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Oct 20, 2023

TRPV3

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 88 (2023) Citar este artículo

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El receptor de potencial transitorio vanilloid 3 (TRPV3) pertenece a la superfamilia de canales iónicos TRP y funciona como un canal catiónico no selectivo que es altamente permeable al calcio. Este canal se expresa fuertemente en los queratinocitos de la piel y está implicado en la sensación de calor, el picor, la cicatrización de heridas y la secreción de varias citoquinas. Estudios previos mostraron que anoctamin1 (ANO1), un canal de cloruro activado por calcio, fue activado por la entrada de calcio a través de TRPV1, TRPV4 o TRPA1 y que estas interacciones del canal fueron importantes para las funciones fisiológicas mediadas por el canal TRP. Encontramos que ANO1 fue expresado por queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK). Observamos que ANO1 mediaba corrientes tras la activación de TRPV3 de NHEK y queratinocitos de piel de ratón. Usando un ensayo de curación de heridas in vitro, observamos que un bloqueador de TRPV3, un bloqueador de ANO1 o un medio bajo en cloruro inhibía la migración y proliferación celular a través de la fosforilación de p38, lo que conducía a la detención del ciclo celular. Estos resultados indicaron que la entrada de cloruro a través de la actividad de ANO1 mejoró la cicatrización de heridas por parte de los queratinocitos.

Los canales de potencial receptor transitorio (TRP) se componen de seis familias de proteínas relacionadas en los mamíferos. Estas familias incluyen TRPA (anquirina), TRPC (canónico), TRPM (melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) y TRPV (vanilloide). La mayoría son canales de cationes no selectivos y altamente permeables al calcio1. En las células epiteliales del plexo coroideo, la entrada de calcio a través de TRPV4 activa un canal de cloruro activado por calcio (CaCC) denominado anoctamin1 (ANO1 o TMEM16A), que se cree que conduce a la secreción de líquido cefalorraquídeo2. También se informó que otras células epiteliales tienen canales TRPV4 y ANO1. Por ejemplo, estos canales iónicos son coexpresados ​​por las células acinares de las glándulas salivales y lagrimales, y las secreciones de saliva y lágrimas podrían acelerarse mediante la interacción funcional entre TRPV4 y ANO13. Por lo tanto, los complejos de canal TRP/ANO1 tienen funciones distintas aunque cada canal TRP funcione de forma independiente. Como resultado, no se pueden investigar las funciones de los canales sin estudiar sus interacciones cuando las mismas células coexpresan un canal TRP y ANO1.

TRPV3 es un canal TRP sensible al calor y la permeabilidad al calcio es aproximadamente diez veces mayor que la del sodio4. Aunque se informa que TRPV3 se expresa en todo el cuerpo, su significado fisiológico no se comprende bien. Estudios previos mostraron que TRPV3 contribuyó a la picazón, la sensación de calor y la cicatrización de heridas en los queratinocitos5,6,7,8,9. Además, la activación de TRPV3 mejorada por la señalización celular aguas abajo del receptor del factor de crecimiento epidérmico acelera la cicatrización de heridas dependiente del calor en las células epidérmicas orales5. En los queratinocitos de la piel, un estudio anterior demostró que TRPV3 contribuye a la proliferación celular a través de vías de señalización dependientes de EGFR5,6,7,8,9.

La cicatrización de heridas de la piel depende de la migración celular y la proliferación celular. Aunque algunos factores de crecimiento e interleucinas están involucrados en la cicatrización de heridas9,10, los canales iónicos en las membranas plasmáticas de los queratinocitos también podrían ser importantes. Por ejemplo, se informa que Ano1 es un gen relacionado con el carcinoma11,12, y un estudio reciente reveló que ANO1 estaba involucrado en la proliferación de células epiteliales prostáticas en la hiperplasia prostática benigna13, así como en las células HaCaT, una línea celular especial de queratinocitos14. Además, la inhibición de ANO1 redujo la migración celular en algunas células cancerosas12,15,16. Sin embargo, la función fisiológica de ANO1 en los queratinocitos normales de la piel no está clara a pesar de que muchas células epiteliales lo expresan17. Aquí, mostramos que ANO1 se expresa en queratinocitos humanos normales y que estos canales están involucrados en la cicatrización de heridas. Este estudio muestra la importancia de ANO1 en la migración y proliferación celular en queratinocitos normales.

Los niveles de expresión génica endógena de los canales TRP y ANO en NHEK no están claros. Para aclarar los patrones de expresión, realizamos un análisis de RT-PCR de NHEK cultivados (Fig. 1a y Fig. Supl. 11). Informes anteriores sugirieron que las proteínas TRPV1, TRPV3, TRPV4, TRPV6 se expresaron en queratinocitos18. Aquí, observamos ARNm de TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV6, ANO1, ANO4, ANO9 y ANO10 (Fig. 1a y Suplemento Fig. 11). Aunque ANO2 también funciona como un CaCC, no se detectó una banda discreta con el peso molecular predicho en los NHEK. Por el contrario, la expresión de la proteína ANO1 se observó mediante transferencia de Western (Fig. 1b). Además, al usar una alta concentración de calcio intracelular (500 nM de calcio libre) con células NHEK, las corrientes mostraron una cinética de activación lenta durante los pulsos escalonados y una cinética de desactivación lenta al volver al potencial de mantenimiento y rectificación externa, propiedades características de ANO119 (Suppl . Figura 1). Estos resultados sugirieron una expresión significativa de ANO1 en NHEK. Además, realizamos experimentos de imágenes de calcio utilizando Fura-2 para investigar la expresión funcional de los canales TRP. Mientras que el alcanfor (10 mM, un agonista de TRPV3) y GSK1016790A (300 nM, un agonista de TRPV4) obviamente indujeron aumentos de calcio intracelular en todas las células, la capsaicina (300 nM a 3 µM, un agonista de TRPV1), el mentol (100 µM, un agonista de TRPM8) ), isotiocianato de alilo (AITC, 100 µM o 1 mM, un agonista de TRPA1), probenecid (100 µM, un agonista de TRPV2) o 1-oleoil-acetil-sn-glicerol (OAG, 90 µM, un agonista de TRPC6) no produjo respuestas claras (Fig. 1c y Supl. Fig. 2).

una RT-PCR de TRP y ANO en NHEK. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en el suplemento. Fig. 11. b Western blot de ANO1 en NHEK. El tamaño de banda predicho de ANO1 es de 114 kDa. c, d Imágenes de calcio en NHEK. Cam Camphor, un agonista de TRPV3; GSK GSK1016790A, un agonista de TRPV4; Ca2+ (-) Solución de baño sin calcio. e Comparación de relaciones corriente-voltaje. La línea roja indica la relación corriente-voltaje de la corriente basal en los NHEK utilizando una solución estándar de baño y pipeta. La línea azul indica la relación corriente-voltaje en las células HEK293T que expresan TRPV6 utilizando una solución de baño estándar y una solución de pipeta NMDG-Cl. El potencial de retención fue de -60 mV y se aplicaron pulsos de rampa de -100 a +100 mV durante 300 ms de duración cada 5 s.

