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Oct 25, 2023

Susceptibilidad comparativa del SARS

Revista ISME volumen 17,

The ISME Journal volumen 17, páginas 549–560 (2023) Citar este artículo

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La exploración de reservorios silvestres de virus patógenos es fundamental para su control a largo plazo y para predecir futuros escenarios pandémicos. Aquí, primero se realizó un análisis de infección in vitro comparativo en 83 cultivos celulares derivados de 55 especies de mamíferos utilizando virus pseudotipados que portan proteínas S de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Se descubrió que los cultivos celulares de murciélagos de herradura de Thomas, murciélagos de herradura rey, monos verdes y hurones son altamente susceptibles a los virus pseudotipados SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Además, cinco variantes (del69-70, D80Y, S98F, T572I y Q675H), que además del dominio de unión al receptor de pico, pueden alterar significativamente el tropismo del huésped del SARS-CoV-2. Un examen de las señales filogenéticas de las tasas de transducción reveló que los taxones estrechamente relacionados generalmente tienen una susceptibilidad similar al MERS-CoV pero no a los virus pseudotipados SARS-CoV y SARS-CoV-2. Además, descubrimos que la expresión de 95 genes, por ejemplo, PZDK1 y APOBEC3, se asociaba comúnmente con las tasas de transducción de los virus pseudotipados SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2. Este estudio proporciona documentación básica de la susceptibilidad, las variantes y las moléculas que subyacen a la transmisión entre especies de estos coronavirus.

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) ha representado una amenaza considerable para la salud pública y la economía mundial, con más de 500 millones de casos de infección humana y más de 6,6 millones de muertes en todo el mundo hasta enero de 2023. SARS-CoV- 2 se especuló que se originó en murciélagos y luego saltó a la población humana a través de un huésped animal intermedio [1,2,3]. Aunque virus similares al SARS-CoV-2, como BANAL-20-52 derivado del murciélago de herradura de Malasia (Rhinolophus malayanus), RaTG13 derivado del murciélago de herradura intermedio (Rhinolophus affinis) y Pangolin-CoV presente en los pangolines de Malasia (Manis avania) [4,5,6], en la actualidad el origen animal exacto del SARS-CoV-2 sigue sin estar claro. Otros dos coronavirus que causaron epidemias antes de la COVID-19 son el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), que posiblemente se propagó de los murciélagos de herradura a los humanos a través de las civetas de palma infectadas, y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), que fue posiblemente un contagio de murciélagos a humanos a través de camellos dromedarios infectados [7,8,9]. Aunque la amenaza actual tanto del SARS-CoV como del MERS-CoV es mínima, debemos estar atentos a los posibles riesgos de contagio a los seres humanos desde sus reservorios naturales [10, 11].

El SARS-CoV-2 puede infectar a un amplio espectro de huéspedes, incluidos perros, visones, hurones, nutrias, hámsteres, campañoles, ciervos, ratones ciervos, murciélagos, felinos pequeños y grandes y varios primates no humanos [12,13,–14 ]. Sin embargo, sigue siendo un desafío comparar la susceptibilidad de estas especies porque no se han empleado medidas estandarizadas entre especies. En este sentido, varios estudios han predicho la probabilidad de infección por SARS-CoV-2 mediante el análisis de ortólogos de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Por ejemplo, Damas et al. utilizó las secuencias ACE2 de 410 especies de vertebrados y encontró que ciertos taxones en peligro de extinción (p. ej., monos narigudos, monos narigudos, macacos rhesus y ballenas minke antárticas) tenían el mayor riesgo de infección por SARS-CoV-2 [15]. Al mismo tiempo, se han utilizado la resolución de la estructura cristalina, los análisis de resonancia de plasmones superficiales y las simulaciones de dinámica molecular para evaluar la afinidad de unión de diferentes ortólogos de ACE2 a las proteínas de punta [15,16,–17]. Si bien estos estudios brindan información valiosa sobre el probable rango de huéspedes del SARS-CoV-2, sus predicciones requieren validación experimental. Además, los efectos de los factores del huésped distintos de ACE2 asociados con la invasión viral se han subestimado en estas predicciones [15, 18, 19].

Los experimentos de infección animal brindan la mejor oportunidad para comprender la susceptibilidad, la patogenicidad y la transmisibilidad de los patógenos entre diferentes taxones [20,21,22,–23]. Sin embargo, no es práctico realizar estudios de inoculación in vivo en una amplia gama de especies, particularmente en la vida silvestre. Alternativamente, un ensayo de infección in vitro de diversas líneas celulares tiene el potencial de ofrecer información crítica sobre la infectividad del SARS-CoV-2 [24, 25]. Por ejemplo, Chu et al. evaluó la cinética de replicación y los efectos citopáticos de 25 líneas celulares derivadas de diferentes especies. Demostraron que el SARS-CoV-2 puede replicarse en células de primates no humanos, gatos, conejos y cerdos [24]. En otro estudio, se recolectaron células epiteliales de las vías respiratorias de 12 especies animales y se descubrió que el SARS-CoV-2 se replicaba de manera eficiente en modelos de cultivo de monos y gatos [25]. Aparte de la demanda de ensayos celulares para evaluar el espectro potencial del huésped, también es urgente explorar cómo las mutaciones pueden afectar tanto la infectividad como la transmisibilidad del SARS-CoV-2 a diferentes especies. La continua evolución adaptativa del SARS-CoV-2 ha resultado en la rápida aparición de nuevas mutaciones; sin embargo, aún se desconoce cuántas de estas mutaciones han aumentado la susceptibilidad de los animales al SARS-CoV-2.

Aquí, primero evaluamos el rango potencial de huéspedes de SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 utilizando virus pseudotipados y cultivos celulares derivados de 55 especies de mamíferos. La capacidad de las mutaciones del sitio en las proteínas S para afectar el rango de huéspedes del SARS-CoV-2 se determinó mediante mutagénesis dirigida al sitio. Luego empleamos un enfoque de transcriptómica comparativa para identificar las expresiones génicas que estaban asociadas con la susceptibilidad de las especies a estos virus. Este estudio proporciona nueva información sobre el posible tropismo del huésped del SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2. Además, descubrimos la expresión de factores del huésped que probablemente afecten la transmisión entre especies del SARS-CoV-2 y eviten el futuro contagio de estos coronavirus de humanos a otras especies.

Para mejorar la reproducibilidad de este estudio, siempre que fue posible, tomamos muestras de machos adultos jóvenes sanos de cada especie para reducir los efectos del sexo, la edad, la inmunidad y los factores relacionados. Para recapitular las células con la susceptibilidad más alta, aislamos cultivos celulares primarios utilizados en este estudio (Tabla S1) de múltiples tejidos (es decir, riñón, pulmón, cerebro, bazo y corazón) de mascotas, ganado y animales silvestres según protocolos previamente descrito [26]. Los animales fueron sacrificados usando CO2 o pentobarbital cálcico (200 mg/kg). Los cadáveres fueron disecados, seguidos de la recolección de riñones, pulmones, corazones, bazos o cerebros en condiciones asépticas. Para evitar el secado, todos los tejidos se colocaron en PBS estéril suplementado con una solución de penicilina-estreptomicina al 2% (Gibco, EE. UU.) hasta la extracción celular. Cada tejido se transfirió a un plato de 35 mm y se picó en pedazos diminutos usando unas tijeras de disección. Los fragmentos de tejido se transfirieron adicionalmente a un tubo cónico de 50 ml, seguido de digestión enzimática utilizando EDTA-tripsina al 0,25 % (Gibco, EE. UU.) a 37 °C durante 30 min. Durante la digestión, la mezcla se agitó vigorosamente cada 10 min. La digestión con tripsina se detuvo mediante la adición de FBS en el tubo cónico. La mezcla que contenía fragmentos de tejido se pipeteó hacia arriba y hacia abajo durante 3 min usando una pipeta de 5 ml para romper los grumos. La solución resultante se centrifugó a 250 g durante 5 min a 4 °C. A continuación, se recogieron células sedimentarias, se resuspendieron, se contaron y se sembraron en placas de Petri de 100 mm. Todas las placas se colocaron a 37 °C con 5% de CO2. Las células se comprobaron diariamente en cuanto a crecimiento celular y contaminación. Se realizaron pases celulares regulares cuando las células alcanzaron la confluencia. Todas las células primarias se aislaron y cultivaron en DMEM-F12 con FBS al 10 %, una solución de penicilina-estreptomicina al 1 % y HEPES 20 mM. Todos los experimentos se realizaron en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) y fueron aprobados por el Comité de ética animal del Instituto de Zoología de la Academia de Ciencias de China (permiso n.º: IOZ-IACUC-2021-163).

