Blog

Oct 21, 2023

El ciclo de los triglicéridos permite la modificación de los ácidos grasos almacenados

Metabolismo de la naturaleza volumen 5,

Nature Metabolism volumen 5, páginas 699–709 (2023) Citar este artículo

9333 Accesos

2 citas

196 Altmetric

Detalles de métricas

El ciclo de triglicéridos es el proceso de degradación continua y resíntesis de triglicéridos en los depósitos celulares. Mostramos en los adipocitos 3T3-L1 que los triglicéridos están sujetos a una rápida renovación y reorganización de los ácidos grasos con una vida media estimada de 2 a 4 h. Desarrollamos una tecnología de rastreo que puede seguir de manera simultánea y cuantitativa el metabolismo de múltiples ácidos grasos para estudiar el ciclo del sustrato fútil de triglicéridos directamente y con resolución de especies moleculares. Nuestro enfoque se basa en trazadores de ácidos grasos alquinos y espectrometría de masas. El ciclo de los triglicéridos está relacionado con la modificación de los ácidos grasos liberados por elongación y desaturación. A través del ciclo y la modificación, los ácidos grasos saturados se convierten lentamente en ácidos grasos monoinsaturados y el ácido linoleico en ácido araquidónico. Concluimos que el ciclo de los triglicéridos hace que los ácidos grasos almacenados sean accesibles para la alteración metabólica. El proceso general facilita los ajustes celulares a la reserva de ácidos grasos almacenados para satisfacer las necesidades cambiantes de la célula.

El ciclo de triglicéridos/ácidos grasos (TG/FA) es el proceso de degradación parcial o completa de la grasa almacenada para liberar AG libres que posteriormente se utilizan para resintetizar una nueva molécula de TG. Por un lado, puede tener lugar a nivel de todo el cuerpo, donde los AG libres liberados del tejido adiposo pueden volver a esterificarse a TG en el hígado, lo que conduce a la redistribución de la energía almacenada en el organismo1. Por otro lado, también tiene lugar intracelularmente, como un típico ciclo de sustrato 'fútil' que consume energía sin una síntesis neta de material biológico2. El ciclo del sustrato intracelular en general es un desafío científico tanto conceptual como experimental. Desde el punto de vista conceptual, la pregunta es si los efectos beneficiosos de los ciclos del sustrato pueden compensar los costos energéticos o si el ciclo del sustrato es una imperfección inevitable de las redes complejas. Las primeras investigaciones sobre el ciclo TG/FA enfatizaron su papel regulador, en particular en la adaptación a cambios rápidos en el consumo de energía3,4, mientras que los costos energéticos del ciclo se consideraron pequeños5. En los últimos años, sin embargo, se ha originado un creciente interés en el ciclo a partir de la idea de que podría contribuir sustancialmente a la termogénesis en el tejido adiposo6,7. Una mejor comprensión de las vías termogénicas podría conducir a nuevas estrategias para influir en el gasto de energía, posiblemente útiles en la lucha contra la pandemia global de obesidad8,9.

Las limitaciones en la tecnología experimental son un obstáculo importante para una mejor comprensión del ciclo TG/FA. Cuando se utiliza el etiquetado de isótopos convencional, la determinación precisa y directa de la velocidad y las vías de ciclado es un desafío para el seguimiento metabólico, porque los eductos y los productos pueden volverse indistinguibles ya después de una ronda de ciclado (Fig. 1a). Por lo tanto, los métodos existentes para estudiar el ciclo TG/FA son más bien indirectos. Las determinaciones radiométricas de la incorporación de [3H]FA y [14C]glucosa con la determinación paralela de la liberación de glicerol10 o estrategias similares con isótopos estables3 dieron información sobre el grado de esterificación y reesterificación de los AG a partir del cual se podía deducir el ciclo al menos en términos relativos. Otros métodos utilizan el etiquetado [2H]H2O o [18O]H2O. El enriquecimiento de estos isótopos en TG proporcionó información sobre la síntesis total y el recambio de TG11. Sin embargo, falta un experimento de seguimiento directo para mostrar que un grupo 1 de TG celular definido daría lugar a un nuevo grupo 2 al reutilizar los FA del grupo 1, como se ilustra en la Fig. 1b. Esto requeriría un experimento de etiquetado con un seguimiento multiparalelo integral de todas las moléculas de TG marcadas posibles, lo cual es un enorme desafío técnico. Recientemente, hemos desarrollado una tecnología de rastreo basada en FA marcados con alquinos con indicadores químicos de clic y espectrometría de masas (MS)12,13. Combina todas las características necesarias para el estudio del ciclo TG/FA: alta sensibilidad, especificidad inequívoca y, en particular, fácil discriminación de especies de lípidos con uno o varios marcadores12.

El ciclo de TG consiste en la degradación permanente de las moléculas de TG y la resíntesis concomitante. a, Representación esquemática de la degradación y resíntesis. Las líneas azules simbolizan los FA y la línea horizontal negra la columna vertebral del glicerol. El ciclo de TG debe comprender al menos la degradación a DG, pero puede incluir una mayor degradación a MG o glicerol libre. Se supone que todos los FA liberados alimentan un grupo común que se activa en acil-CoA y se puede usar para la reacilación. El glicerol no está sujeto a reacilación en los adipocitos y se libera al medio. b, Al realizar el ciclo, los TG con más de un FA marcado (líneas rojas) equilibrarán su marca con el grupo sin marcar (azul), cambiando la marca de especies multimarcadas a especies monomarcadas. Con la tecnología dedicada desarrollada en el presente estudio, este proceso puede seguirse con resolución molecular a lo largo del tiempo.

A continuación, aplicaremos esta tecnología para proporcionar evidencia directa del ciclo de TG/FA, dar una estimación de la vida media de TG en el proceso de ciclado y demostrar que el ciclo de TG es necesario para la homeostasis del grupo de FA almacenado.