También realizamos experimentos de imágenes de calcio utilizando un medio extracelular sin calcio porque se supone que las concentraciones de calcio intracelular se reducen al eliminar el calcio extracelular en las células que expresan TRPV6, que puede ser constitutivamente activo. Sin embargo, las concentraciones de calcio intracelular no fueron diferentes en presencia o ausencia de calcio extracelular (Fig. 1d). Además, no se observó una corriente típica mediada por TRPV6 con rectificación interna en los NHEK (Fig. 1e). Con base en estos hallazgos, concluimos que TPRV6 no se expresa funcionalmente en NHEK. Estos resultados indicaron que en NHEK, los canales TRP más activos fueron TRPV3 y TRPV4. Sin embargo, la expresión de otros canales TRP se sugirió en experimentos de RT-PCR. Por lo tanto, ANO1 podría activarse por la entrada de calcio a través de TRPV3 o TRPV4 en células que coexpresan estos canales iónicos. Por lo tanto, decidimos centrarnos en la interacción entre TRPV3 y ANO1 en este estudio porque su interacción no había recibido atención en la literatura.

Realizamos experimentos de pinzamiento de parche de células enteras utilizando células HEK293T que expresan heterólogamente TRPV3 y ANO1 para investigar su interacción funcional. Se usaron soluciones de baño y pipeta de NMDG-Cl para identificar corrientes de cloruro a través de ANO1 porque se sabe que NMDG no penetra en los poros de los canales de cationes. Usamos alcanfor como agonista de TRPV3 ya que un informe anterior mostró que otros agonistas de TRPV3, 2-APB y carvacrol, inhibían las corrientes de ANO120. En estas condiciones, se observaron claramente corrientes de cloruro en células que expresaban tanto TRPV3 humano (hTRPV3) como ANO1 humano (hANO1), pero no en células que expresaban solo hTRPV3 o hANO1 (Fig. 2a, b). Las corrientes se interpretaron como corrientes de cloruro que pasaban a través de hANO1 que habían sido activadas por la entrada de calcio en las células a través de hTRPV3. Las corrientes se observaron incluso con ácido 1, 2-bis (o-aminofenoxi) etano-N,N,N',N'-tetraacético intracelular (BAPTA) (5 mM), que es un quelante de calcio relativamente rápido. Debido a que el calcio se quela rápidamente en presencia de altas concentraciones de BAPTA, los aumentos en las concentraciones de calcio ocurren solo en la vecindad de los canales de calcio21. Por lo tanto, la interacción TRPV3-ANO1 podría ocurrir en un nanodominio de calcio local. Dado que estudios previos sugirieron que tanto TRPV1 como TRPV4 interactuaban físicamente con ANO12,3,22, realizamos experimentos de inmunoprecipitación y transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-ANO1 y anti-TRPV3 con extractos de células HEK293T (Fig. 2c y Fig. Supl. 11) . Las proteínas TRPV3 y ANO1 se coinmunoprecipitaron en células que expresaban ambas proteínas, mientras que no había bandas de TRPV3 en los extractos de células transfectadas con ADNc de hANO1, ADNc de hTRPV3 o plásmido pcDNA3.1 solo, lo que indica la interacción física de hTRPV3 con hANO1. Estos resultados sugirieron una interacción física y funcional entre hTRPV3 y hANO1 en el sistema de expresión heterólogo.

a Un rastro representativo de las corrientes inducidas por alcanfor en células HEK293T que expresan tanto hTRPV3 como hANO1, hANO1 solo o hTRPV3 solo. Todos los datos se recopilaron utilizando un baño de NMDG-Cl y soluciones de pipeta. El calcio libre en la solución de la pipeta era 100 nM. El potencial de retención fue de -60 mV y se aplicaron pulsos de rampa de -100 a +100 mV durante 300 ms de duración cada 5 s. b Comparación de las corrientes máximas de (A) a −60 mV (medias ± SEM, N = 6). La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney. c Inmunoprecipitación de ANO1 o TRPV3 y transferencia Western de TRPV3 en células HEK293T transfectadas con ADNc de TRPV3 y ANO1, Ano1 solo, TRPV4 solo o pcDNA3.1. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en el suplemento. Figura 11.

Se observaron aumentos de calcio intracelular en todos los NHEK tras la aplicación de alcanfor (Fig. 1c). Por lo tanto, realizamos experimentos de abrazadera de parche de células enteras en NHEK. Se observaron corrientes de cloruro inducidas por alcanfor en una solución de baño que contenía cloruro 148 mM (Fig. 3a). El potencial de inversión de las corrientes de cloruro se desplazó a potenciales positivos cuando la concentración de cloruro extracelular se cambió a 4 mM (Fig. 3b, c). Ese resultado indicó que el cloruro era un importante transportador de iones de las corrientes inducidas por alcanfor. Además, realizamos imágenes de calcio en la solución de baño con tarifa de calcio para evaluar la contribución de la reserva de calcio intracelular a los aumentos de calcio intracelular inducidos por alcanfor (Fig. 3d). La liberación de calcio del retículo endoplásmico no contribuyó de manera importante a los aumentos de las concentraciones de calcio intracelular en los NHEK porque los aumentos de las concentraciones de calcio intracelular fueron pequeños en la solución de baño sin calcio. Esta interpretación se confirmó en los experimentos de abrazadera de parche en los que las corrientes inducidas por alcanfor eran muy pequeñas en la solución extracelular sin calcio (Fig. 3e). Por lo tanto, las corrientes de cloruro inducidas por el agonista de TRPV3 a través de ANO1 en NHEK dependen principalmente de la entrada de calcio a través de TRPV3 desde las regiones extracelulares. Además, cuando examinamos si TPRV4 contribuye a las corrientes inducidas por alcanfor, encontramos que el alcanfor 10 mM no activaba hTRPV4 y que HC067047, un inhibidor selectivo de TRPV4, no suprimía la corriente inducida por alcanfor 10 mM en NHEK (Suppl. Fig. 3). Esto descartó la posibilidad de que el alcanfor active de forma no específica TPRV4 y aclara aún más la participación de TRPV3. Las corrientes de cloruro inducidas por alcanfor fueron inhibidas tanto por Ani9, un potente inhibidor de ANO1 (Fig. 3f), como por diclonina, un inhibidor de TRPV323,24 (Supl. Fig. 4). Además, las corrientes inducidas por alcanfor mostraron una cinética de activación lenta en potenciales positivos con propiedades de rectificación hacia el exterior y una recuperación lenta después de los pulsos escalonados, datos consistentes con los canales ANO118 (Supl. Fig. 5). Estos resultados respaldan aún más la interacción TRPV3-ANO1 en NHEK.