Líneas celulares que incluyen Huh-7 (Homo sapiens, hígado), A549 (Homo sapiens, pulmón), SW480 (Homo sapiens, colon), HEK-293T (Homo sapiens, riñón embrionario), Vero-E6 (Cercopithecus aethiops, riñón), Marc-145 (Cercopithecus aethiops, riñón), OK (Monodelphis domestica, riñón), BHK-21 (Mesocricetus auratus, riñón), SP2/0 (Mus musculus, células de mieloma), NIH3T3 (Mus musculus, embrión), MDBK (Bos taurus, riñón), PK-15 (Sus scrofa, riñón), MDCK (Canis familiaris, riñón), F81 (Felis catus, riñón) y Mv.1.lu (Neovison vison, pulmón) se cultivaron células en DMEM. Las líneas celulares HT-29 (Homo sapiens, colon) se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco, EE. UU.). Las líneas celulares NEF (rata topo desnuda, embrión) se cultivaron en DMEM-F12. Las líneas de células de murciélago inmortalizadas PaKi (Pteropus alecto, riñón), PaLu (Pteropus alecto, pulmón) y PaBr (Pteropus alecto, cerebro) fueron proporcionadas amablemente por la Dra. Linfa Wang (Escuela de Medicina de Duke-NUS) y cultivadas en DMEM-F12 . Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % utilizando medios de cultivo específicos que se complementaron con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco, EE. UU.), una solución de penicilina-estreptomicina al 1 % e hidroxietilpiperazina etano 20 mM. ácido sulfónico (HEPES, Gibco, EE. UU.).

pVSV-eGFP-dG (Addgene n.° 31842), pCAG-VSVN (Addgene n.° 64087), pCAG-VSVP (Addgene n.° 64088), pCAG-VSVL (Addgene n.° 64085), pCAG-VSVG (Addgene n.° 64084) y pCAG- Los plásmidos T7pol (Addgene #59926) se adquirieron de Addgene. Genes S humanos con codón optimizado de SARS-CoV (SARS coronavirus Tor2, número de acceso de GenBank NC_004718.3), SARS-CoV-2 (SARS coronavirus 2 Wuhan-Hu-1, número de acceso de GenBank NC_045512.2) y MERS -CoV (MERS coronavirus HCoV-EMC, número de acceso de GenBank NC_019843.3) se sintetizaron y clonaron en un vector pcDNA3.1 para la generación de virus pseudotipados. Los plásmidos construidos se denominaron pcDNA3.1-SARS-S, pcDNA3.1-SARS2-S y pcDNA3.1-MERS-S, respectivamente. La expresión de proteínas S en células HEK-293T se verificó mediante Western Blot. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando pcDNA3.1-SARS2-S como plantilla. Los cebadores directos se diseñaron con una Tm de ~75 °C y las mutaciones se centraron en el medio, mientras que las secuencias complementarias inversas de correspondencia se seleccionaron como cebadores inversos. Se preparó un volumen de 20 μL de mezcla PCR para contener 10 μL 2x Phanta Max Master Mix (Vazyme, PR China), 10 pmol de cebadores directos e inversos y 10 ng de plásmido molde. Después de 20 ciclos de PCR de mutagénesis dirigida al sitio, el plásmido molde se digirió utilizando la endonucleasa de restricción DpnI (NEB, EE. UU.). Posteriormente, el producto de la PCR se transformó en células competentes de E. coli DH5a (Transgen, PR China). Se seleccionaron y secuenciaron clones individuales. Todos los plásmidos se extrajeron con el kit QIAGEN Plasmid Maxi (Qiagen, EE. UU.). Para evitar la introducción de contaminación en el cultivo celular durante la generación de virus pseudotipados, los plásmidos extraídos se inactivaron en un baño de agua a 65 °C durante 30 min. Las concentraciones de plásmidos se cuantificaron utilizando Nanodrop2000 (Thermo Scientific, EE. UU.).

Primero, rescatamos el virus VSVΔG*-G según los métodos desarrollados en una publicación anterior [27]. En detalle, las células HEK-293T con un 80 % de confluencia se cotransfectaron con los plásmidos pVSV-eGFP-dG, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAG-VSVG y pCAG-T7pol con una proporción de 10, 3 , 5, 1, 3 y 5 μg, respectivamente, usando Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Lituania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El líquido sobrenadante se recogió 48 h después de la transfección y la mitad del líquido se asignó para infectar una segunda placa de células HEK-293T transfectadas con el plásmido pCAG-VSVG. Las células HEK-293T se examinaron mediante microscopía de fluorescencia para determinar la expresión de EGFP 24 h después de la infección. La titulación del virus VSVΔG*-G se cuantificó mediante la infección de células HEK-293T, seguida de análisis de citometría de flujo para una señal positiva de EGFP.

En segundo lugar, construimos virus pseudotipados incorporados con proteínas S de SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 utilizando un protocolo informado en investigaciones anteriores [28]. Las células HEK-293T con una confluencia del 70% al 90% se transfectaron con 15 μg de plásmidos que codifican las proteínas SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 S utilizando Lipofectamine 3000. Al mismo tiempo, se transfectaron o simularon plásmidos que codifican las proteínas VSV-G. -transfectado en linfocitos T 293 como control positivo o negativo. Las células transfectadas se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2. 24 h más tarde, las células se infectaron con virus VSVΔG*-G a MOI = 3–4 y se incubaron durante 2 h. Posteriormente, se descartó el sobrenadante celular y las células se enjuagaron suavemente con PBS tibio dos veces. Luego, se añadieron a las placas 10 ml de DMEM fresco suplementado con FBS al 10 %, una solución de penicilina-estreptomicina al 1 % y HEPES 20 mM, y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %. 24 h más tarde, estas células se comprobaron en busca de una señal positiva de EGFP y el líquido sobrenadante se recogió, centrifugó, filtró y dividió en alícuotas. Todos los virus pseudotipados se almacenaron a -80 °C. Se evitaron ciclos repetidos de congelación-descongelación.

Se usaron células Huh-7 para la cuantificación de virus pseudotipados generados. En detalle, las células Huh-7 se cultivaron un día antes de la cuantificación. Una vez que se alcanzó una confluencia del 80 %, las células se digirieron, cuantificaron y sembraron en una placa de 48 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se infectaron con una serie de 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2 y 1,6 μL de virus pseudotipados con tres repeticiones. Las células infectadas se colocaron a 37 °C con 5% de CO2. 24 h después de la infección, estas células se examinaron usando un microscopio de fluorescencia, seguido de cuantificación de citometría de flujo para células positivas para EGFP. Los virus pseudotipificados se titularon (unidades de transducción, TU) contando las células individuales infectadas por los virus pseudotipificados. La concentración final de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS fue de 4,85 × 106 TU/ml, 5,54 × 106 TU/ml y 1,14 × 107 TU/ml, respectivamente.

Para mejorar la reproducibilidad de esta investigación, se usaron pases P3 y P4 de cultivos celulares primarios para la infección in vitro de virus pseudotipados. Los cultivos celulares se sembraron en placas de 48 pocillos (10.000 células por pocillo), se cultivaron en DMEM-F12 complementado con FBS al 10 %, una solución de penicilina-estreptomicina al 1 % y HEPES 20 mM. Cuando las células alcanzaron el 70% de confluencia, se desecharon los sobrenadantes del cultivo. Las células se enjuagaron dos veces usando un tampón PBS tibio complementado y una solución de penicilina-estreptomicina al 1%. Los cultivos celulares se infectaron con virus seudotipados, incluidos virus seudotipados que portaban proteínas S de tipo salvaje y mutadas, glicoproteínas VSV-G y control negativo (sobrenadante de cultivo recolectado de células transfectadas de forma simulada). Cada experimento de infección tenía tres réplicas independientes. Los virus se mantuvieron en el medio de cultivo suplementado con FBS al 1 % y una solución de penicilina-estreptomicina al 1 % durante 24 h, seguido de observación microscópica y análisis de citometría de flujo para células positivas para GFP. Para VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-SARS2, los cultivos celulares se infectaron a una MOI = 0,15 (referido a células Huh-7). Para VSVΔG*-MERS, los cultivos celulares se infectaron a MOI = 0,3 (referido a células Huh-7). No se observó correlación entre las tasas de transducción de VSVΔG*-noG y VSVΔG*- SARS2 (cor = −0,0637, p > 0,05), entre VSVΔG*-noG y VSVΔG*-SARS (cor = −0,0324, p > 0,05), y entre VSVΔG*-noG y VSVΔG*-MERS (cor = −0,0723, p > 0,05).