En un experimento de rastreo convencional, se agrega una sustancia con una sola etiqueta a un sistema y se realiza un seguimiento de sus metabolitos a lo largo del tiempo, con una clara asignación lógica de los metabolitos etiquetados a la etiqueta original. Sin embargo, los adipocitos están expuestos a la mezcla diversa de AG que se origina en los alimentos, con una amplia gama de longitudes y números de dobles enlaces que forman especies mixtas en los TG almacenados. Para rastrear la síntesis y el recambio de TG, se debe usar un conjunto igualmente diverso de FA diferentes como marcadores, lo que posteriormente requeriría una identificación inequívoca de la etiqueta en cada metabolito posible. En consecuencia, la complejidad máxima de la mezcla de marcaje está limitada por la posible discriminación analítica. Para cubrir una amplia gama de longitudes y grados de insaturación con solo tres compuestos, combinamos un alquino-FA de cadena media saturado, un alquino-FA de cadena larga saturado y un alquino-FA de cadena larga poliinsaturado (alquino-PUFA). Para distinguir inequívocamente los tres FA durante el rastreo simultáneo, usamos un alquino-FA impar y uno par en combinación con un tercer alquino-FA que además lleva una etiqueta de isótopo estable. Los dos primeros, cuando se combinan metabólicamente con ácidos grasos pares endógenos, darían lugar a metabolitos distinguibles con números pares e impares, respectivamente. Los metabolitos del tercer trazador podrían distinguirse fácilmente por la etiqueta del isótopo. En consecuencia, combinamos el medio de cadena impar FA 11: 0; Y (Fig. 2a; para la nomenclatura de lípidos alquinos, consulte Métodos) con el alquino PUFA 18: 2; Y de cadena par y el isótopo marcado saturado largo- cadena FA 13C9-16:0;Y. Además, combinamos este etiquetado múltiple triple con la estrategia de multiplexación de muestras cuádruple previamente establecida12. Esto ahorra tiempo y costos al tiempo que mejora la comparabilidad de los datos, lo que da como resultado una caracterización cualitativa y cuantitativa completa de las especies de lípidos marcadas (Datos ampliados, Fig. 1).

a, Estructuras de los FA;Y utilizados para el etiquetado. b, Incorporación de FA;Y por clase de lípidos para tres FA;Y de entrada diferentes. Los números son pmol por clase de lípidos por pocillo. c, FA;Y incorporado total en las principales clases de lípidos al marcar con la combinación 16/11/18 como se describe en la Fig. 1b. Los números son pmol de FA;Y respectivo por pocillo. Todos los valores son promedio ± sd, n = 4.

Para establecer la separación de las señales de MS provenientes de los diferentes FA;Ys y estudiar la influencia mutua de los tres FA;Ys, etiquetamos adipocitos 3T3-L1 diferenciados con los tres FA;Ys individualmente y en todas las combinaciones posibles (Extended Data Fig 2), como en lo que sigue, denominado "experimento de calibración". A continuación, analizamos el patrón de distribución de cada especie identificada individual sobre las ocho combinaciones de etiquetado y asignamos la especie al alquino-FA respectivo. El procedimiento se ilustra y explica con más detalle en Datos ampliados, Fig. 3. Las asignaciones del experimento de calibración se tradujeron a archivos de búsqueda de lenguaje de consulta de fragmentos moleculares (mfql) de LipidXplorer que se optimizaron para alcanzar una cobertura máxima de asignaciones con exclusión paralela de los especies ambiguas. Esta estrategia se amplió para analizar y asignar otras clases de lípidos, incluidas especies multimarcadas que contienen más de un FA marcado. Es importante destacar que, también para TG; Y2 con doble etiqueta, se logró una separación limpia de señales (Datos extendidos Fig. 4). El análisis completo final abarcó ocho clases de lípidos, que representan los productos cuantitativamente relevantes de la asimilación de ácidos grasos, es decir, éster de esterol (CE), ceramida (Cer), diglicérido (DG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilcolina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidil inositol (PI) y TG. Este análisis incluyó tanto especies con una sola etiqueta como con etiquetas múltiples. Este último fue particularmente importante para el TG;Yn marcado. Una mezcla de 16 estándares internos etiquetados permitió la cuantificación de cantidades de pmol. Después de la optimización de los 131 archivos de búsqueda mfql requeridos, el tiempo de ejecución de un análisis de etiquetado múltiple fue solo de 5 a 10 minutos, según la cantidad de muestras y el rendimiento del hardware. Para el experimento de calibración, el análisis entregó 406 especies de lípidos marcadas. Los TG etiquetados fueron dominantes, con 127 especies con un solo etiquetado, 128 con doble etiquetado y 10 con triple etiquetado, seguidos de PC etiquetados (46 especies) y DG (40 especies). Las tres etiquetas de alquino-FA estaban bien representadas, con 121 especies para FA 11:0;Y, 181 para FA 16:0;Y y 179 para FA 18:2;Y. Dado que cada muestra se multiplexó cuatro veces, una sola muestra analizada en el instrumento MS arrojó hasta 1600 especies etiquetadas, cada una identificada y cuantificada inequívocamente.

Los tres alquinos FA (Fig. 2a) se incorporaron en cantidades similares en las células (Fig. 2b), independientemente de si se aplicaron individualmente o en combinación. Esto indicó que la maquinaria de absorción y esterificación de FA no estaba saturada en nuestro experimento. La separación limpia de los productos de los tres FA;Y, como lo demuestra el patrón cuantitativo de identificaciones en la Fig. 2b, es un requisito previo del análisis posterior de la distribución de etiquetas en las celdas triplemente marcadas (Fig. 2c). El FA 11:0;Y de cadena media tenía una clara preferencia por TG y DG, mientras que los dos FA;Y de cadena larga se encontraban tanto en fosfolípidos como en lípidos neutros. Dentro de los fosfolípidos, el FA 18:2;Y poliinsaturado fue más abundante que el FA 16:0;Y saturado. Dentro de los TG, FA 11:0;Y prefirió los TG con una sola etiqueta, mientras que los otros FA;Y se encontraron igualmente en especies de TG con una sola y doble etiqueta.

Con el nuevo método, realizamos un análisis de tiempo resuelto del recambio de lípidos en adipocitos 3T3-L1. Las células se marcaron durante 1 h con los tres FA;Y de entrada, cada uno a 50 µM, seguido de tiempos de seguimiento de 0, 6, 24 y 48 h. Después de la persecución, los lípidos celulares se extrajeron y analizaron en busca de especies marcadas. El conjunto cuantificado completo de lípidos identificados junto con algunas anotaciones se puede encontrar en Datos complementarios 1 en formato Excel. Se determinaron las cantidades totales de marcador en las principales clases de lípidos (Fig. 3). El FA;Y total incorporado fue casi constante a lo largo del tiempo para FA 16:0;Y, mostró un aumento moderado para FA 18:2;Y, pero mostró una fuerte disminución para FA 11:0;Y de cadena media (Fig. 3b ).