a, b Rastros representativos de corrientes inducidas por alcanfor en NHEK usando una solución de baño de NMDG-Cl que contiene cloruro 148 mM (a) o una solución de baño de NMDG-aspartato que contiene cloruro 4 mM (b). La solución de la pipeta contenía NMDG-Cl 140 mM y calcio libre 100 nM. El potencial de retención fue de -60 mV y se aplicaron pulsos de rampa de -100 a +100 mV durante 300 ms de duración cada 5 s. c Comparación de las relaciones corriente-voltaje de las corrientes en las puntas de flecha en (a, b). d Imágenes de calcio de NHEK tras la aplicación de alcanfor con y sin (Ca2+ (-)) calcio extracelular. e Comparación de las corrientes máximas inducidas por alcanfor a −60 mV en una solución de baño de NMDG-Cl con 2 mM (Ca2+ (+)) o sin (Ca2+ (−)) calcio extracelular (medias ± SEM, N = 5). La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney. f Corriente inducida por alcanfor con un inhibidor de ANO1, Ani9, utilizando una solución de baño de NMDG-Cl que contiene cloruro 148 mM.

Para confirmar aún más la interacción TRPV3-ANO1, realizamos experimentos de abrazadera de parche utilizando queratinocitos de la piel de la cola de ratones WT y TRPV3-/-. Observamos grandes corrientes de cloruro inducidas por alcanfor en queratinocitos WT, mientras que tales corrientes nunca se observaron en queratinocitos deficientes en TRPV3 en las soluciones de baño y pipeta de NMDG/cloruro (Fig. 4a-c). Además, las corrientes inducidas por alcanfor fueron inhibidas por Ani9 (Fig. 4d). Estos datos apoyan claramente la interacción TRPV3-ANO1.

a, b Rastros representativos de corrientes inducidas por alcanfor 10 mM en queratinocitos primarios aislados de ratones WT (a) y TRPV3-/- (b). Todos los registros se realizaron con soluciones de pipeta y baño de NMDG-Cl estándar (con calcio libre 100 nM en la pipeta). El potencial de retención fue de -60 mV y se aplicaron pulsos de rampa de -100 a +100 mV durante 300 ms de duración cada 3 s. c Comparación de relaciones corriente-voltaje. N es igual a 5 para queratinocitos WT (negro) y 4 para TRPV3-/- (gris). Las barras de error indican SEM. d Comparación de las densidades de las corrientes inducidas por alcanfor en queratinocitos WT (negro) y TRPV3-/- (gris) a +60 y -60 mV (medias ± SEM). La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney. e Un rastro representativo de corrientes inducidas por alcanfor 10 mM con inhibición de Ani9 en un queratinocito WT. Un rastro representativo de corrientes inducidas por alcanfor 10 mM con inhibición de Ani9 en un queratinocito WT. El potencial de retención fue de -60 mV y se aplicaron pulsos de rampa de -100 a +100 mV durante 300 ms de duración cada 3 s.

Estudios anteriores demostraron que TRPV3 contribuye a las sensaciones de picazón y calor y a la cicatrización de heridas por parte de los queratinocitos5,6,7,8. Se ha sugerido fuertemente que la activación de TRPV3 acelera la cicatrización de heridas en la cavidad oral5. Además, las propiedades histológicas básicas de la cavidad oral son similares a las de la piel en comparación con otras mucosas del cuerpo25. Además, ANO1 podría estar involucrado en el desarrollo de tejidos después del nacimiento26, y es bien conocido que es un regulador positivo de la migración y proliferación en células cancerosas11,12,15,16. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la interacción TRPV3-ANO1 podría afectar la migración y/o proliferación de NHEK y el proceso de cicatrización de heridas.

Para investigar la participación de ANO1 en la cicatrización de heridas, analizamos los efectos de otro bloqueador de ANO1, T16Ainh-A01 (T16A). La evaluación incorporó un inserto de cultivo para cuantificar la actividad celular (Fig. 5). En estos experimentos, las NHEK se cultivaron dentro de un inserto de cultivo con una confluencia de casi el 100 % en la que las células migraron a los espacios entre los grupos de células27 (Fig. 5a). Los NHEK generalmente migraron a los espacios abiertos, un área separada por el inserto, durante ~ 12 h después de que se retiró el inserto. De esta forma, la migración y proliferación llenaron el área en más del 80% en 24 h. La migración y/o proliferación celular fueron inhibidas significativamente por diclonina, un inhibidor selectivo de TRPV3 (Figura 6 complementaria), pero no por HC067047, un inhibidor selectivo de TRPV4 (Figura 7 complementaria). Además, la migración y/o proliferación celular en medio que contenía T16A (5 µM) se inhibió obviamente sin afectar los niveles de proteína ANO1 (Fig. 5b, c y Figs. Supl. 8, 11). Es importante destacar que la inhibición se perdió después del lavado de T16A. Esas observaciones sugirieron que el efecto T16A no se debió a la muerte celular o al daño celular irreversible. Además, Ani9 también inhibió la migración y/o proliferación celular (Supl. Fig. 9). El hecho de que los inhibidores de TRPV3 y ANO1 redujeran la migración y/o proliferación celular indicaba claramente que la interacción TRPV3-ANO1 está implicada en la migración y/o proliferación de NHEK. Analizamos la velocidad de migración celular utilizando imágenes de lapso de tiempo con un microscopio confocal y la proliferación celular utilizando un ensayo MTT (Fig. 5d-f). La velocidad de migración se redujo después de la aplicación de T16A, y la reducción duró durante toda la inhibición de ANO1 (Fig. 5d). Además, la velocidad de migración se recuperó al nivel inicial después del lavado de T16A (Fig. 5d, e). La proliferación celular también se redujo con la aplicación de T16A (Fig. 5f). Estos resultados sugirieron la importancia de los iones de cloruro para la migración y proliferación celular. Por lo tanto, realizamos un ensayo con un inserto de cultivo en un medio bajo en cloruro (Fig. 6). Las concentraciones de cloruro intracelular deben reducirse al agotarse el cloruro extracelular28. Después de retirar los insertos de cultivo, las áreas rellenas se redujeron drásticamente en el medio con bajo contenido de cloruro, efecto que se perdió después del cambio de nuevo al medio de control (Fig. 6). Estos resultados indicaron que el flujo de cloruro a través de ANO1 juega un papel crítico en la migración y/o proliferación celular.