Debido a que la dosis de infección que transduce el mismo porcentaje de células no refleja la misma cantidad de partículas virales, y la misma cantidad de partículas virales de virus seudotipados que portan diferentes proteínas S mutadas no infecta las células con la misma eficiencia, es difícil ajuste los virus pseudotipados en la misma dosis de infección cuando las células están infectadas por virus pseudotipados que portan proteínas SARS-CoV-2 S mutadas. Y, aunque intentamos cuantificar virus pseudotipados por RT-qPCR, encontramos que los resultados contenían errores sistemáticos elevados debido a 1) la falta de genes de referencia razonables; 2) el hecho de que las eficiencias de extracción de ARN varían entre diferentes virus; 3) el error inducido por las tecnologías qPCR; y 4) la concentración de producción de virus pseudotipados no era idealmente estable. Por lo tanto, usamos un volumen de 75 μL de virus pseudotipados para infectar cada cultivo celular en cada prueba de infección celular.

Las células infectadas o simuladamente infectadas con virus pseudotipados se observaron mediante un microscopio fluorescente. Después de desechar el medio de cultivo, las células se enjuagaron dos veces en PBS tibio, seguido de una digestión con EDTA al 0,25 %-tripsina durante 5 min. Luego, las células se recogieron en tubos de 1,5 ml. Las células se lavaron dos veces con PBS para eliminar la tripsina y se filtraron con un filtro de células de 70 μm (BD Falcon, EE. UU.) para eliminar los grumos de células. Las células finales se colocaron en hielo en una cámara oscura. Se realizaron análisis de citometría de flujo (CytoFLEX, Beckman Coulter, EE. UU.). Se usaron células infectadas con virus VSV△G*−G o control negativo para optimizar el voltaje de los detectores FSC, SSC y FITC, y para cuantificar las poblaciones de células en busca de partículas positivas o negativas. Para cada ensayo de infección, se introdujeron al menos 5000 células en total. El porcentaje de tasas de transducción se mostró como media ± SD en base a tres réplicas independientes.

La interfaz entre el RBD de la proteína S del SARS-CoV-2 y los ortólogos de ACE2 de diferentes especies se examinó mediante simulaciones de dinámica molecular (MD) utilizando Amber 20 [29,30,–31]. Primero descargamos las secuencias de aminoácidos de la base de datos del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) o nuestro conjunto de datos de RNA-seq generado. La estructura cristalina de RBD-ACE2 (PDB ID: 6M0J) se descargó del Protein Data Bank [32] y sirvió como plantilla para preparar modelos 3D para los ortólogos SARS-CoV-2 S-RBD y ACE2 en SWISS-MODEL [33] . A continuación, cada sistema se comprobó por salto y se solvató en una caja periódica cúbica de agua TIP3P extendida en 10 Å del soluto. El sistema se neutralizó usando un número racional de contraiones de Na+ o Cl−, seguido de la parametrización usando un campo de fuerza Amber ff14SB [34]. A continuación, se realizaron 10 000 pasos de minimización de energía, incluidos 5000 pasos usando el método de descenso más pronunciado y 5000 pasos de minimización de gradiente conjugado. Luego, cada sistema se calentó a 300 K en el conjunto NVT por 0,2 ns. Las simulaciones de minimización, calentamiento y equilibrio se realizaron con fuertes restricciones (500 kcal/mol/Å2) en átomos pesados ​​con el programa Sander en Amber20. Las simulaciones MD de 30 ns se realizaron a temperatura constante a 300 K con conjunto NPT y pmemd.cuda. La temperatura del sistema se mantuvo utilizando la dinámica de Langevin. La distancia de corte entre la energía de Van der Waals y la energía electrostática de corto alcance fue de 10 Å. Se utilizó el método Ewald de malla de partículas para calcular las interacciones electrostáticas de largo alcance. Se extrajeron al menos 3000 instantáneas de la trayectoria de equilibrio para la estructura promedio final de cada complejo RBD-ACE2. Se utilizó el método MM/GBSA para calcular la energía libre de enlace (ΔG), y la energía libre de enlace se descompuso en la contribución de energía de cada residuo [35].

Exploramos si alguna variante de pico interactuó con un residuo ACE2 específico en función de la tasa de transducción entre especies. Para cada variante de pico, las líneas celulares/especies se clasificaron en dos grupos (grupos infectados alto y bajo, respectivamente) usando un método de agrupamiento de k-medias. Luego, en cada posición de 42 residuos clave de ACE2 estimados por simulación MD, el aminoácido con el número más alto se identificó como el residuo principal para esa posición y se calculó su frecuencia. Por último, se empleó la prueba exacta de Fisher para cuantificar si el residuo principal se distribuyó uniformemente entre los grupos de alta y baja infección. Un residuo con un valor p de la prueba exacta de Fisher inferior a 0,05 indica que la frecuencia del residuo difería significativamente entre los grupos de alta y baja infección. Esto implica que puede haber interactuado con una variante de pico.

Para mejorar aún más la reproducibilidad de este estudio, realizamos un análisis de RNA-seq para los cultivos celulares que se generaron. Los ARN totales de los cultivos celulares que se usaron para el análisis de infección in vitro se aislaron usando el reactivo TRIzol de acuerdo con la guía del usuario (Invitrogen, EE. UU.). La calidad y la concentración del ARN se evaluaron con un bioanalizador Agilent 2100 (Lexington, EE. UU.) antes de la construcción de la biblioteca. Para cada muestra de ARN, se construyó un tamaño de biblioteca de 150 pb utilizando el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit para Illumina® (NEB, EE. UU.). La secuenciación de extremos emparejados se realizó con Novogene Co. Ltd en la plataforma "Illumina" NovaSeq 6000. Esto generó ~2.700 millones de lecturas. Usamos IllQC_PRLL.pl en el paquete "NGSQCTools" para eliminar lecturas de baja calidad de datos sin procesar [36]. Para generar los conjuntos de ortólogos específicos de la especie y calcular los valores de expresión, descargamos los genomas de referencia de las especies (si están disponibles) de la base de datos pública. Para aquellos sin un genoma de referencia, se usó Trinity para realizar un ensamblaje de novo de transcripciones [37] basado en transcriptomas de hígado, riñón y cerebro generados previamente para ensamblar transcripciones [38]. El tamaño de k-mer del parámetro fijo fue 25, la longitud mínima de contig fue 200 y la longitud del fragmento emparejado fue 500. Luego usamos "cd-hit-est" para procesar las transcripciones ensambladas de diferentes tejidos de la misma especie, agrupar el secuencias con un 90 % de similitud y dejar la transcripción más larga en cada grupo [39, 40]. Finalmente, se empleó a Augustus para realizar la predicción de genes en las transcripciones desredundantes y para obtener archivos de anotación GTF.

Para construir la secuencia de referencia humana, usamos "gffread" en el paquete "cufflink" para extraer la secuencia CDS humana, filtramos las transcripciones ORF incompletas y las transcripciones de pseudogenes, y extrajimos la transcripción más larga para cada gen [41]. BLAST se utilizó para eliminar genes muy repetitivos y muy similares con un valor de e <10−6 y una identidad >90 % como umbral de filtrado [42]. Las tasas de mapeo en el conjunto de datos oscilaron entre 9,63 % y 66,58 %. Finalmente, se obtuvieron como secuencias de referencia 18.552 genes únicos que codifican proteínas.