a, Diseño básico de un experimento de persecución de pulsos. Los círculos simbolizan los pocillos de la placa de 24 pocillos, que contienen adipocitos 3T3-L1 diferenciados. Los números 16/11/18 se refieren al recuento C de la entrada FA;Y (Fig. 2) utilizada a 50 µM durante 1 h. Después de la incubación, los medios se retiraron y se reemplazaron con medios Chase durante los tiempos indicados. Posteriormente, las células se lavaron y los lípidos se extrajeron en presencia de estándares internos. Los lípidos extraídos se hicieron reaccionar con clic con las moléculas informadoras C175-7x indicadas a la derecha, y las muestras se agruparon y posteriormente se analizaron mediante MS1/MS2 multiplexado. Las especies etiquetadas identificadas se cuantificaron, resumieron y trazaron durante el tiempo de búsqueda para el total (b) y por separado para TG (c), DG (d), PA (e), PC (f), PE (g) y PI (h ). En los paneles b–e, se muestran las sumas de especies con una sola y múltiples etiquetas. Para PE (g), no se detectaron especies doblemente marcadas; para PI (h), hubo señales muy débiles de especies doblemente marcadas que no pudieron cuantificarse debido a la falta de un patrón interno PI;Y2. Todos los valores son promedio ± sd, n = 11–12. Las barras de error más pequeñas que el tamaño del símbolo se omiten para mayor claridad.

Tenga en cuenta que estos números y los siguientes comprenden el FA;Y original, así como posibles metabolitos de reacciones de elongación, desaturación o degradación parcial. Como se esperaba para un modelo de adipocitos, la mayoría de los FA marcados se incorporaron en TG (Fig. 3c). De acuerdo con su pérdida en el total, FA 11:0;Y en TG;Y también mostró una fuerte disminución, mientras que la cantidad de FA;Y de cadena larga en TG;Y permaneció constante (FA 16:0;Y) o aumentó. (FA 18:2;Y) durante la persecución. Aproximadamente la mitad de este aumento podría explicarse por el aumento del total (Fig. 3b), y la mayor parte del resto por un flujo de FA;Y desde la etiqueta DG (Fig. 3d) y PC (Fig. 3f) a etiquetado como TG.

A continuación, analizamos la distribución de FA;Y dentro de los tres grupos de TG;Yn mediante el rastreo paralelo de más de 200 especies. Durante el período de búsqueda, encontramos un aumento masivo en las especies TG;Y1 con una sola etiqueta, en particular aquellas que contienen FA;Y de cadena larga (Fig. 4a), con una fuerte disminución concomitante de los tres FA;Ys en doble y doble. Especies TG; Yn de triple marca (Fig. 4b, c). Este comportamiento también se puede ver directamente en los espectros originales que visualizan los lípidos neutros marcados con alquino por su pérdida neutra (NL) de 73,1 m/z (Datos ampliados Fig. 5). La cinética de estas disminuciones fue diferente para las especies de TG;Yn doble y triplemente marcadas. Después de 6 h, el 46,7 ± 4,1 % del TG;Y2 inicial seguía presente (fig. 4b), en contraste con el 36,5 ± 3,5 % del TG;Y3 inicial (fig. 4c). Con respecto a la disminución de TG;Y3, hubo muy poca diferencia relativa entre los tres FA;Y de entrada; con respecto a TG;Y2, el FA;Y de cadena media disminuyó ligeramente más rápido (cantidad residual después de 6 h: FA 11:0;Y, 44,0 %; FA 16:0;Y, 47,6 %; FA 18:2;Y, 49,0 %) que los dos trazadores de cadena larga. Para los tres FA;Y juntos, los datos se trazaron como la fracción del total de FA;Y que se encuentra en TG;Y1, TG;Y2 y TG;Y3 (Fig. 4d). Demuestran la redistribución de FA;Y de especies con triple y doble marca hacia TG; Y1 con una sola marca. El ciclo TG es la única explicación consistente para esta observación. El ciclo más simple consistiría en la hidrólisis de TG que produce DG + FA y la posterior reacilación a TG (Fig. 4e). La fila superior muestra la situación después del período de etiquetado de 1 h. Durante el etiquetado de pulsos, los FA;Y de entrada (rojo) son una fracción importante del total de FA que se utiliza para la síntesis de TG, lo que da como resultado una gran fracción de especies de TG multimarcadas. En números, el conjunto de TG;Yn etiquetado contenía 94 pmol de TG;Y3, 1017 pmol de TG;Y2 y 3030 pmol de TG;Y1 al final del pulso, proporcionados como números negros sobre los símbolos superiores (Fig. 4e) . Además, existe el conjunto no marcado de TG endógeno de 138 000 ± 7 000 pmol, obtenido a partir de la lipidómica de TG no marcado en las mismas muestras. Después de un equilibrio binominal teórico, se puede calcular la dilución del marcador (números azules) para un ciclo completo de TG → DG → TG, prediciendo una disminución del 55 % de TG;Y2 y un aumento del 45 % de TG;Y1, que está cerca de la situación en el tiempo de persecución de 6 h. La figura 4f muestra una forma alternativa de representar los datos. Las líneas representan la distribución binomial teórica del FA;Y total sobre las tres clases de TG;Yn, en función de la fracción de FA;Y en el FA total del pool de TG. Para cada uno de los cuatro puntos de tiempo experimentales, ahora determinamos la posición de los datos a lo largo del eje x que mejor se ajustaría a una distribución binomial. Solo para el pulso, esto da como resultado una fracción total de FA;Y en el total de TG;Yn sintetizado del 26%. Este número indica que durante el período de etiquetado, el FA;Y marcado contribuyó con el 26 % de todos los FA que se acilaron a TG. En ausencia del ciclo de TG, las cantidades relativas de las tres especies de TG;Yn marcadas permanecerían constantes a lo largo del tiempo. Sin embargo, los datos experimentales indican que, con el aumento del tiempo de búsqueda, el FA;Y etiquetado se propaga desde el pequeño grupo original a tamaños de grupo cada vez mayores correspondientes al 12 %, 5 % y 3,5 % del contenido de la etiqueta. Este proceso de ciclo-dilución también explica por qué TG;Y3 desapareció más rápido que TG;Y2. A menos que las enzimas degradadoras de TG puedan detectar el número de enlaces triples en una especie de TG, para lo cual no hay indicios hasta el momento, tanto TG;Y2 como TG;Y3 se degradarían a la misma velocidad. Las aparentes diferencias en la cinética de degradación se deben a las diferentes estadísticas de reacilación de DG;Y1 y DG;Y2 a TG;Y2 y TG;Y3, respectivamente. Cuantitativamente, estos datos indicaron que el tiempo de persecución de 6 h correspondía a aproximadamente 1,5 t1/2, lo que sugiere un t1/2 de aproximadamente 4 h. Luego preguntamos si el ciclo observado depende de una combinación específica de etiquetas de FA y si la etiqueta de alquino como tal podría ser la causa del fenómeno del ciclo (Fig. 4g-j). Por lo tanto, realizamos un experimento de persecución de pulsos como se describe anteriormente, pero con diferentes combinaciones de FA, es decir, FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (Fig. 4g) o FA 16:0 ;Y/18:2;Y/19:1;Y (Fig. 4i). El FA 19:1;Y ha sido utilizado previamente en hepatocitos12,13 y es un buen análogo del ácido oleico. La última combinación de FA es una imitación cercana de la composición natural de FA de las células bajo estudio con respecto a la longitud de la cadena y el recuento de dobles enlaces (consulte la Tabla complementaria 1 para obtener un análisis detallado del número promedio de átomos de carbono y dobles enlaces para los experimentos de etiquetado que se muestran en la Fig. .4g–j). La comparación de los datos de ambas combinaciones de AG (Fig. 4g, i) muestra que el ciclo es independiente de la presencia de un AG de cadena media y tiene lugar con una cinética muy similar. Tenga en cuenta que estos experimentos tienen una resolución de tiempo cinético más alta y confirman la cinética del experimento anterior. También realizamos experimentos análogos de persecución de pulsos utilizando FA marcados con isótopos en lugar de FA marcados con alquinos. Las combinaciones fueron FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] (Fig. 4h) y FA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8] (Figura 4j). El análisis de muestras marcadas con isótopos es exigente porque el marcado de isótopos carece de la sensibilidad y especificidad analíticas superiores que caracterizan a los trazadores de alquinos. Como ilustración, las Figs. de datos ampliados. 6 y 7 muestran una comparación de espectros primarios de los experimentos en la Fig. 4g,h. Las especies de TG marcadas con alquino se separan bien de la mayor parte del material no marcado (Datos ampliados, Fig. 6a, b), y una inspección más detallada indica que las principales especies marcadas son las mismas que las especies endógenas dominantes (consulte el espectro anotado en el Espectro complementario 1). Por el contrario, es inevitable que los TG marcados con isótopos se conviertan en parte de la región poblada de m/z 700–900 (Datos extendidos Fig. 7a). Al menos el pico del TG 43:1 marcado dominante pudo identificarse directamente en la mezcla, pero las otras especies no fueron identificables visualmente. No existe un equivalente de la búsqueda NL73 de especies marcadas con alquinos para las especies marcadas con isótopos, pero los TG que contenían el FA 11:0[D3] etiquetado podrían identificarse mediante una búsqueda NL de la pérdida de ese FA junto con amoníaco, es decir, a NL m/z 206,2. Dicho análisis se realizó (Datos extendidos Fig. 7b) y produjo un espectro razonable. A continuación, se utilizó un algoritmo de búsqueda LipidXplorer equivalente para identificar y cuantificar los TG marcados. También se realizaron búsquedas correspondientes para los otros FA marcados con isótopos. Si bien esto es necesario para lograr la especificidad requerida, significa que cada grupo de TG marcados con isótopos se cuantifica mediante una pérdida neutra diferente, en contraste con la cuantificación uniforme de las especies marcadas con alquino, lo que introduce un posible sesgo cuantitativo en los datos. Finalmente, pudimos identificar 105 especies de TG marcadas con isótopos (frente a 270 especies de TG marcadas con alquino), lo suficiente para los cálculos de TG con una, dos y tres etiquetas (Fig. 4h, j). Estos datos mostraron que el ciclo de TG tiene lugar de la misma manera y con cinéticas comparables para especies marcadas con isótopos y alquinos.