una imagen esquemática del ensayo de inserción de cultivo. b Ensayo de inserción de cultivo en medio con o sin T16A 5 μM. Campo claro a las 0 h y tinción de calceína a las 24 h. Las líneas punteadas blancas a las 0 h indican los bordes de las celdas. El lavado indica el cambio de medio de medio que contiene T16A a medio de control a las 12 h. Las barras de escala indican 500 μm. c Mediciones de áreas aumentadas (área Δ) a las 12 o 24 h en el medio con o sin T16A 5 μM. Los datos representan medias ± SEM (N = 5). La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney. d Velocidad de migración de NHEK con o sin T16A 5 μM en ensayo de inserción de cultivo. Los datos representan medias ± SEM (N = 50). e Velocidad de migración promedio de (d). Cada columna indica la velocidad promedio durante el período de tiempo indicado. Los datos representan medias ± SEM (N = 50). La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney. f Ensayo MTT de NHEK cultivadas en el medio indicado. ABS indica absorbancia. Los datos representan medias ± SEM (N = 6). La significación estadística se determinó con el ANOVA unidireccional seguido de la corrección de Dunnett.

a Ensayo de inserción de cultivo en un medio bajo en cloruro o medio de control. Campos claros a las 0 h y tinción de calceína a las 24 h. Las líneas punteadas blancas a las 0 h indican los bordes de las celdas. El control de 12 h indica un cambio de medio de medio bajo en cloruro a medio de control a las 12 h. Las barras de escala indican 500 μm. b Mediciones de áreas aumentadas (área Δ) a las 12 o 24 h en el medio bajo en cloruro o en el medio de control. Los datos representan medias ± SEM (N = 6). La significación estadística se determinó con la prueba de Mann-Whitney o ANOVA unidireccional seguido de la corrección de Tukey.

Aunque los resultados anteriores sugirieron la importancia de los iones de cloruro para la migración y/o proliferación celular, se desconocen en gran medida las funciones reales de los iones de cloruro en los queratinocitos. Para abordar esta pregunta, intentamos determinar la dirección del movimiento del cloruro. La penetración de cloruro a través de los canales de cloruro depende de las concentraciones de cloruro intracelular y de los potenciales de membrana. Aunque la función de los canales de cloruro podría afectar las concentraciones de cloruro intracelular, deberían mantenerse mediante la función de varios transportadores de cloruro29. Por lo tanto, examinamos los patrones de expresión de los transportadores de cloruro, incluidos los cotransportadores de Na-K-Cl (NKCC) y los cotransportadores de K-Cl (KCC), mediante RT-PCR. Se sugirió la expresión de ARNm de los genes que codifican NKCC1, KCC1, KCC2, KCC3 y KCC4 (Fig. 7a y Suppl. Fig. 11). KCC2 es un KCC específico de neuronas, y las concentraciones de cloruro intracelular se mantienen en un nivel bajo a través de la salida de cloruro de KCC2 en las células del sistema nervioso central, y la apertura de los canales permeables al cloruro provoca la entrada de cloruro. Por lo tanto, realizamos experimentos de imágenes de cloruro utilizando el indicador de cloruro, MQAE30,31,32. Las concentraciones de cloruro intracelular calculadas de NHEK fueron relativamente bajas (6, 8 ± 1, 3 mM) (Fig. 7b, c), lo que es consistente con la expresión de KCC2 al menos en el nivel de ARNm en NHEK. El potencial de equilibrio calculado para los iones de cloruro (−75,7 mV) sugiere que la entrada de cloruro a través de ANO1 ocurriría en los potenciales de membrana en reposo informados en los NHEK (−24 a −40 mV)33,34,35.

una evaluación de RT-PCR de los genes del cotransportador catión-cloruro en los NHEK. RT indica transcripción inversa. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en el suplemento. Fig. 11. b Una imagen representativa del indicador fluorescente apagado con iones de cloruro, MQAE, en NHEK. La barra de escala indica 10 μm. c Una curva de calibración y concentraciones de cloruro intracelular calculadas en NHEK. La curva de calibración se realizó con un gráfico de Stern-Volmer, F0/F = 1 + Kq[Cl]. F0: intensidad de fluorescencia a 0 mM de cloruro, F intensidad de fluorescencia a cada concentración de cloruro, coeficiente de extinción Kq.

Estudios previos sugirieron que bajas concentraciones de cloruro intracelular inducen la fosforilación de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), aunque sus mecanismos precisos no se conocen bien. Las cascadas de MAPK están involucradas en la vida y muerte de muchas células36,37 (Fig. 8a). Por ejemplo, la cinasa relacionada con la señal extracelular (ERK), que es fosforilada por la MAPK cinasa (MKK)1/2, participa en la proliferación y diferenciación celular. Por otro lado, p38 y c-Jun N-terminal kinase (JNK), que son fosforilados por MKK3/4/6 y MKK4/7, respectivamente, inducen la detención del ciclo celular y la apoptosis. Por lo tanto, investigamos la fosforilación de MAPK utilizando un método de transferencia Western (Fig. 8b, c y Supl. Fig. 11). Un inhibidor de ANO1, T16A, aumentó la fosforilación de p38, pero no la de ERK o JNK. Estos resultados sugirieron que ANO1 está involucrado en la detención del ciclo celular y/o la apoptosis. Sin embargo, la inhibición de ANO1 no indujo la muerte celular en el ensayo de inserción de cultivo basado en el hecho de que la apariencia celular visualizada con una tinción de calceína-AM no se vio afectada por la inhibición de ANO1 (Fig. 5). Además, no hubo efectos del tratamiento con T16A en la expresión de genes relacionados con la diferenciación, incluidos KRT1, IVL y TGM1, tanto en condiciones diferenciadas como no diferenciadas (Supl. Figs. 10, 11). Este resultado es consistente con la falta de efectos del tratamiento con T16A sobre la fosforilación de ERK (Fig. 8b), que se sabe que está relacionada con la diferenciación (Fig. 8a). Por lo tanto, decidimos centrarnos en la detención del ciclo celular.

una Representación esquemática de la señalización de MAP quinasa. b Imágenes representativas de transferencia Western para MAP quinasas totales y MAP quinasas fosforiladas. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en el suplemento. Fig. 11. c Análisis cuantitativo de transferencia Western para MAP quinasas fosforiladas/totales. Los datos representan medias ± SEM (N = 7 para pERK y pp38, N = 4 para pJNK. La significación estadística se determinó con una prueba de Mann-Whitney.