Se extrajo la transcripción más larga de cada gen y se realizó un "BLAST" recíproco con las secuencias de proteínas de las muestras humanas [43]. El umbral de filtrado se fijó en 10-6 para valores e y 30 % para identidad. Dos genes que estaban mejor alineados entre sí se definieron como genes ortólogos. Debido a que el genoma completo y el genoma de novo son bastante diferentes cuando se comparan, utilizamos la secuencia CDS de genes ortólogos como genoma de referencia y generamos archivos de anotación en formato GTF para el mapeo de datos de RNA-seq. Se usó STAR para construir un índice basado en el tamaño de secuencia del conjunto de genes ortólogos y la longitud de lectura de diferentes especies. Utilizamos los parámetros predeterminados para alinear los datos de RNA-seq con el genoma de referencia [44]. Usamos "featureCounts" en el paquete de software Subread para contar las lecturas y eliminar las lecturas coincidentes múltiples [45].

Finalmente, calculamos el tamaño de la biblioteca de cada muestra como un factor de normalización. El paquete de software R "edgeR" se usó para normalizar el tamaño de la biblioteca y la longitud del gen (basado en humanos) por log2 (RPKM-TMM + 1) [46, 47]. La información de la muestra, las tasas de mapeo, la lista de ortólogos, la longitud del gen y los niveles de expresión están disponibles en las Tablas S12–S17.

Para identificar genes cuya expresión está asociada con la transducción de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS, se utilizó un modelo lineal generalizado para probar la correlación entre la expresión génica y las tasas de transducción. Si no se identificaba un gen ortólogo en una especie en particular, se suponía que ese gen no se expresaba en esa especie (valor de expresión génica = 0). Filtramos los genes que se expresaron en menos de tres muestras. Se utilizaron los mínimos cuadrados ordinarios, el modelo browniano y el modelo de Ornstein-Uhlenbeck para determinar la mejor correlación en la tasa de transducción de cada gen. Debido a que no se detectó una señal filogenética para las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2 y VSVΔG*-SARS, las relaciones filogenéticas no se consideraron en los análisis de regresión de las tasas de transducción de los dos virus pseudotipados. Sin embargo, se empleó un método de dos pasos en todos los análisis de regresión para corregir el valor de p [47, 48]. En el primer paso, los residuos eliminaron las especies que tuvieron el mayor impacto en la pendiente (es decir, los posibles valores atípicos) y luego se volvió a realizar la regresión. Definimos el valor de p resultante como p.robusto para eliminar la influencia de los valores atípicos en la regresión. El segundo paso fue repetir el proceso de regresión para las especies restantes y eliminar una de las especies restantes cada vez hasta eliminar todas las especies restantes una vez. Luego calificamos el valor p más grande (menos significativo) en el proceso como p.max para eliminar el impacto de las especies en la regresión. El límite de genes significativos se fijó en p.robust < 0,01 y p.max < 0,05. Los análisis de enriquecimiento de genes se realizaron utilizando DAVID 2021 actualizado (Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado) [49]. El parámetro de EASE fue de 0,3 con la prueba exacta de Fisher.

R se usó para la representación gráfica y el análisis estadístico; los valores se expresaron como media ± DE. Cuando los cultivos celulares se infectaron con el VSVΔG*-SARS2 que portaba la proteína S de tipo salvaje, las tasas de transducción relativa se clasificaron en cuatro categorías (es decir, transducción mínima, leve, moderada y eficiente) según los siguientes principios. Primero, enumeramos el cuantil de todas las tasas de transducción y calculamos el rango intercuartílico (IQR). Luego, calculamos la desviación estándar (SD) de las tasas de transducción que van desde el mínimo hasta Q1. Esto se denominó SDQ1. Una infección celular con una tasa de transducción de menos de diez veces SDQ1 se clasificó como una infección insignificante; una infección celular con una tasa de transducción entre 10* SDQ1 a Q3 se clasificó como una infección leve; una tasa de transducción entre Q3 a Q3 + 1,5*IQR se clasificó como una infección moderada; y una tasa de transducción de más de Q3 + 1,5*IQR se clasificó como una infección eficiente. Este principio también se aplicó para evaluar los resultados de infección de cultivos celulares por VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS. Cuando los cultivos celulares se infectaron con virus pseudotipados VSVΔG*-SARS2-Smut que portaban proteínas S mutadas del SARS-CoV-2, los resultados de infección de cada VSVΔG*-SARS2-Smut se normalizaron con los resultados de transducción relativos de las células A549. Los valores atípicos se postularon como mutaciones que mejoraron significativamente el tropismo del SARS-CoV-2.

Para evaluar la susceptibilidad al SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV, se utilizaron virus pseudotipados que codifican GFP y contienen proteínas S relevantes, denominados VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS, respectivamente. generado (Fig. S1). Luego recolectamos cultivos celulares derivados de 55 especies de mamíferos pertenecientes a 12 órdenes, incluyendo Diprotodontia (una especie), Didelphimorphia (una especie), Hyracoidea (una especie), Scandentia (una especie), Primates (tres especies), Lagomorpha (una especies), Rodentia (ocho especies), Eulipotyphla (una especie), Perissodactyla (dos especies), Artiodactyla (tres especies), Carnivora (siete especies) y Chiroptera (26 especies) (Fig. 1, Fig. S1). Se obtuvo un total de 83 cultivos celulares, incluidos 64 cultivos celulares primarios, tres cultivos celulares inmortalizados y 16 líneas celulares (Tabla S1). De estos cultivos celulares, 56 se derivaron de riñones en los que se expresaron abundantemente ACE2; 10 se derivaron de los pulmones; siete se derivaron del corazón; y los 10 cultivos celulares restantes se derivaron de otros tejidos, como el embrión, el colon y el bazo (Fig. 1, Tabla S1). Estos cultivos celulares se infectaron con virus pseudotipados y se sometieron a análisis de citometría de flujo de señales positivas para GFP para cuantificar sus tasas de transducción (Fig. S1). En general, los cultivos celulares derivados de los riñones mostraron tasas de transducción relativamente más altas que las de otros tejidos (Fig. S2A). No se observaron diferencias significativas en las tasas de transducción de virus pseudotipados entre cultivos celulares primarios y líneas celulares permanentes (Fig. S2B).

En este estudio se utilizó un árbol filogenético de 55 cultivos de células de mamíferos. Se recuperó una filogenia de TIMETREE (http://www.timetree.org/). Los taxones indicados en letra roja son especies que pueden infectarse de forma natural con el SARS-CoV-2 según estudios previos, mientras que los taxones indicados en letra azul son especies que se probaron mediante análisis experimentales de infección in vivo. Además, se obtuvieron 83 cultivos celulares de riñones, corazón, pulmones, cerebro y otros tejidos. Los elementos de dibujos animados con marcos negros son líneas celulares derivadas de estos tejidos. Los diminutos dibujos animados se obtuvieron de BioRender (https://biorender.com/). B Tasas de transducción (media ± DE, n = 3) de 83 cultivos celulares infectados por los virus VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS. Algunos cultivos celulares se derivaron del mismo huésped. En ese caso, los cultivos celulares con las tasas de transducción más altas se muestran en este panel. Las líneas discontinuas grises y negras representan el estándar para definir la transducción moderada y eficiente, respectivamente.