a–c, Evolución temporal de las cantidades de los tres FA;Y de entrada en TG;Yn de etiqueta simple (a), doble (b) y triple (c) en el experimento de persecución de pulso. d, Distribución porcentual relativa del FA;Y total sobre las clases etiquetadas de TG;Yn. e, Ilustración del ciclo de TG y su efecto en la distribución de la etiqueta entre grupos de una sola etiqueta y de etiquetas múltiples. Los números negros son pmol de las formas moleculares respectivas en el punto de tiempo 0 derivadas de los datos en los paneles a–d y representan la suma de los tres FA;Y. La cantidad de TG;Y0 sin marcar también se midió en las mismas muestras. Los números azules son valores predichos para un ciclo de desacilación de TG seguido de reacilación estocástica. Tenga en cuenta que este cálculo asume pasos discretos durante el ciclo, que en realidad no es el caso ya que la degradación y la resíntesis son simultáneas. f, Las curvas muestran la distribución de etiquetas binomial calculada teóricamente dentro de los grupos de TG;Y1, TG;Y2 y TG;Y3 en función de la fracción de FA;Y de todos los FA (no marcados y marcados; tres por molécula de TG) en la reserva total de TG;Yn. Los símbolos son los valores medidos derivados del experimento. La posición de los símbolos y los números correspondientes 3,5%, 5%, 12% y 26% indican el punto de mejor ajuste de los datos medidos a las curvas calculadas. Todos los valores de datos medidos se normalizaron a FA;Y total en TG;Y para compensar sus variaciones. g – k, utilizando la representación de datos como en el panel d, se compara el ciclo TG en experimentos de persecución de pulso separados. Todos los experimentos se realizaron con un tiempo de seguimiento máximo más corto de 24 h y un tiempo de seguimiento mínimo más corto de 2 h y 4 h. Las combinaciones de etiquetas FA son FA 11:0/16:0/18:2 con marcaje de alquino (g) o isótopo (h) y 16:0/18:2/19:1 con marcaje de alquino (i) o isótopo (j) , como se indica en los paneles. Todos los datos son promedio ± sd, n = 11–12 (g–j, n = 4). Las barras de error más pequeñas que el tamaño del símbolo se omiten para mayor claridad.