Debido a que los análisis de MAPK sugirieron la detención del ciclo celular mediante la inhibición de ANO1, realizamos un ensayo del ciclo celular utilizando un tinte redox (Fig. 9). Las condiciones redox están íntimamente relacionadas con el ciclo celular38. Por ejemplo, las condiciones redox intracelulares en las células en las fases G0/G1 son relativamente reductoras, mientras que las condiciones redox se desplazan gradualmente hacia otras más oxidativas tras la progresión a las fases G2/M. En este sistema de ensayo, las células en fase G0/G1, fase S y fase G2/M se pueden visualizar como amarillo verdoso, verde y azul oscuro, respectivamente (Fig. 9a). Para aclarar la variación de color, cada celda se visualizó como un color rojo dependiendo de los niveles de señal (Fig. 9b). El tratamiento con T16A aumentó las poblaciones celulares en las fases G0/G1 y redujo las poblaciones celulares en la fase S durante el ensayo de inserción de cultivo (Fig. 9b, c). Este resultado indicó que la progresión del ciclo celular de G0/G1 a la fase S fue suprimida por la inhibición de ANO1.

a Una imagen representativa de la tinción con colorante redox para el análisis del ciclo celular. La barra de escala indica 100 μm. b Imágenes representativas de células en presencia o ausencia de T16A 5 μM en el inserto de cultivo celular. Las celdas marcadas en rojo están en la fase indicada. La barra de escala indica 500 μm. c Comparación de los porcentajes de cada fase. Los datos representan medias ± SEM (N = 7). La significación estadística se determinó con ANOVA unidireccional seguido de corrección de Dunnett.

En contraste con estudios previos, nuestros resultados mostraron que la expresión funcional de los canales TRP se limitaba a TRPV3 y TRPV4, aunque se observó expresión de ARNm de otros canales TRP en NHEK (Fig. 1 y Suppl. Fig. 2). Según se informa, la expresión de proteínas cambia dependiendo de las condiciones de diferenciación en los queratinocitos39. Por lo tanto, los canales de TRP cuya expresión funcional no se confirmó en nuestros experimentos podrían ser funcionales en otras condiciones de diferenciación específicas. En particular, se informó que TRPV6 y TRPC6 están involucrados en la diferenciación de queratinocitos, y la expresión de TRPC6 aumentó con los estímulos de diferenciación40,41. Observamos la interacción TRPV3-ANO1 en este estudio, y nuestro laboratorio informó resultados similares para TRPV4-ANO1 en células epiteliales2,3. Sin embargo, la interacción entre ANO1 y otros canales TRP cuya expresión funcional no fue confirmada en este estudio podría ocurrir en células diferenciadas.

Se sabe que TRPV4 interactúa con ANO1, y se descubrió que TRPV3 es un nuevo socio candidato de ANO1 en NHEK. Los experimentos de abrazadera de parche mostraron la interacción TRPV3-ANO1 en células HEK293T y NHEK (Figs. 2, 3 y Supl. Fig. 11). Además, se co-inmunoprecipitó TRPV3 utilizando un anticuerpo anti-ANO1 en células HEK293T que expresan tanto TRPV3 como ANO1. Estos resultados sugieren que TRPV3 y ANO1 forman un complejo con un nanodominio de calcio y que ANO1 se activa efectivamente cuando el calcio ingresa a las células a través de TRPV3, como es el caso de TRPV4. Se sabe que los aumentos en las concentraciones de calcio intracelular aguas abajo de la activación del receptor sensible al calcio (CaSR) inducen la diferenciación en los queratinocitos42. Por lo tanto, podría haber dos tipos diferentes de aumentos en las concentraciones de calcio intracelular: uno local a través de la activación de TRPV3 que activa ANO1 y uno global que puede ser causado por varios mecanismos, como la señalización de CaSR.

Evaluamos la función fisiológica de la interacción TRPV3-ANO1. Un estudio anterior mostró que TRPV3 estaba involucrado en la cicatrización de heridas en queratinocitos5. De hecho, TRPV3 es sensibilizado por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) luego de la estimulación por el EGF liberado durante la cicatrización de heridas. Además, el factor de crecimiento transformante alfa (TGFα), un ligando de EGFR, se libera de los queratinocitos mediante la activación de TRPV3. Se cree que este sistema autocrino representa uno de los mecanismos moleculares para la curación de heridas a través de la actividad TRPV3. Nuestros ensayos con inserciones de cultivo indican que la inhibición de TRPV3 o ANO1 reduce la migración y/o proliferación celular (Fig. 5 y Supl. Figs. 6, 9). Por lo tanto, la interacción TRPV3-ANO1 podría ser un mecanismo molecular importante para la cicatrización de heridas en la piel, lo que sugiere que existen dos procesos para la cicatrización de heridas que implican la actividad de TRPV3. Un informe anterior sugirió que la localización de membrana de ANO1 es importante para la migración de células cancerosas independientemente de la actividad del canal de cloruro43. En ese experimento, solo CaCCinh-A01 disminuyó la proliferación celular e indujo la degradación de la proteína ANO1 entre varios inhibidores de ANO1 (incluido T16A) que usaron. Sin embargo, en nuestros experimentos, el tratamiento con T16A disminuyó la proliferación de NHEK sin efectos sobre los niveles de proteína ANO1 (Fig. 5 y Suppl. Figs. 8, 11). Además, nuestro hallazgo de que las condiciones bajas en cloruro también inhibieron la migración y/o proliferación celular en ensayos de inserción de cultivo (Fig. 6) respalda la importancia del movimiento de cloruro a través de ANO1 para la cicatrización de heridas.

Otro informe reveló que ANO1 induce hiperproliferación de células HaCaT, una línea celular especial de queratinocitos14, un resultado que es consistente con nuestros resultados. Sin embargo, los autores demostraron que la inhibición de ANO1 redujo la fosforilación de ERK, una de las MAPK, y no discutieron la participación de p38. En nuestros experimentos, la inhibición de ANO1 no afectó la fosforilación de ERK, mientras que se indujo la fosforilación de p38. Esta diferencia podría deberse a que HaCaT es una línea celular con un requerimiento especial de calcio que la diferencia de los queratinocitos normales.

La dirección del movimiento del cloruro está estrictamente regulada por el equilibrio de las concentraciones de cloruro intracelular y los potenciales de membrana. Por ejemplo, las concentraciones de cloruro intracelular se mantienen en un nivel bajo por la actividad de KCC2 en las neuronas maduras del sistema nervioso central29, lo que lleva a la hiperpolarización tras la entrada de cloruro. Mostramos que las concentraciones basales de cloruro intracelular en los queratinocitos eran bajas, lo que concuerda con la expresión de KCC2 (Fig. 7 y Supl. Fig. 11). Debido a que se informa que los potenciales de membrana en reposo de los queratinocitos de la piel oscilan entre -24 y -40 mV33,34,35, la apertura de ANO1 debería inducir la entrada de cloruro y su inhibición probablemente disminuya los iones de cloruro intracelulares dentro de los queratinocitos. Aunque generalmente se piensa que KCC2 es específico de las neuronas44, un informe reciente mostró que las células β pancreáticas también expresaban KCC245, lo que sugiere que KCC2 podría expresarse más ampliamente de lo esperado. Dado que tanto los queratinocitos como las neuronas son células ectodérmicas en origen46,47, sería razonable que el KCC2 específico de las neuronas pudiera controlar las concentraciones de cloruro intracelular tanto en las neuronas como en los queratinocitos.