Tras la infección con VSVΔG*-SARS2, los 83 cultivos celulares mostraron diferentes sensibilidades, con una tasa de transducción general de 0 a 26,7 % (Fig. 1, Fig. S3, Tabla S1). Cuarenta y cuatro cultivos celulares fueron mínimamente transducidos por VSVΔG*-SARS2 (tasa de transducción de <1,2%). Un total de 32 cultivos celulares fueron levemente (tasa de transducción de 1,2 a 3,8 %) o moderadamente (tasa de transducción de 3,8 a 8,8 %) transducidos por VSVΔG*-SARS2, incluidos cultivos celulares derivados de perros (BcKi, BcLu y MDCK), gatos (F81), hurones (MpuHe), perros mapaches (NpKi), visones (Mv.1.Lu), musarañas de árbol (TbKi) y cerdos (PK-15) (Fig. 1, Fig. S3). Esto es consistente con el hecho de que se sabe que los perros mapaches, perros, gatos, visones, hurones, musarañas de árbol y hámsteres son susceptibles al SARS-CoV-2 con signos clínicos asintomáticos a moderados (Tabla S2) [22, 50]. Descubrimos que VSVΔG*-SARS2 puede infectar células PK-15 (4,9 %) (Fig. 1), pero las infecciones experimentales anteriores sacaron conclusiones contradictorias. Varios estudios mostraron que los cerdos eran resistentes al SARS-CoV-2 [23, 51, 52], mientras que otros estudios mostraron que el SARS-CoV-2 podría infectar a los cerdos y transmitirse a los cerdos centinela ingenuos alojados conjuntamente [53, 54]. Cultivos celulares de varias mascotas, como células de corazón (OdHe), pulmón (OdLu) y riñón (OdKi) del degú común (Octodon degus, un roedor histricomorfo) y cultivos de células de corazón (GkHe) del lirón de Kellen (Graphiurus kelleni , un roedor glirid) fueron moderadamente transducidos por VSVΔG*-SARS2 (Fig. 1). Se descubrió que los ratones eran resistentes a la infección por SARS-CoV-2; sin embargo, los cultivos celulares de ratones (NIH3T3 y SP2/0) fueron ligeramente transducidos por VSVΔG*-SARS2 (Fig. S3, Tabla S1). Dado que el SARS-CoV-2 puede adaptarse mediante pases en serie en el tracto respiratorio de ratones BALB/c envejecidos [55, 56], supusimos que los animales que no eran susceptibles al SARS-CoV-2 podrían ser huéspedes potenciales después de la evolución viral durante exposiciones repetidas.

Por último, se descubrió que siete cultivos celulares derivados de murciélagos de herradura de Thomas (RtKi), murciélagos de herradura rey, humanos, civetas de palma, monos verdes de África y hurones eran altamente susceptibles al VSVΔG*-SARS2 (tasa de transducción de >8,8 %). Entre ellos, los humanos, las civetas de palma y los hurones se identificaron como huéspedes susceptibles de SARS-CoV y SARS-CoV-2 según los análisis in vivo (Tabla S2) [57]. En particular, el 14,0 % de Huh-7 (línea celular humana), el 11,4 % de Vero-E6 (línea celular de mono verde), el 11,9 % de Marc-145 (línea celular de mono verde) y el 10,0 % de MpuKi.2 (línea celular de hurón línea celular renal), lo que confirmó que estas líneas celulares son altamente susceptibles al SARS-CoV-2, como se encontró en estudios previos [28, 58]. Notamos que las células renales de civeta de palma (PlKi) eran altamente susceptibles a VSVΔG*-SARS2, ya que las civetas de palma han sido reconocidas como uno de los huéspedes de replicación del SARS-CoV [8, 59] (Fig. 1, Fig. S2). Es importante destacar que las células renales de hurón (Mustela putorius furo) (MpuKi.2) también eran muy susceptibles al SARS-CoV-2. Estudios experimentales han demostrado que los hurones son susceptibles al SARS-CoV-2 [23, 51, 60,61,62]. Se descubrió que los cultivos de células primarias derivados del murciélago de herradura de Thomas y el murciélago de herradura rey eran más sensibles al VSVΔG*-SARS2 que la línea celular humana Huh-7 (Fig. 1, Tabla S1), lo que sugiere que pueden servir como posibles huéspedes del SARS -CoV-2.

Las estimaciones de máxima verosimilitud de λ de Pagel para las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS fueron 6,74 × 10−5 (prueba de señal filogenética: logλ = −163,95, p > 0,05), 6,33 × 10-5 (logλ = −192,22, p > 0,05) y 0,74 (logλ = −174,13, log0 = 1475,26, p = 0,09 × 10−2), respectivamente, lo que indica que los taxones estrechamente relacionados generalmente tienen una susceptibilidad similar a VSVΔG* -MERS pero no a VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-SARS2. Consistentemente, VSVΔG*-SARS mostró un perfil de tropismo más similar con VSVΔG*-SARS2 (R2 = 0.61, p < 0.001, prueba filogenética de mínimos cuadrados generalizados) que con VSVΔG*-MERS (R2 = 0.29, p < 0.001, prueba filogenética de mínimos cuadrados generalizados). prueba de cuadrados). En particular, los 83 cultivos celulares infectados por VSVΔG*-SARS mostraron una tasa de transducción de 0 a 38,4 % (Fig. 1). En general, 38 cultivos celulares se transdujeron mínimamente (tasa de transducción de 0–1,1 %), 23 levemente (1,1–3,8 %), 10 moderadamente (3,8–8,9 %) y 11 altamente (8,9–38,4 %) por VSVΔG*-SARS . Los cultivos celulares que mostraron la mayor susceptibilidad al VSVΔG*-SARS se obtuvieron de hurones domesticados, con un 38,4 % de células MpuKi.2 de riñón de hurón y un 31,1 % de células MpuKi.1 de hurón transducidas. Esto representa un aumento de 2,6 y 2,0 veces en comparación con el de las células humanas (Huh-7) (Fig. 1, Fig. S4, Tabla S1). Esto es digno de mención ya que los hurones se han utilizado como modelo animal para el SARS-CoV y experimentan signos clínicos, que incluyen estornudos, fiebre y diarrea [63]. El cultivo celular que ocupó el puesto más alto después de las células de riñón de hurón se derivó del murciélago de herradura de Thomas, que tuvo una tasa de transducción del 37,2%, lo que indica que esta especie también podría servir como un huésped importante para el SARS-CoV.

Las civetas de palma han sido reconocidas como un huésped de replicación para el SARS-CoV. Nuestros resultados indican una tasa de transducción consistente y alta (9,1%) para las células PlKi de civeta de palma. Además, VSVΔG*-SARS mostró una mayor capacidad que VSVΔG*-SARS2 en la transducción de cultivos celulares de especies altamente susceptibles, como RtKi (37,2 % frente a 25,5 %), PK-15 (13,4 % frente a 4,9 %), MpuKi.2 (38,4 % frente a 10,0 %), células MpuKi.1 (33,3 % frente a 1,9 %) y BcKi (21,1 % frente a 3,8 %) (Fig. 1, Fig. S4). Esto implica que el SARS-CoV podría ser más fácil de transmitir de humanos a huéspedes naturales que el SARS-CoV-2.

Encontramos que 41 cultivos celulares fueron mínimamente (tasa de transducción de 0 a 1,3%), 21 ligeramente (1,3–4,3%), 13 moderadamente (4,3–10,0%) y 8 eficientemente (10,0–32,9%) transducidos por VSVΔG* -MERS (Fig. 1, Fig. S3). Sorprendentemente, las líneas celulares humanas mostraron la tasa de transducción más alta tras la infección por VSVΔG*-MERS, que era diferente a la de VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-SARS2. Además, entre los 10 principales cultivos celulares con las tasas de transducción más altas, seis (MlKi, RrKi, RtKi, MsKi, PlaKi y MfiKi) se derivaron de murciélagos (Fig. 1, Fig. S3), lo que sugiere que las diversas especies de murciélagos sirven como huéspedes reservorio potenciales para MERS-CoV. En particular, el murciélago pipistrelle japonés (Pipistrellus abramus) es una especie de preocupación. Viven muy cerca de las comunidades humanas y tienen el potencial de transmitir el virus a los humanos [64]. Y, aunque estudios previos han sugerido que los hurones son resistentes a la infección por MERS-CoV [65], encontramos que el 10,0% de los cultivos de células MpuKi.2 de riñón de hurón fueron transducidos por el virus pseudotipado MERS-CoV (Fig. 1). Además, el receptor DPP4 de MERS-CoV [66] se expresa ligeramente en células de riñón de hurón. Estos resultados implican que hay otros factores además de DPP4 que pueden ayudar en la entrada de MERS-CoV y que los hurones son susceptibles al SARS-CoV, SARS-CoV-2 y MERS-CoV.

Para explorar si las variantes de la proteína S del SARS-CoV-2 alteran la susceptibilidad al SARS-CoV-2, se recuperaron 77 125 genes de punta del SARS-CoV-2 de GISAID (recuperados el 26/10/2020) y 65 variantes con frecuencias de residuos superiores al 0,075% (Fig. 2A). Además, se seleccionaron catorce mutaciones de residuos en proteínas S de variantes de SARS-CoV-2 aisladas de muestras de ratón, gato, perro, visón y tigre, así como mutaciones de proteínas S de murciélago-CoV RaTG13 (GISAID: EPI_ISL_402131), murciélago -CoV RmYN02 (GISAID: EPI_ISL_412977), y pangolín-CoV MP789 (GISAID: EPI_ISL_412860). En total, se construyeron 79 virus pseudotipados con proteínas SARS-CoV-2 S mutadas, seguido de la infección in vitro de 44 cultivos celulares (Fig. 2B).