Luego profundizamos el análisis avanzando al nivel de especies de lípidos. El análisis de las especies TG;Y1 después del etiquetado con FA 18:2;Y (Fig. 5a) mostró que, dentro de esta clase de lípidos, algunas especies eran relativamente constantes (Fig. 5a, flecha abierta) y otras (Fig. 5a, flecha cerrada ) aumentó más fuertemente que la tendencia general (Fig. 5a, total).

a, Evolución temporal de la abundancia relativa de las especies TG;Y1 tras el etiquetado con FA 18:2;Y. Las cantidades relativas de todas las especies de TG;Y1 del experimento pulso-persecución se muestran codificadas por colores. Cada fila representa una especie. b, análisis MS2 de una especie (flecha abierta) en el tiempo de persecución 48 h. Se omite el pico precursor en m/z 1.025,8. Las cuatro series de picos de fragmentos indican la composición de FA 16:1_18:1_18:2;Y. c, análisis MS2 de una especie (flecha cerrada) en el tiempo de persecución 48 h. Se omite el pico precursor en m/z 1.021,8. Las tres series de picos de fragmentos indican la composición de FA 16:1_16:1_20:4;Y. Tenga en cuenta que en b y c, los FA;Y incorporados reales se identifican directamente a partir de las masas máximas y se imprimen en rojo. En a, los números están codificados por la intensidad del color (mínimo-máximo de todo el bloque de datos), derivados de promedios, n = 12. Los datos estadísticos detallados de este experimento se muestran en la Tabla complementaria 2.

Por análisis MS2, la especie constante (Fig. 5b) se identificó como TG 52: 4; Y, que contiene FA sin marcar 16: 1 y 18: 1 junto con FA 18: 2; Y. Por el contrario, la especie en aumento (Fig. 5c) se identificó como TG 52: 6; Y, que contiene dos FA no marcados 16: 1 y un FA marcado 20: 4; Y, lo que indica el metabolismo del propio FA; Y marcado por elongación y desaturación Esto fue confirmado por búsquedas directas en los datos espectrales originales (Datos extendidos Fig. 8 para FA 20: 4; Y y Datos extendidos Fig. 9 para FA 18: 2; Y) y un análisis estadístico detallado (Tabla complementaria 2). Por lo tanto, utilizando archivos LipidXplorer mfql dedicados, buscamos sistemáticamente los espectros de MS2 de todas las especies de TG; Y1 con una sola etiqueta para FA; Y procesados ​​metabólicamente, todos los cuales fueron claramente identificados y cuantificados. Se eligió TG;Y1 porque (1) sus espectros contenían la información más clara sobre la identidad de FA;Y1 y (2) contenía la mayoría del material etiquetado, particularmente en tiempos de persecución posteriores. Se analizaron los datos de ambas combinaciones de FA, 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y y 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y. Los resultados, normalizados al porcentaje del total en TG;Y1, mostraron que en ambas combinaciones de FA la modificación más fuerte se produjo en el FA poliinsaturado 18:2;Y (Fig. 6a,b), que se alargaba y desaturaba para dar FA 18 :3;Y, FA 20:3;Y y FA 20:4;Y como los productos más destacados. El FA 16:0;Y saturado se modificó un poco menos (Fig. 6c, d), principalmente por desaturación y elongación, dando lugar a FA 16:1;Y y FA 18:1;Y. FA 11:0;Y se degradó parcialmente, produciendo FA 7:0;Y y 9:0;Y, y parcialmente alargada a FA 13:0;Y y 15:0;Y (Fig. 6e). FA 19:1;Y se degradó parcialmente a FA 17:1;Y y, en muy pequeña medida, también se alargó a FA 21:1;Y. En general, la modificación fue más fuerte en la combinación FA 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y, lo que se correlacionó con un ciclo TG general más rápido en este experimento (Datos extendidos Fig. 10b, c).

Las células 3T3-L1 se marcaron con la combinación FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (a,c,e) o 16:0;Y/18:2;Y/19:1 ;Y (b,d,f) durante 1 h, seguido de períodos de persecución entre 6 h y 48 h, como se indica. Los picos de fragmentos de FA, como se ilustra en la Fig. 5b, c, se detectaron, identificaron y cuantificaron en todas las especies de TG; Y1 con una sola etiqueta. Los diagramas muestran la fracción de cada metabolito en los cuatro puntos de tiempo. Los metabolitos de FA 18:2;Y se muestran en los paneles a y b, de FA 16:0;Y en los paneles c y d, de FA 11:0;Y en el panel e y de 19:1;Y en el panel f. Todos los números se normalizan al total de FA;Y respectivo en TG;Y1 en el tiempo de persecución respectivo para compensar los cambios en el total de TG;Y1. Las ordenadas se dividen para mostrar la disminución de los FA;Y de entrada y el aumento de sus metabolitos en un panel. Todos los números son promedio ± sd, n = 11–12. Las barras de error más pequeñas que el tamaño del símbolo se omiten para mayor claridad.

El aumento observado en los dobles enlaces y la longitud de la cadena no se limitó a TG;Y1. En los fosfolípidos, la conversión de FA 18:2;Y a FA 20:4;Y no se puede rastrear tan directamente como en los TG porque los fosfolípidos no liberan un fragmento FA;Y marcado en MS2. Sin embargo, el número de átomos C de la cadena lateral y de dobles enlaces aumentó de manera constante para las tres clases principales de fosfolípidos, con tiempos de persecución crecientes en ambas combinaciones de FA (Datos extendidos Fig. 10a). Este hallazgo descarta que el aumento de FA 20:4;Y en el TG;Y1 sea alimentado por FA 20:4;Y liberado del grupo PC;Y1.

Finalmente, realizamos experimentos de persecución de pulsos en adipocitos primarios blancos y marrones murinos. En ambos sistemas, claramente hubo un ciclo de TG con tasas comparables a las encontradas en los adipocitos 3T3-L1 (Fig. 7, triángulos negros). La inhibición parcial de la beta-oxidación usando 30 µM del inhibidor de CPT1 teglicar14, cuyo valor de concentración inhibidora media máxima (IC50) se determinó como 40 µM (ref. 15), resultó en un aumento aparente de las tasas de ciclado (Fig. 7, azul cuadrados) en ambos tipos de adipocitos. Esta observación es consistente con la idea de que el ciclo requiere tanto la escisión inicial de TG como la resíntesis de una molécula de TG. Sin embargo, si el FA inicialmente liberado es degradado por beta-oxidación, se producirá menos TG;Y1 marcado a partir de DG no marcado y, en consecuencia, disminuirá la eficiencia aparente y la tasa de ciclado.

a,b, los adipocitos blancos (a) y marrones (b) se marcaron con la combinación FA 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y durante 1 h, seguido de períodos de persecución entre 6 h y 48 ha indicado. Los diagramas muestran la distribución de la suma de los tres FA;Y en los grupos TG;Y1, TG;Y2 y TG;Y3, normalizados a la cantidad total de FA;Y en todo el grupo TG;Yn. Todos los valores son promedio ± sd, n = 4 (n = 12 para el tiempo de persecución 0 h). Los símbolos azules indican la presencia del inhibidor de CPT1, teglicar, durante los periodos de persecución, y los símbolos negros su ausencia.