En las células cancerosas, la disminución de las concentraciones de cloruro intracelular induce la fosforilación de p38 y JNK. Ese cambio, a su vez, aumenta la expresión de p21, lo que conduce a la inhibición de la función del complejo CDK2/Ciclina E, seguida de la detención del ciclo celular en la fase G148,49. De acuerdo con informes previos en células cancerosas, la inhibición de ANO1 en NHEK indujo la fosforilación de p38 (Fig. 8 y Suppl. Fig. 11). Se sabe que p38 regula negativamente el ciclo celular36. Ese hallazgo, junto con la reducción en la proliferación celular lograda por la inhibición de ANO1 (Fig. 5f), sugiere que la inhibición de ANO1 provoca la detención del ciclo celular. Como se esperaba, el tratamiento con T16A aumentó la proporción de células dentro de las fases G0/G1 y redujo las células dentro de la fase S en el ensayo de inserción de cultivo (Fig. 9b, c). Los resultados indican que la detención del ciclo celular ocurre entre las fases G0/G1 y la fase S. Ese hallazgo es consistente con estudios previos que mostraron que las células fueron detenidas en el punto de control G1/S cuando las concentraciones de cloruro intracelular se redujeron en las células cancerosas48,49. Por lo tanto, estas observaciones sugieren que el ciclo celular de los queratinocitos también está controlado por cambios en las concentraciones de cloruro intracelular aguas abajo de la señalización de TRPV3-ANO1.

Nuestro estudio sugiere que TRPV3 induce la entrada de cloruro a través de ANO1. Esta entrada de cloruro podría mantener adecuadamente el ciclo celular a través de la inhibición de la fosforilación de p38. Por lo tanto, las disminuciones en la proliferación celular causadas por T16A (Fig. 5f) podrían explicarse en parte por la detención del ciclo celular a través de la inhibición de ANO1. Nuestros datos también mostraron que la inhibición de ANO1 ralentizó la migración celular (Fig. 5d, e). Aunque se desconocen los mecanismos para controlar la velocidad de migración de ANO1, un informe anterior mostró que las moléculas que inhiben el ciclo celular, como p21, reorganizaron el citoesqueleto a través de una vía mediada por ROS, regulando así la migración celular50. Así, el cloruro también podría controlar la migración celular a través de las mismas moléculas que inhiben el ciclo celular. Si bien se desconoce el mecanismo exacto por el cual el cloruro regula la fosforilación de MAPK, las concentraciones de cloruro intracelular podrían regular directamente los niveles de fosforilación como se informó para la regulación de la actividad de la fosfatasa51. Definitivamente son necesarios más estudios para aclarar las funciones del cloruro en las vías de señalización celular de los queratinocitos. No obstante, la interacción de TRPV3 y ANO1 encontrada en este estudio sugiere que podrían regular positivamente la proliferación y migración de queratinocitos durante la cicatrización de heridas.

Este estudio demuestra que el ion cloruro es un regulador del ciclo celular en los queratinocitos. Estos datos sugieren nuevos enfoques para promover la cicatrización de heridas. La hiperproliferación de queratinocitos es la causa del acné en el sitio folicular. Normalizar esta hiperproliferación es una estrategia terapéutica importante para el acné52. Sin embargo, no se ha enfatizado la importancia de los iones de cloruro en un entorno terapéutico de este tipo. Nuestro análisis de la interacción TRPV3-ANO1 representa un punto de partida prometedor para futuras investigaciones sobre los mecanismos detallados que subyacen a las concentraciones de cloruro intracelular. Por lo tanto, nuestro estudio podría arrojar luz sobre la importancia de los iones de cloruro en la homeostasis de la piel.

El Dr. Patapoutian proporcionó ratones homocigotos deficientes en TRPV3 (TRPV3-/-). Los ratones de tipo salvaje (WT) y TRPV3-/- de fondo C57BL/6 se mantuvieron en condiciones SPF en un entorno controlado (ciclo de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a comida y agua, 25 °C y 50–60 % humedad). Se utilizaron ratones macho de siete semanas de edad. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Ciencias Naturales y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Salud y el Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas.

T16Ainh-A01 (T16A, Calbiochem) y Ani9 (Sigma-Aldrich) se usaron como inhibidores de Ano1. Se utilizó diclonina (MedChemExpress) como inhibidor de TRPV3. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-ANO1 de conejo (Abcam, ab53213, 1:5 para transferencia Western), (Abcam, ab53212, 1:100 para inmunoprecipitación), anticuerpo de conejo anti-fosfo-ERK (quinasa relacionada con la señal extracelular) (Tecnología de señalización celular, #4370, 1:1000), anticuerpo anti-fosfo-p38 de conejo (Tecnología de señalización celular, #4511, 1:1000), anticuerpo anti-fosfo-JNK (quinasa N-terminal c-Jun) de conejo ( Tecnología de señalización celular, n.° 4668, 1:1000), anticuerpo anti-ERK de conejo (Tecnología de señalización celular, n.° 4695, 1:1000), anticuerpo anti-p38 de conejo (Tecnología de señalización celular, n.° 8690, 1:1000), anticuerpo anti-p38 de conejo -Anticuerpo JNK (Tecnología de señalización celular, #9252, 1:1000), anticuerpo anti-β-actina de ratón (Abcam, ab6276, 1:2500), anticuerpo anti-TRPV3 de conejo (Tecnología de señalización celular, #3484, 1:1000 para transferencia Western; 1:50 para inmunoprecipitación), anticuerpo anti-HRP de conejo (Cell Signaling Technology, #7074, 1:2000) y anticuerpo anti-HRP de ratón (Cell Signaling Technology, #7076, 1:2000).

Las células HEK293T (ATCC CRT-3216) se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5 % en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Wako) que contenía suero bovino fetal al 10 % (BioWest), 50 unidades/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina (Life Technologies ), y glutamina 2 mM/L (GlutaMAX, Life Technologies). Los queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK, Adulto, KURABO) se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5 % en Humedia-KG2 (KURABO). Se utilizó medio MCDB153 personalizado que carece de NaCl (Instituto de Investigación de Péptidos Funcionales) para experimentos con bajo contenido de cloruro. Se utilizó medio MCDB153 personalizado añadiendo NaCl 130 mM o aspartato de sodio 130 mM y O-fosforiletanolamina 0,1 mM (Sigma), etanolamina 0,1 mM (Sigma), hidrocortisona 0,5 μg/ml (Sigma), factor de crecimiento epidérmico (EGF) 5 ng/ml , Miltenyi Biotec) y 5 μg/mL de insulina (Sigma).