A La frecuencia de sustitución de cada sitio se analizó en función de las secuencias S recuperadas de la base de datos GISAID. B Distribución de 79 mutaciones de sitio de la proteína S. El sitio con un marco negro significa que esta mutación se seleccionó en base a un análisis comparativo del genoma viral derivado de huéspedes animales. C Las tasas de transducción normalizadas generales de todas las mutaciones en diferentes cultivos celulares. Los diminutos dibujos que se muestran en la figura representan especies de diferentes órdenes de mamíferos. El origen del tejido de estos cultivos celulares se muestra en el eje x. Estructura DA 3D del complejo S-ACE2 que muestra que del69-70, D80Y, S98F, T572I y Q675H están ubicados fuera del RBD de las proteínas S.

Descubrimos que la mayoría de estas mutaciones tuvieron poco impacto en las eficiencias de transducción de los virus pseudotipados VSVΔG * -SARS2-Smut en cultivos celulares (Fig. 2C, Fig. S5). Como era de esperar, los cultivos celulares de humanos, monos y murciélagos (Huh-7, Vero-E6, Marc-145 y PabKi.1) fueron más sensibles a los virus pseudotipados en comparación con otros cultivos celulares (Fig. 2C). Estudios anteriores han demostrado que las sustituciones N439K, N501Y, D614G y H655Y en las proteínas S mejoran la patogenicidad y la transmisión del SARS-CoV-2 en humanos [67,68,–69]. En el presente estudio, encontramos que estas sustituciones no siempre promueven la tasa de transducción. Por ejemplo, H655Y aumentó la transducción de VSVΔG*-SARS2 a células de musaraña de árbol (TbKi) (Fig. S5), mientras que la sustitución de D614G redujo significativamente la capacidad de VSVΔG*-SARS2 para transducir en células de fibroblastos de rata topo desnudas y en japonés. Células de murciélagos pipistrelle (PabKi.1) (Fig. S6). Además, la sustitución T22I redujo significativamente el tropismo del SARS-CoV-2 a F81 (línea celular de riñón de gato) y BHK-21 (línea celular de riñón de hámster dorado). Además, las sustituciones H519N y T716I mostraron una capacidad disminuida para transducir PK-15 (línea celular de riñón de cerdo) y PaKi (línea celular de riñón de zorro volador negro). Finalmente, las sustituciones T29I, E281V y S939F redujeron significativamente el tropismo del SARS-CoV-2 a los cultivos de células MfuKi (células de riñón de murciélago de alas dobladas del este) (Fig. S5).

Se encontró que varias mutaciones aumentan significativamente las eficiencias de transducción de VSVΔG*-SARS2-Smut en ciertos cultivos celulares (Fig. 2C, Fig. S5). En particular, del69-70 en la proteína S promovió la capacidad de VSVΔG*-SARS2-Sdel69-70 para transducir células PabKi.1 de murciélago (17,8 %) a un nivel dos veces mayor que el de las células Huh-7 (9,8 %) (Fig. S5B). De manera similar, VSVΔG*-SARS2-SD80Y provocó una tasa de transducción del 7,2 % en células de hámster dorado, que fue más alta que la de las células Huh-7 (6,6 %) (Fig. S5C). Descubrimos que la sustitución S98F mejoró significativamente la tasa de transducción en células de riñón de perro mapache (62,4%) y células de riñón de murciélago de patas grandes de Rickett (45,0%) en comparación con las células Huh-7 (38,9%) (Fig. S5D). De manera similar, la sustitución T572I aumentó significativamente la eficiencia de transducción de VSVΔG*-SARS2 en células PK15 de cerdo (11,3 %) en comparación con las células Huh-7 (12,2 %) (Fig. S5E). La mutación Q675H también mejoró significativamente la capacidad del virus pseudotipado SARS-CoV-2 para infectar células renales de jerbo de cola gorda, con una tasa de transducción del 13,4 % en comparación con el 15,7 % en las células Huh-7 (Fig. S5F). En particular, estas cinco mutaciones se ubicaron fuera del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína S (Fig. 2D). Por lo tanto, estos resultados respaldan la idea de que diferentes mutaciones tienen un impacto único en la susceptibilidad viral en especies de mamíferos particulares, y que las variantes dentro y fuera de la región RBD son de igual importancia para la entrada y unión viral.

Las simulaciones de dinámica molecular que utilizan Amber 20, así como el complejo cristalino de RBD-hACE2 (PDB ID: 6M0J), indican que la energía libre de unión (ΔG) entre RBD y diferentes ortólogos de ACE2 osciló entre −64,7 y −24,8 kcal/mol. Los ACE2 de monos verdes (Chlorocebus sabaeus) y murciélagos de herradura grandes (Rhinolophus ferrumequinum) mostraron la energía libre de unión más alta y más baja con SARS-CoV-2 S-RBD, respectivamente (Fig. S6A). Analizamos más a fondo las contribuciones de energía libre por residuo (Fig. S6B-D). Los resultados mostraron que había 42 residuos de aminoácidos que eran importantes para las interacciones entre RBD y ACE2 (Fig. S6B-E).

En este sentido, el espectro de infección entre especies de diferentes variantes de picos nos permitió explorar la posible "interacción" en el sitio entre los residuos de aminoácidos de ACE2 y las variantes de picos que pueden afectar la tasa de transducción entre especies. Al probar si la frecuencia de los residuos principales se distribuyó uniformemente entre los grupos de infección alta y baja sugeridos por cada variante de pico, identificamos 98 combinaciones de variantes de pico y residuos de ACE2 que eran candidatas para tales "interacciones" potenciales ("material y métodos", Fig. S7, Tabla S3). Las posiciones de ACE2 mejor clasificadas involucradas en estas interacciones significativas fueron 49, 31, 354, 82, 75, 35, 353, mientras que las variantes de picos mejor clasificadas incluyeron P26L, S254F, H519N, H146Y, A262S y T478I. La mayoría de estas interacciones (86,7%) involucraron las variantes de pico de la región RBD (Tabla S3). Estos resultados respaldan la posibilidad de que diferentes variantes de pico tengan un impacto único en la susceptibilidad viral al interactuar con distintos residuos de ACE2 y/u otros factores intrínsecos en especies de mamíferos particulares.