Un análisis detallado y cuantitativo del ciclo de TG fue imposible hasta el momento debido a la falta de un método adecuado. El método de rastreo multiplex de etiquetas múltiples que se desarrolló para este proyecto permitió dicho estudio, como se presenta aquí. La estrategia empleada para la discriminación de etiquetas utilizando tres trazadores de alquino-FA (FA;Y impar/par más un FA;Y marcado con isótopo) funcionó bien, incluso en el desafiante sistema de adipocitos con un fondo considerable de FA impares endógenos16. La considerable diferencia de longitud de siete carbonos entre los FA;Y pares e impares resultó útil para la discriminación de las especies etiquetadas. El etiquetado 13C9 del tercer FA;Y excluyó cualquier interferencia relevante con los otros dos FA;Y. Para sistemas biológicos aún más difíciles o para la futura adición de un cuarto trazador, la preparación de otros FA;Y marcados con isótopos, por ejemplo, mediante la incorporación de algunos átomos de D en un FA;Y monoinsaturado, sería una opción interesante. Es importante destacar que nuestra metodología no se limita a combinaciones particulares de FA o tipos de células. Aparte de los trazadores 11:0/16:0/18:2 y 16:0/18:2/19:1 de este estudio, también hemos probado con éxito la combinación 12:0/16:0/19:1 en adipocitos así como todas estas combinaciones en hepatocitos recién aislados.

La demostración directa del ciclo de TG en adipocitos 3T3-L1 abre varios puntos de discusión. La primera es si los datos permitirían otras explicaciones. Esto esencialmente puede ser negado. El argumento crucial proviene de la observación de que dentro de las primeras 6 h de persecución, tanto para FA 16: 0; Y como para FA 18: 2; Y, se encuentra un fuerte aumento en TG; Y1 con una sola etiqueta. La liberación de la etiqueta de especies con doble y triple etiqueta es la única fuente que puede explicar este aumento. Usando FA 16:0;Y como ejemplo, hay un aumento de la etiqueta en TG;Y1 de 461 pmol y una disminución paralela correspondiente en TG;Y2 y TG;Y3 de 449 pmol. Por el contrario, la disminución total de todas las demás clases de lípidos suma 99 pmol, lo que no es suficiente para explicar el aumento de TG;Y1. Los números correspondientes para 18:2;Y indican un aumento de TG;Y1 de 468 pmol, una disminución combinada de TG;Y2 y TG;Y3 de 360 ​​pmol, y de todas las demás clases de lípidos de 56 pmol. Una vez más, los números indican que el 76 % del aumento en TG;Y1 se origina en TG;Y2 y TG;Y3, que es, por definición, el ciclo de TG.

El segundo punto se refiere a la vía del ciclo de TG. El mínimo absoluto es un ciclo TG/DG como se muestra (Figs. 1 y 4e), pero también podría haber un ciclo más largo que implicaría una mayor degradación a monoacilglicerol (MG) oa glicerol libre. De hecho, la liberación de glicerol por el tejido adiposo es un indicador clásico de la hidrólisis de TG17 y se utilizó para estimar el ciclo de TG3. Investigaciones más recientes tanto en células 3T3-L1 como en adipocitos primarios mostraron que el glicerol liberado también puede originarse a partir de la glucólisis18,19, cuestionando la idea de que la liberación de glicerol es un indicador cuantitativo de la hidrólisis de TG. En la actualidad, nuestros datos no pueden diferenciar entre las posibles formas del ciclo TG y tampoco pueden indicar la identidad de las actividades enzimáticas involucradas. El hecho de que los datos coincidan muy bien con una distribución de etiquetas binomiales indica la naturaleza estocástica del proceso. Para obtener información mecanicista más profunda, se necesitan más datos en períodos de búsqueda más cortos junto con estudios de ablación de genes e inhibidores dirigidos contra enzimas candidatas. Dichos datos deben incluirse en modelos matemáticos que deben incluir no solo TG;Yn, sino también etiquetados como DG;Yn, MG;Y, PA;Y y PC;Y.

Un tercer punto que vale la pena discutir es la velocidad y los costos energéticos del ciclo. A partir de la degradación de TG;Y3, podemos estimar una vida media de 4 h para TG en un ciclo TG/DG. Con esa tasa, e ignorando el tema de la especificidad posicional de las reacciones del ciclo, cada FA en TG se rotaría una vez al día, con un costo energético de 1 ATP por día. Con un contenido energético neto de 106 ATP por molécula de palmitato, el almacenamiento de TG costaría alrededor del 1% de su contenido energético por día en adipocitos 3T3-L1. Esto parece ser un gran número cuando se transfiere al tejido adiposo, porque significaría que un depósito de grasa de 50 kg se reduciría a un ritmo de 0,5 kg por día solo por ciclos de TG. Es probable que en el tejido adiposo blanco con sus gotas de lípidos más grandes, el ciclo de TG ocurra a tasas más bajas que en las células 3T3-L1 que tienen gotas de típicamente 5 a 10 µm de diámetro, ya que algunas de las reacciones metabólicas relevantes ocurren en la superficie de la gota. .

Finalmente, la cuestión de las ventajas biológicas del ciclo sobre un almacenamiento estático necesita ser discutida. El argumento clásico de los libros de texto para los ciclos de sustratos es la flexibilidad regulatoria mejorada al aumentar la amplitud de regulación de un par de enzimas contrarrestantes sobre una sola que actúa unidireccionalmente. Esto parece ser cierto también para el ciclo de TG, ya que una parte importante de la reducción del consumo de TG después de terminar la actividad física se puede atribuir a una mayor reesterificación en lugar de una hidrólisis de éster reducida3. Otra función puede residir en la termogénesis independiente de UCP1 en el tejido adiposo blanco20,21.

