptativo. Entre los linajes innatos, mientras que tanto BCG como BCGΔBCG1419c provocaron fuertes reducciones en la frecuencia de células NK en todos los tejidos examinados (Fig. 3C), solo BCGΔBCG1419c provocó aumentos significativos en los monocitos circulantes (Fig. 3D) y reducciones en las células Gr1 de pulmón (Fig. 3E) . Entre los linajes adaptativos, tanto BCG como BCGΔBCG1419c provocaron aumentos significativos en las frecuencias de células T CD4+ pulmonares (Fig. 4A), los inducidos por BCG tenían más probabilidades de exhibir un fenotipo agotado en relación con los inducidos por BCGΔBCG1419c (Fig. 5D). Las células T CD4 provocadas por BCGΔBCG1419c también tenían menos probabilidades de exhibir un fenotipo efector proinflamatorio (Fig. 5B). Es importante destacar que la respuesta de las células T CD4 y CD8 provocada por BCGΔBCG1419c también tenía más probabilidades de contener células productoras de IL10 (Fig. 10C), lo que puede ser la base de la naturaleza menos inflamatoria de BCGΔBCG1419c durante las etapas crónicas de la TB, ya que la IL10 suprime a través de la presentación del antígeno, a través de la retención. de péptido micobacteriano:complejos MHC-II en fracciones endosómicas (lejos de la superficie celular)56 y/o regulación negativa de la expresión de moléculas coestimuladoras57,58. Hemos demostrado que BCGΔBCG1419c produjo menos DnaK, HbhA, PstS2, antígeno 35KDa y AcpM (una proteína involucrada en la síntesis de ácidos micólicos) en cultivos de biopelículas en comparación con BCG14 original, lo que posiblemente contribuya a su naturaleza menos inflamatoria. Todavía queda por determinar si la respuesta inmunitaria provocada por BCGΔBCG1419c difiere de la provocada por BCG debido a la presentación prolongada de antígenos o a los perfiles de lípidos alterados, que contribuyen a la inmunogenicidad de las micobacterias59.

Al igual que con cualquier respuesta inflamatoria impulsada por bacterias, el huésped inmunizado con BCG debe equilibrar la generación de una inmunidad robusta con el potencial de efectos perjudiciales no específicos de la producción excesiva de citoquinas. Aquí, utilizamos el modelo de ratón para demostrar que los eventos inmunológicos tempranos asociados con la inmunización con BCGΔBCG1419c son menos inflamatorios en relación con BCG. Esto es importante porque la eficacia de BCGΔBCG1419c para controlar la replicación de M. tuberculosis en los pulmones es comparable o superior a la de BCG y ofrece más protección contra la inmunopatología asociada a la TB en ratones. Dada la reactogenicidad de BCG en individuos inmunizados, que comúnmente se manifiesta como fiebre, dolor de cabeza e inflamación de los ganglios linfáticos, el perfil inmunológico único de BCGΔBCG1419c puede resultar importante en regiones endémicas de TB donde los padres de niños pequeños dudan cada vez más en la administración de vacunas antiinflamatorias, independientemente de la eficacia de la vacuna9 ,10,11,12.

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Este trabajo fue apoyado por la Universidad Estatal de Ohio (OSU), los Institutos Nacionales de Salud (R01 AI134972 a KJO; K22 AI127072 a NPML; R01 AI121212 a RTR) y CONACYT Grant 86396 (a MAFV y MJAS) permitió la construcción del BCGΔBCG1419c cepa.

Departamento de Infección Microbiana e Inmunidad, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Manuja Gunasena, Rajni Kant Shukla, Naiquan Yao, Oscar Rosas Mejia, Michael D. Powell, Kenneth J. Oestreich, Namal PM Liyanage y Richard T. Robinson

Universidad Agrícola de Jilin, Changchun, Jilin, China

Naiquan Yao

Biotecnología Médica y Farmacéutica, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, Av. Normalistas 800, Col. Colinas de la Normal, 44270, Guadalajara, Mexico

Michel de Jesús Aceves-Sánchez & Mario Alberto Flores-Valdez

Departamento de Biociencias Veterinarias, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Namal PM Liyanage

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Todos los autores participaron en la realización, análisis y descripción de los experimentos, manuscrito y figuras asociadas.

Correspondencia a Mario Alberto Flores-Valdez, Namal PM Liyanage o Richard T. Robinson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gunasena, M., Shukla, RK, Yao, N. et al. Evaluación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas tempranas a la vacuna contra la tuberculosis Mycobacterium bovis BCG y la vacuna candidata BCGΔBCG1419c. Informe científico 12, 12377 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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Recibido: 29 de octubre de 2021

Aceptado: 03 mayo 2022

Publicado: 20 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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