Se generaron perfiles transcriptómicos de cultivos celulares de 42 especies de mamíferos y se realizaron análisis de regresión para identificar genes cuyas expresiones se correlacionaron significativamente con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS. En total, hubo 590 genes cuyos niveles de expresión se asociaron significativamente con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2 (Fig. 3A, Tabla S4). La ruta más significativamente enriquecida fue la infección por el virus Herpes simplex 1 (p = 4,30 × 10−23, prueba exacta de Fisher), en la que el 93,6 % (59 de 63 genes) de los genes asociados son proteínas con dedos de zinc (Fig. 3B, Tabla S5 ). Los procesos biológicos enriquecidos correspondientes que contienen proteínas con dedos de zinc son la regulación de la transcripción con plantilla de ADN (p = 2,40 × 10-12, prueba exacta de Fisher) y la regulación de la transcripción del promotor de la ARN polimerasa II (p = 5,10 × 10-10, prueba exacta de Fisher) ( Tabla S6). Las proteínas con dedos de zinc parecen funcionar en las interacciones huésped-virus y desempeñan múltiples funciones en la replicación viral al regular los perfiles de transcripción de la célula huésped [70]. Muchas proteínas con dedos de zinc se correlacionan positivamente con las tasas de infección por VSVΔG*-SARS2. Esto indica que los niveles de transcripción de las células huésped son importantes para la entrada del SARS-CoV-2, que generalmente depende de un mecanismo llamado "captura de la tapa", como se observa en el virus de la influenza [71]. Los cinco genes principales que se asociaron con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2 en cultivos celulares fueron PDZK1 (p.robusto = 5,87 × 10−11), SERPINF2 (p.robusto = 2,31 × 10−9), SCG5 (p. robusto = 3,51 × 10−9), DEPP1 (p.robusto = 4,57 × 10−9) y ABCC6 (p.robusto = 2,71 × 10-8) (Fig. 3C, Fig. S8, Tabla S4). Estos genes son dignos de una mayor exploración. Por ejemplo, PDZK1 codifica una proteína de andamiaje que contiene el dominio PDZ (PSD95/DLG/ZO-1) (denominada NHERF3), que pertenece a un grupo de proteínas que median en las uniones célula-célula y participa en la coordinación de una amplia gama de procesos regulatorios. Un estudio anterior mostró que el SARS-CoV y el virus de la rabia neurotrópica están vinculados a las funciones de unión a PDZ de las proteínas de su envoltura [72]. PDZK1 puede interactuar con SR-B1 y facilitar la entrada del virus de la hepatitis C [73]. Además, el motivo de reconocimiento PDZ C-terminal de ACE2 802QTSF805 se une a NHERF1 y/o NHERF3 y promueve la entrada de células SARS-CoV-2 mediada por ACE2 [74, 75]. SERPINF2 codifica uno de los inhibidores de la serina proteasa. Un estudio reciente reveló que la expresión de SERPINF2 aumenta en los niveles séricos de pacientes con COVID-19, junto con varias otras SERPIN (SERPINA1 y SERPINA3) [76]. Además, varios genes, como MAK16 (p.robust = 1,92 × 10−5), H3Y2 (p.robust = 4,08 × 10−5) y RBMX (p.robust = 6,14 × 10−5), mostraron una correlación negativa significativa con las tasas de transducción (Fig. S8, Tabla S4). El papel de MAK16 y H3Y2 en la infección viral no está claro, mientras que RBMX, que codifica las proteínas con motivos de unión al ARN X-ed, responde a la entrada del SARS-CoV-2 a través de interacciones de la proteína huésped con el ARN viral [77, 78].

Gráfico de AA Venn que muestra 590 genes, 453 genes y 416 genes que se asociaron significativamente con las tasas de transducción de los virus pseudotipados VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS, respectivamente. Un total de 95 genes se asociaron comúnmente con los tres virus pseudotipados. B Las vías KEGG que se enriquecieron con estos genes y tenían expresiones asociadas con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS. C Gráficos de varios genes cuyas expresiones se asociaron con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS y VSVΔG*-MERS. D Mapa de calor de 95 genes que se asociaron comúnmente con los tres virus pseudotipados. El nivel de expresión estuvo representado por log2(RPKM + 1). Los cultivos celulares marcados con fuentes rojas fueron transducidos eficientemente por VSVΔG*-SARS2. Las barras azules debajo del árbol indican genes que se asociaron negativamente con la transducción de VSVΔG*-SARS2, mientras que las barras rojas indican genes que se asociaron positivamente con la transducción de VSVΔG*-SARS2.

Identificamos una asociación significativa entre los niveles de expresión de 453 genes asociados con la tasa de transducción de VSVΔG*-SARS y 416 genes asociados con la tasa de transducción de VSVΔG*-MERS. Estos genes se enriquecen principalmente en las vías metabólicas y en la infección por el virus del herpes simple 1, de acuerdo con el hecho de que más de la mitad de todas las expresiones génicas se correlacionaron con la transducción de VSVΔG*-SARS2 (Fig. 3B, Tablas S6–S11). Los genes cuyas expresiones se asociaron con VSVΔG*-MERS exhibieron un perfil similar a VSVΔG*-SARS2 en el enriquecimiento de procesos biológicos, particularmente en la regulación de la transcripción con plantilla de ADN y la regulación de la transcripción del promotor de la ARN polimerasa II. Sin embargo, el principal proceso biológico que se enriqueció con genes cuyas expresiones se asociaron con la transducción de VSVΔG*-SARS fue la proteólisis (p = 7,7 × 10−4, prueba exacta de Fisher) (Tabla S8), lo que destaca que las proteasas de las células huésped son esenciales para la infectividad del virus pseudotipado SARS-CoV [79]. Además, un estudio reciente sugiere que las proteasas son fundamentales para el proceso de infección del SARS-CoV-2, y los medicamentos dirigidos a las proteasas pueden causar una reducción dependiente de la dosis en los títulos de SARS-CoV-2 [80]. Esto sugiere que las proteasas podrían ser un objetivo común para el tratamiento de enfermedades similares al SARS. Sin embargo, las expresiones de los receptores reconocidos (ACE2 y DPP4) de SARS-CoV y MERS-CoV no se correlacionaron significativamente con las tasas de transducción. Dado este resultado, examinamos los roles potenciales de esos genes relacionados. Se encontraron varias respuestas génicas (p. ej., HSD17B2, IGLL1) en la infección por SARS-CoV-2 [81, 82], mientras que el papel de los genes mejor clasificados asociados con la transducción de VSVΔG*-SARS fue más limitado.

Recopilamos una lista de 95 genes que se asociaron comúnmente con las tasas de transducción de los virus pseudotipados SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 (Fig. 3D, Tabla S12). Esta lista no solo incluía los genes mencionados anteriormente, sino que también incluía genes como APOBEC3B, MYO5B y HPN (hepsina), que pueden estar involucrados en las interacciones entre el virus y el huésped del SARS-CoV-2. Por ejemplo, APOBEC3B, que pertenece a una familia de proteínas en mamíferos, consiste en citosina desaminasas celulares y sirve como una barrera que potencialmente previene la transmisión de lentivirus entre especies [83]. Además, APOBEC3 puede moldear constantemente el genoma del SARS-CoV-2 mediante la edición de citidina a uridina [84]. Por el contrario, MYO5B está regulado a la baja en un modelo de desgranulación de mastocitos inducido por Spike-RBD y desempeña un papel en el transporte endosomal [85]. MYO5B también interactúa con proteínas virales. Un estudio anterior sugiere que la inhibición de las proteínas MYO5 podría ser un objetivo eficaz para el tratamiento de la COVID-19 [85]. Estos resultados implican ampliamente a estos genes comunes en la entrada y replicación viral y, por lo tanto, siguen siendo objetivos adecuados para una evaluación adicional de los riesgos de transmisión entre especies.

Aquí, hemos demostrado que el SARS-CoV-2, el SARS-CoV y el MERS-CoV pueden infectar las células de docenas de especies de mamíferos, lo que indica que son virus generalistas y no están específicamente adaptados a los humanos. Además, los cultivos celulares de diferentes mamíferos muestran susceptibilidades variables a los virus pseudotipados SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Esto implica que el SARS-CoV-2 tiene la capacidad de extenderse a múltiples especies y establecer reservorios naturales después de cambios evolutivos adaptativos menores o mayores. Nuestros resultados destacaron el potencial de los murciélagos de herradura de Thomas, los murciélagos de herradura rey, los monos verdes y los hurones para servir como huéspedes reservorios de estos coronavirus. En especial, se descubrió que los cultivos de células primarias derivados del murciélago de herradura de Thomas y del murciélago de herradura rey eran más sensibles al VSVΔG*-SARS2 que las líneas celulares humanas. Esto es importante, ya que los murciélagos de herradura (Rhinolophidae) se consideran un reservorio de muchos virus zoonóticos y se supone que, en general, son tolerantes a la infección. Sin embargo, se han informado sarbecovirus muy raros tanto en los murciélagos de herradura de Thomas como en los murciélagos de herradura rey, pero no en otros murciélagos de herradura (p. ej., murciélagos de herradura chinos) [86]. Esto no solo plantea la preocupación de que el SARS-CoV-2 pueda propagarse de los humanos a estas dos especies de murciélagos, sino que también prioriza la vigilancia de la intolerancia al virus en los murciélagos de herradura.