Nuestros datos apuntan a un tercer aspecto importante: la composición del grupo de FA almacenado en los TG. Los datos muestran que cada uno de los tres FA marcados tiene un destino específico: la mayoría del 82 % de los FA 11:0; Y de cadena media incorporados se perdieron de las células en 48 h, presumiblemente por oxidación preferencial. Alrededor del 10 % del resto se modificó, principalmente por elongación y desaturación, dando FA 15:1;Y y 17:1;Y. Sólo el 16% del FA 11:0;Y original seguía presente después de 48 h. Después del mismo tiempo, todavía estaba presente 100 ± 13% de ácido alquino palmítico 16:0;Y, y el 88% del mismo permanecía en su forma original. Las modificaciones produjeron en su mayoría FA 16:1;Y y 18:1;Y desaturados. El PUFA 18:2;Y no mostró pérdida significativa de material. Alrededor del 20-30 % de los FA originales se modificaron, principalmente a FA 20:3;Y y 20:4;Y, el equivalente del ácido araquidónico y su precursor. En resumen, estos datos muestran (1) una eliminación rápida de los ácidos grasos de cadena media, (2) una desaturación lenta de los ácidos grasos saturados para producir equivalentes de ácido palmitoleico y oleico, y (3) un metabolismo de los equivalentes de ácido linoleico hacia ácido araquidónico. Los tres procesos son potencialmente beneficiosos para la célula o el organismo. Los AG de cadena media son inútiles o incluso potencialmente peligrosos como componentes de la membrana. Su eliminación elimina un problema potencial y su conversión a ácidos grasos monoinsaturados de cadena larga proporciona elementos útiles para la construcción de membranas. El ácido palmítico es un componente alimentario abundante, pero las altas concentraciones de palmitato en los lípidos se correlacionan con varias condiciones adversas22. La desaturación lenta a AG monoinsaturados beneficiosos reduciría el peligro de acumulación de palmitato en los TG almacenados y evitaría los efectos negativos del palmitato liberado sobre la movilización de la grasa almacenada. El araquidonato es un FA importante con enzimas únicas en el recambio de lípidos de la membrana23,24 y desempeña un papel clave como precursor de los eicosanoides en la señalización inflamatoria. Los niveles sostenidos de ácido araquidónico son críticos para la vida de los mamíferos, como lo demuestran muchos estudios experimentales en ratones y por el requerimiento absoluto de ácido araquidónico en la nutrición infantil25. La conversión del abundante ácido linoleico en ácido araquidónico en los mamíferos es un proceso complejo de varios pasos activo en los hepatocitos26. Nuestros datos sugieren que el tejido adiposo puede ayudar a otros órganos en ese proceso.

En ausencia del ciclo de TG, los tres FA;Y permanecerían completamente sin modificar después de la incorporación en TG, porque todas las modificaciones de FA observadas o vías de degradación necesitan ésteres de coenzima A de FA libre (FA-CoA) como sustrato. Por lo tanto, la modificación de FA en curso requiere la liberación repetida de FA de TG junto con su reactivación por acil-CoA sintetasas en la vía del ciclo de TG. La misma lógica también se aplica a la eliminación de FA dañados, por ejemplo, por peroxidación, del grupo de TG. En una piscina estática, se acumularía material dañado; El ciclo de TG da acceso a los ácidos grasos dañados para su posterior degradación. En resumen, nuestros experimentos enfatizan la función esencial del ciclo de TG para monitorear y mantener la composición del grupo de FA almacenado en los adipocitos.

Para evitar confusiones entre los dobles enlaces de lípidos normales y el triple enlace terminal de la etiqueta de alquino, tratamos el triple enlace como una funcionalización del FA y lo indicamos con un sufijo ';Y'. Esto sigue la estrategia de la nomenclatura LipidMaps27, que aún no cuenta con un sistema para indicar triples enlaces en la actualización más reciente28. La nomenclatura utilizada aquí se discutió y acordó con un grupo de científicos interesados ​​que participaron en la última actualización de la nomenclatura de LipidMaps y ya se utilizó en nuestras publicaciones recientes. La Y hace visible el triple enlace en la abreviatura y mantiene el número correcto de dobles enlaces en la abreviatura. Esto da como resultado FA 18:2;Y para el alquino-FA terminal con 18 átomos de carbono y dos enlaces dobles, que se utiliza como equivalente de ácido linoleico en este estudio. Por eso, tanto la funcionalización con un triple enlace como la equivalencia bioquímica al ácido linoleico son fácilmente accesibles. Para las clases de lípidos, también usamos el sufijo Y, es decir, PC;Y y TG;Y indican fosfatidilcolina y triacilglicerol que contienen un alquino-FA (FA;Y), respectivamente. La presencia de dos FA;Y en una molécula de TG doblemente marcada da TG;Y2, y la de tres FA;Ys en una molécula triplemente marcada da TG;Y3, en consecuencia. En los nombres de especies de glicerolípidos, la 'Y' se colocará junto al número del doble enlace, por ejemplo, TG 52:3;Y es un producto muy frecuente de etiquetado con FA 18:2;Y. En consecuencia, si se conoce la identidad del otro FA en el TG;Y, la molécula podría convertirse en TG 18:2;Y_16:0_18:1, y, si se conocieran las posiciones, TG 16:0/18:2;Y/ 18:1.

FA 11:0;Y se obtuvo de TCI Alemania, y FA 18:2;Y se sintetizó como se describe29. FA 19:1[D8] se sintetizó mediante la reacción de Wittig entre bromuro de carboxioctil-trifenilfosfonio y decanal[D8]. Este último se preparó a partir de decatetraenal30 por deuteración con gas deuterio y catalizador de Wilkinson en CH3OD. 13C9-FA 16:0;Y se obtuvo en una síntesis química de varios pasos. Brevemente, el éster metílico de FA mixto marcado con U-13C comercial se hizo reaccionar con cis-1,4-diacetoxi-2-buteno en presencia de nitro-Grela como catalizador de metátesis. A partir de la mezcla obtenida, se purificó el éster metílico del ácido 13C9-11-acetoxiundec-9-enoico. El doble enlace se redujo con H2/Pd y el acetiléster se escindió con HCl en metanol. El éster metílico del ácido 11-hidroxiundecanoico 13C9 resultante se purificó y oxidó con clorocromato de piridinio en diclorometano al correspondiente aldehído, éster metílico del ácido 11-oxoundecanoico. Este se combinó con el reactivo de Wittig obtenido a partir de bromuro de dioxolanilpropil-trifenilfosfonio. El doble enlace resultante se redujo con H2/Pd. El grupo protector del aldehído terminal se eliminó con ácido toluenosulfónico en acetona húmeda para obtener el éster metílico del ácido 13C9-15-oxo-pentadecanoico. El triple enlace terminal final se introdujo por reacción con el reactivo Bestmann-Ohira y el éster metílico se escindió con KOH en tetrahidrofurano/agua para obtener el producto final a aproximadamente 100 mg. El análisis MS indicó una pureza de alrededor del 87%. Las principales impurezas son 4–5% de cada una de 13C10-17:0;Y y 13C12-19:0;Y. Estas impurezas, que probablemente se originan en las migraciones de dobles enlaces en la reacción de metátesis inicial, no perturban el análisis ya que los picos de MS resultantes de ellas se discriminan fácilmente de los que contienen 13C9-16:0;Y.