Los queratinocitos de la piel se aislaron con base en la descripción anterior con modificaciones menores53. Brevemente, se usaron colas de ratones para preparar los queratinocitos. Las colas disociadas se incubaron durante la noche a 4 °C en 4 mg/mL DISPASE II (Wako, 383-02281) en medio MCDB153 personalizado (CSR) que contenía 5 ug/mL de insulina (Sigma, I1882), 0,4 ug/mL de hidrocortisona (Sigma , H0888), 10 ug/ml de transferrina (Sigma, T8158), 14,1 ug/ml de fosforiletanolamina (Sigma, P0503), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Sigma, E4127), 25 ug/ml de gentamicina (Gibco, 15710064), 50 unidades/mL de penicilina, 50 ug/mL de estreptomicina y 40 ug/mL de extractos de pituitaria bovina (Kyokuto, 20200). Después de 16 h de incubación, se despegó la epidermis y se incubó con tripsina al 0,25 % (Gibco, 15050065) durante 20 min a temperatura ambiente con la capa basal hacia abajo. A continuación, los queratinocitos se disociaron mecánicamente con pinzas de disección y se filtraron a través de un filtro de células de 100 um. A continuación, las células se sembraron en cubreobjetos para experimentos de pinzamiento de parche. Todas las grabaciones se realizaron el día 3 y el día 4 después del aislamiento.

El ARN total se purificó a partir de NHEK utilizando Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque) o RNeasy Micro (QIAGEN). La transcripción inversa se realizó utilizando la transcriptasa inversa Super Script III (Invitrogen) durante 50 min a 50 °C. Para la investigación de la expresión de ARNm de potenciales receptores transitorios (TRP), anoctaminas (ANO) y cotransportadores de cloruro de cationes (CCC) en NHEK, los fragmentos de ADN se amplificaron utilizando EmeraldAmp PCR Master Mix (TAKARA) con los cebadores de PCR que se muestran en la Tabla 1. Los productos de la PCR se confirmaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 % que contenía bromuro de etidio.

Las proteínas se extrajeron de los NHEK tratados con T16A 10 μM o medio de control durante 13 h. Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron mediante tratamiento con tampón de lisis (1% de Triton X-100 que contenía NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, Na3VO4 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa, completo (Roche), pH 7,5). Después de la centrifugación a 10.000 × g durante 30 s, los sobrenadantes se desnaturalizaron mediante tratamiento con tampón SDS que contenía Tris-HCl 0,5 M, dodecilsulfato de sodio al 10 %, β-mercaptoetanol al 6 %, glicerol al 10 %, azul de bromofenol al 0,01 %, ditiotreitol 100 mM , a 90 °C durante 5 min. Las muestras de proteína se usaron en SDS-PAGE.

La transfección transitoria de células HEK293 se logró con el reactivo de transfección de lipofectamina (Life Technologies), el reactivo PLUS (Life Technologies) y el medio de suero reducido Opti-MEM I (Life Technologies). Los plásmidos de ADN (hTRPV6/pcDNA3.1, hTRPV3/pcDNA3, hANO1/pcDNA3.1 o pcDNA3.1) se transfectaron con pGreen Lantern 1 en células HEK293T, y las células transfectadas se usaron para registro de pinzamiento e inmunoprecipitación 16–30 h después de la transfección.

Los NHEK en cubreobjetos se incubaron a 37 °C durante 30 min en Humedia-KG2 que contenía éster de fura-2-acetoximetilo 5 μM (Molecular Probes). Los cubreobjetos se lavaron con una solución de baño estándar que contenía NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM y d-glucosa 10 mM a pH 7,4, ajustado con NaOH. Se preparó una solución de baño sin calcio omitiendo CaCl2 2 mM de la solución de baño estándar y añadiendo EGTA 5 mM. Fura-2 se excitó con luces de longitud de onda de 340 y 380 nm y la emisión se controló a 510 nm con una cámara CCD, Cool Snap ES (Roper Scientific/Photometrics) a temperatura ambiente. Los datos se adquirieron utilizando el software de laboratorio IP (Scanalytics) y se analizaron con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud). Se aplicó ionomicina (5 μM, Sigma-Aldrich) para confirmar la respuesta máxima de cada célula. La solución de baño con alto contenido de K+ contenía NaCl 65 mM, KCl 80 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM y d-glucosa 10 mM a pH 7,4, ajustado con NaOH.

Se usaron células HEK293T transfectadas, NHEK o queratinocitos de ratón aislados para grabaciones de células completas. Las pipetas de parche se fabricaron con vidrio de borosilicato (tipo 8250, King Precision Glass) con un protocolo de cinco pasos utilizando un P-2000 (Sutter Instrument). La resistencia de la pipeta fue de 3 a 8 MΩ. Las corrientes se registraron a 10 kHz utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices) y se filtraron a 5 kHz con un filtro de paso bajo. Las corrientes se digitalizaron con un Digidata 1440 A o 1550 (Axon Instruments). La adquisición de datos se logró con el software pCLAMP 10 (Axon Instruments). Cuatro soluciones extracelulares para el registro de células completas fueron las siguientes: (1) una solución de baño estándar (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM y d-glucosa 10 mM a pH 7,4, ajustado con NaOH); (2) una solución de baño de NMDG-Cl (NMDG 140 mM, HCl 140 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM y d-glucosa 10 mM a pH 7,4, ajustado con HCl); (3) una solución de baño de NMDG-Cl sin calcio que se preparó omitiendo CaCl2 2 mM de la solución de baño de NMDG-Cl y agregando 5 mM de EGTA, y (4) una solución de baño de NMDG-aspartato que se preparó usando l- ácido aspártico en lugar de HCl. Las soluciones de pipeta fueron las siguientes: (1) una solución de pipeta estándar (KCl 140 mM, EGTA 5 mM, MgCl2 2 mM y HEPES 10 mM a pH 7,3, ajustada con KOH) o (2) una solución de pipeta de NMDG-Cl ( NMDG 140 mM, HCl 140 mM, BAPTA 5 mM, MgCl2 2 mM y HEPES 10 mM a pH 7,3, ajustado con HCl). Se añadió CaCl2 a la solución de pipeta para que la concentración de calcio libre fuera de 100 o 500 nM. Las concentraciones de calcio libre se calcularon con el programa MAXC de la Universidad de Stanford.