Dado que se descubrió que ACE2 es el receptor funcional de la proteína espiga de SARS-CoV y SARS-CoV-2, estudios pioneros han predicho la susceptibilidad de varias especies animales al SARS-CoV-2 utilizando secuencias de ACE2 y/o su afinidad de unión a proteínas de punta [15, 87, 88]. Si bien nuestro ensayo experimental validó la susceptibilidad de varias especies (por ejemplo, el macaco rhesus y el hámster dorado) al SARS-CoV-2, existe una inconsistencia considerable entre las predicciones in silico y nuestros ensayos celulares. Por ejemplo, se predijo que la musaraña arborícola china y el hurón exhibirían un riesgo bajo o nulo de infección por SARS-CoV-2 [15], posiblemente debido al hecho de que sus secuencias ACE2 divergían de las ACE2 humanas. Sin embargo, nuestros experimentos indicaron que ambas especies son de susceptibilidad media. De manera similar, generalmente se predice que los murciélagos tienen un bajo riesgo de infección, pero nuestros resultados sugieren que es probable que varias especies de murciélagos estén altamente infectadas. Por lo tanto, los estudios que examinan experimentalmente la susceptibilidad a la infección son extremadamente valiosos para la comparación con futuras predicciones in silico. Además, como se indica en la Tabla S2, el 75 % de las susceptibilidades in vitro presentadas en nuestro estudio fueron respaldadas por ensayos de inoculación in vivo. Se observaron diferencias entre los ensayos in vitro e in vivo en el ratón, el zorro rojo y la vaca. Por ejemplo, el ensayo de inoculación sugirió que los ratones son resistentes a la infección por SARS-CoV-2, pero nuestro estudio encontró que sus cultivos celulares muestran tasas de transducción moderadas. Esto puede deberse al hecho de que los modelos celulares pueden no parecerse a la complejidad de un organismo completo, o a los desafíos particulares de la traducibilidad de los datos generados in vitro en modelos in vivo [57]. No obstante, las pruebas in vivo pueden beneficiarse de las pruebas in vitro para determinar el riesgo de susceptibilidad y los huéspedes naturales del SARS-CoV-2 y otros sarbecovirus.

También examinamos las susceptibilidades de varias especies de mamíferos a diferentes variantes de picos y descubrimos que cada variante de picos mostraba un espectro distinto de infección. En especial, se demostró que varias variantes de picos (Del69-70, D80Y, S98F, T572I y Q675H) que no están en la región RBD aumentan la infectividad del SARS-CoV-2. La variante del69-70 se identificó inicialmente a principios de 2020 y, en los últimos años, ha mutado en tres variantes diferentes (es decir, Y453F, S493K y N501Y) [89]. Informes anteriores han demostrado que del69-70 aumenta la escisión en la proteína S y la infectividad en la variante SARS-CoV-2 B.1.1.7 [90, 91]. Esta mutación puede aumentar la propagación del SARS-CoV-2 a otros animales, como el murciélago pipistrelle japonés, que habita en áreas urbanas de alta densidad de población humana. Además, en nuestro estudio se encontró una interacción entre los residuos de ACE2 y las variantes de pico, que potencialmente afectan las tasas de infección. Algunos de estos residuos de ACE2 se importan para la interfaz entre el SARS-CoV RBD y ACE2. Por ejemplo, Lys31 y Lys353 son puntos críticos de unión a virus, que consisten en puentes salinos entre Lys31 y Glu35 y entre Lys353 y Asp38 [92, 93]. Sin embargo, la mayoría de las variantes de pico en estas interacciones predichas se ubicaron en el dominio N-terminal (NTD). Por lo tanto, las regiones dentro y fuera de RBD pueden tener la misma importancia para la entrada y la infección del virus. Se debe prestar mayor atención a estas variantes de picos, ya que (p. ej., P26L, S254F, H146Y y A262S) constituyen el "supersitio de NTD", que es reconocido por todos los anticuerpos neutralizantes específicos de NTD conocidos [94] y, por lo tanto, podría mediar escape inmune.

Un examen de las señales filogenéticas indica que el SARS-CoV exhibe un perfil de tropismo más similar al del SARS-CoV-2 que al del MERS. Esto puede deberse al hecho de que el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 usan el mismo receptor. Sin embargo, el virus pseudotipado del SARS-CoV tuvo una mayor eficiencia en la transducción de varios cultivos celulares de perros, cerdos y hurones, lo que sugiere que una mayor investigación puede descubrir variantes de picos y otros factores entre el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 que contribuyen a esta diferencia. (Figura S4). Los análisis de regresión indicaron que la expresión de receptores y factores comúnmente conocidos que facilitan la entrada de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV no se correlacionó con la infección entre especies (Fig. S8). En particular, los niveles de expresión de ACE2 (p.robusto = 0,14), FURIN (p.robusto = 0,89) y TMPRSS2 (p.robusto = 0,11), mostraron una correlación insignificante con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2 (Figs. S9A– C; S9D y Tabla S4, Tabla S6). Por el contrario, CTSL (p.robusto = 7,4 × 10−3) se correlacionó significativamente con las tasas de transducción de VSVΔG*-SARS2.

Descubrimos que ciertas líneas celulares expresaban niveles altos de ACE2 (p. ej., células derivadas del planeador del azúcar, el murciélago bigotudo de Nepal y el murciélago de herradura mayor), pero estas se transducían mínima o solo levemente por VSVΔG*-SARS2 (Fig. S9A-C y Tabla S1). Sin embargo, esto puede no negar el papel de ACE2 en la determinación de la susceptibilidad al SARS-CoV-2 en otras especies porque la expresión de ARN no puede representar completamente la proteína ACE2 en la superficie celular. Además, los análisis posteriores del modelo de regresión penalizada revelaron que los cambios de secuencia en ACE2 están significativamente correlacionados con las tasas de transducción en taxones filogenéticamente diversos (F = 15.78, p = 8.9 × 10−13) (Figs. S10, S11). Esto sugiere que los cambios en las secuencias de ACE2 en lugar de la expresión contribuyen a las diferencias en la susceptibilidad. Sin embargo, la variación total de las tasas de transducción explicada por la secuencia de ACE2 cambia ~28,9 %. Por lo tanto, los estudios futuros deberían explorar otros factores intrínsecos del huésped asociados con la susceptibilidad, como los genes identificados en este estudio cuya expresión se correlacionó significativamente con las tasas de transducción.

Finalmente, nuestros resultados destacan el hecho de que los modelos de cultivo celular representan un método importante para comprender la transmisión de sarbecovirus entre especies al identificar el espectro de huéspedes mamíferos que son susceptibles al SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV y sus variantes.

Los datos de secuenciación de ARN de este estudio se han depositado en ScienceDB (https://doi.org/10.57760/sciencedb.j00001.00445) y en el Genome Sequence Archive en el National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics , Academia China de Ciencias (GSA: CRA009056) y NCBI (PRJNA906190).

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Agradecemos a Pengcheng Wang, Xuanjing Li, Yun Huang, Linfa Wang y Alice C. Hughes por apoyar la recolección y preparación de muestras. También agradecemos a Chrissie, Sara, Jenni y Dax por su apoyo durante la redacción de este manuscrito. Este proyecto fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070528), los Proyectos Nacionales Clave de Investigación y Desarrollo del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2021YFC2301300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82050002), la programa clave de la Academia China de Ciencias (KJZD-SW-L11) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (JQ19022).

Estos autores contribuyeron por igual: Meng Li, Juan Du.

Laboratorio Clave de Ecología Animal y Biología de la Conservación, Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Beijing, 100101, China

Meng Li, Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Yichen Dai, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang, Gaoming Liu, Qi Pan, Xiao Wang, Pingfen Zhu y Xuming Zhou

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang y Qi Pan

Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Anhui, China

yang yu

Beijing Advanced Center for Structural Biology, Beijing Frontier Innovation Center, School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, 100084, Beijing, China

Xu bronceado

Departamento de Antropología, Programa de Ecología, Evolución y Biología de la Conservación, Universidad de Illinois, Urbana, IL, EE. UU.

Pablo A. Garber

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XZ y ML concibieron el estudio y diseñaron el proyecto. ML realizó experimentos, completó el análisis y escribió el manuscrito; JD, ZL y FL prepararon los cultivos celulares; WL y CH implementan el análisis de ARN, el análisis de datos y las figuras estructurales generadas; GL, LW., XW, QP, XT, PAG y XZ discutieron los resultados y revisaron este manuscrito; Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los datos.

Correspondencia a Xuming Zhou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Li, M., Du, J., Liu, W. et al. Susceptibilidad comparativa de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV en mamíferos. ISME J 17, 549–560 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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Recibido: 15 Agosto 2022

Revisado: 10 de enero de 2023

Aceptado: 12 de enero de 2023

Publicado: 23 enero 2023

Fecha de emisión: abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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Naturaleza (2023)