Las proteínas se extrajeron de las células HEK293T después de la transfección. Las células se lisaron como se describe en Western Blot. Después de la centrifugación a 16.100 xg durante 30 min, los sobrenadantes se incubaron en un rotador durante 2 h con proteína G Mag Sepharose (GE Healthcare). Después de retirar las perlas magnéticas, los sobrenadantes se incubaron en un rotador durante la noche con un anticuerpo anti-TRPV3 o un anticuerpo anti-ANO1. Después de la incubación, se añadió proteína G Mag Sepharose y las soluciones se incubaron en un rotador durante 2 h. Después de la incubación, las perlas magnéticas se enjuagaron con tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Las proteínas se desnaturalizaron con tampón SDS a 95 °C durante 5 min. Las muestras de proteínas se evaluaron mediante SDS-PAGE. La transferencia se realizó con anticuerpos anti-TRPV3 y anti-HRP de conejo.

Los NHEK se sembraron de manera confluente en insertos de cultivo de dos pozos (ibidi) en platos con fondo de vidrio (Matsunami). Los insertos de cultivo se retiraron después de una incubación durante la noche, seguido de un lavado con PBS. A continuación, las células se cultivaron en medio Humedia-KG2, MCDB153 o bajo en cloruro MCDB153. Después de 12 o 24 h de cultivo, se añadió calceína-AM (Dojindo) al medio de cultivo para visualizar las células. El software ImageJ se utilizó para el análisis de datos. Para el análisis de lapso de tiempo, las células se cultivaron en una incubadora Stage Top (TOKAI HIT) en un microscopio de barrido láser confocal (IX83 Olympus) y se capturaron imágenes cada 10 min.

Los NHEK se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon). Las células se cultivaron en un medio de control, medio que contenía T16A 10, 5 o 2,5 µM durante 24 o 48 h. Después del cultivo, se realizaron ensayos de MTT utilizando un kit de ensayo de proliferación de células MTT (Cayman). La absorbancia del formazán se midió con un lector de microplacas (Multiskan Spectrum, Thermo Fisher) a 570 nm.

Los NHEK se sembraron en platos con fondo de vidrio (Matsunami). Las células se incubaron con MQAE 10 mM (indicador fluorescente apagado con iones de cloruro, Dojindo) durante 60 min a 37 ° C en una incubadora Stage Top (TOKAI HIT) en un microscopio de barrido láser confocal (LSM 510META, Carl Zeiss). MQAE se excitó a 780 nm utilizando un sistema láser de excitación de dos fotones (Mai Tai, Spectra-Physics) y la emisión fue de 458 a 479 nm.

La solución de calibración de cloruro 0 mM contenía NaNO3 10 mM, KNO3 140 mM, Ca(NO3)2 0,5 mM, Mg(NO3)2 0,5 mM, HEPES 10 mM y D-glucosa 5 mM a pH 7,4, ajustado con CsOH. La solución de calibración de cloruro 100 mM contenía NaNO3 10 mM, KCl 100 mM, KNO3 40 mM, Ca(NO3)2 0,5 mM, Mg(NO3)2 0,5 mM, HEPES 10 mM y D-glucosa 5 mM a pH 7,4, ajustada con CsOH. La solución de calibración de cloruro 50 mM se preparó mezclando solución de calibración de cloruro 0 y 100 mM 1:1. Cada solución de calibración se usó agregando nigericina (ionóforo de catión monovalente), valinomicina (ionóforo de potasio) y tributilestaño (ionóforo de cloruro) para que las concentraciones finales fueran 5, 10 y 10 μM, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron a 37 °C.

Los NHEK se sembraron de la misma manera que en el ensayo de cicatrización de heridas. Después de retirar el inserto de cultivo a las 12 h, las células se tiñeron con un kit de ensayo de ciclo celular Cell-Clock (Biocolor). El software ImageJ se utilizó para el análisis de datos. La distribución de las fases del ciclo celular se definió como el color umbral. Las celdas de fase G2/M (azul oscuro) se definieron como Hlu 0–255, Saturación 40–255, Brillo 0–90. Las celdas de fase S (verde) se definieron como Hlu 70–255, Saturación 40–255, Brillo 90–255. Las celdas de fase G0/G1 (amarillo-verde) se definieron como Hlu 0–70, Saturación 40–255, Brillo 90–255.

Los datos se expresaron como medias ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de Mann-Whitney de dos colas o ANOVA unidireccional para calcular la importancia de las diferencias entre los dos grupos. Se utilizó la corrección de Bonferroni o la prueba de Dunnett para calcular la importancia de las diferencias entre comparaciones múltiples. p < 0,05 se consideró significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos y materiales utilizados en el análisis están disponibles en el texto principal con Figuras e Información Complementaria. Todas las imágenes de gel sin recortar están disponibles en Supl. higos. 11. Los datos del análisis estadístico estaban disponibles en Datos complementarios 1. Otros datos o información que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente MT ([email protected]), previa solicitud.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones a MT de una Subvención de Ayuda para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (#21H02667 y #20H05768; Investigación Científica en Áreas Innovadoras "Biología Térmica") .

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Yu Yamanoi, Jing Lei y Makoto Tominaga

División de Señalización Celular, Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8787, Japón

Yu Yamanoi, Jing Lei y Makoto Tominaga

Laboratorio de investigación, Ikedamohando Co., Ltd., 16 Jinden, Kamiichi, Nakaniikawa, Toyama, 930-0394, Japón

Yu Yamanoi

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Showa, Tokio, 142-8555, Japón

Yasunori Takayama

Departamento de Fisiología Clínica y Traslacional, Universidad Farmacéutica de Kioto, 5 Nakauchi-cho, Misasagi, Yamashina-ku, Kioto, 607-8414, Japón

Shigekuni Hosogi

Organización de Investigación de Ciencia y Tecnología, Universidad Ritsumeikan, Kusatsu, 525-8577, Japón

Yoshinori Marunaka

Instituto de Investigación Médica, Asociación de Salud Industrial de Kioto, Kioto, 604-8472, Japón

Yoshinori Marunaka

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YY, YT, JL y MT diseñaron experimentos e interpretaron datos. YY y JL realizaron experimentos y analizaron los datos. SH y YM contribuyeron al experimento de imágenes de cloruro. El manuscrito fue preparado por YY, YT y MT. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Makoto Tominaga.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Viktorie Vlachova, KeWei Wang y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Janesh Kumar y Zhijuan Qiu. Los informes de los revisores están disponibles

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Yamanoi, Y., Lei, J., Takayama, Y. et al. La interacción TRPV3-ANO1 regula positivamente la cicatrización de heridas en los queratinocitos. Comun Biol 6, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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Recibido: 03 Abril 2022

Aceptado: 13 de enero de 2023

Publicado: 23 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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