Los estándares internos fueron los utilizados en los estudios previos12,31 con estándares adicionales para monitorear TG;Y3, PA;Y2, PC;Y2 y PE;Y2. A cada muestra, se agregó una mezcla que contenía los estándares internos (para conocer la composición y las cantidades, consulte la Tabla complementaria 3). Los estándares internos para cada clase de lípidos se suministran en diferentes cantidades para tener en cuenta las diferentes abundancias de las respectivas clases. El objetivo es tener intensidades estándar que estén en el rango típico de intensidades de muestra para la misma clase de lípidos.

Se cultivaron preadipocitos 3T3-L1 (ATCC CL-173) en medio de cultivo (DMEM 4,5 g l-1 glucosa, 10 % FCS más penicilina/estreptomicina), se sembraron en placas de 48 pocillos y se indujeron a diferenciarse después de 24 h mediante la adición de 1 µM rosiglitazona, insulina 10 µg ml−1, dexametasona 10 µM y 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM durante 3 días, seguido de cultivo en medio de crecimiento con insulina únicamente durante 2-4 días, con cambios de medio cada dos días. La diferenciación fue monitoreada regularmente por la aparición de gotitas de lípidos visibles en microscopía de contraste de fase.

Los ratones se mantuvieron y criaron en las instalaciones para animales del Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida de Bonn. Los ratones tenían libre acceso a agua y dietas estándar para roedores. Los animales se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12, a 23 ± 1 °C. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las leyes alemanas de bienestar animal. Los experimentos con animales fueron autorizados por Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, Alemania, 81-02.04.2021.A166. Se aislaron adipocitos primarios de ratones C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad. El tejido adiposo blanco inguinal disecado y el tejido adiposo marrón interescapular de 2 o 3 ratones diferentes se digirieron en DMEM (Invitrogen) que contenía BSA al 0,5 % y colagenasa NB46 a 37 °C, y luego se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min. El sedimento resultante se resuspendió y se filtró utilizando un filtro celular de 100 μm. La solución filtrada se sembró en un matraz de cultivo T175 en DMEM suplementado con FBS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y anfotericina B al 1 % (medio de crecimiento de adipocitos blancos (WA)), y se mantuvo a 37 °C y CO2 al 5 %. A las 24 h después de la siembra, las células se lavaron con PBS y se mantuvieron con medio de crecimiento WA a 37 °C, 5 % de CO2. El medio se cambió cada dos días hasta que las células alcanzaron la confluencia y posteriormente se crioconservaron las células.

Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo en una placa de 48 pocillos en medio de crecimiento. Las células se cultivaron hasta la confluencia en medio de crecimiento. Una vez confluentes, los preadipocitos se indujeron durante 48 h (día 0 a día +2) cambiando el medio a medio de inducción WA (DMEM que contenía FBS al 5%, P/S al 1%, T3 1 nM, insulina 0,172 µM, 50 mg ml− l-ascorbato, d-biotina 1 mM, pantotenato 17 mM, rosiglitazona 1 µM, dexametasona 0,25 µM y 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM). Desde el día +2 hasta el día +12, las células se mantuvieron en medio de mantenimiento WA (DMEM que contenía 5 % de FBS, 1 % de P/S, 1 nM de T3, 0,172 µM de insulina, 50 mg ml−1 de l-ascorbato, 1 mM de d- biotina, pantotenato 17 mM), refrescándolo cada dos días. Las células se usaron para experimentos el día +12.

Para el experimento de calibración, el medio de cultivo se reemplazó por un medio de crecimiento que contenía FA;Y como se indica en las leyendas de las figuras, cada uno a una concentración de 50 µM, durante 1 hora. Se retiraron los medios y luego se lavaron las células y se extrajeron los lípidos para su posterior análisis. Para el experimento pulso-persecución, las células se marcaron con medio de crecimiento que contenía 50 µM de cada uno de los tres FA;Y o FA marcados con isótopos pesados, ambos como se indica en las leyendas de las figuras, durante 1 h. Se retiraron los medios, las células se lavaron una vez y luego se procesaron para extracción y análisis de lípidos (sin seguimiento), o se añadió medio de crecimiento fresco para los tiempos de seguimiento, como se indica. Después de la persecución, se retiraron los medios y las células se lavaron y procesaron para su extracción y análisis.

Las células en placas multipocillo se lavaron una vez con medio tibio y una vez con PBS enfriado con hielo y rápidamente una vez con acetato de amonio 155 mM, teniendo cuidado de eliminar el líquido después del último lavado lo más completamente posible. A cada pocillo, 500 µl de mezcla de extracción (490 µl de MeOH/CHCl3 5:1, 10 µl de mezcla estándar interna que contiene lípidos estándar marcados con alquino y un estándar interno no alquino para TG (TG 50:1[D4])) como indicado anteriormente y toda la placa se sonicó durante 1 min en un sonicador de baño. Los extractos, incluidos los restos celulares, se recogieron en tubos Eppendorf originales de 1,5 ml y se centrifugaron a 20.000 g durante 5 min para sedimentar la proteína. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Después de la adición de 400 µl de CHCl3 y 600 µl de AcOH al 1 % en agua, las muestras se agitaron durante 30 s y se centrifugaron durante 5 min a 20 000 g. Se eliminó la fase superior y se transfirió la fase inferior a un tubo nuevo y se secó durante 20 min a 45 °C en un speed-vak. Se añadió CHCl3 (8 µl) y los tubos se agitaron brevemente. A cada tubo, se agregaron 40 µl de Click mix (preparado mezclando 10 µl de C175-7x 100 mM en MeOH al 50 % (almacenado como alícuotas a -80 °C) con 200 µl de Cu(I)AcCN4BF4 5 mM en AcCN y 800 µl de etanol), seguido de sonicación durante 5 min e incubación a 40 °C durante 16 h.

A las muestras seleccionadas con C175-7x, se añadieron 100 µl de CHCl3 por muestra y se agruparon las muestras multiplexadas. A la piscina, se añadieron 600 µl de agua y las piscinas se agitaron brevemente y se centrifugaron durante 2 min a 20.000 g. La fase superior se eliminó y la fase inferior se secó en un speed-vac como anteriormente. Se añadió tampón de pulverización (2-propanol/metanol/agua 8:5:1 + acetato de amonio 10 mM) (200–1000 µl), los tubos se sonicaron durante 5 min y los lípidos disueltos se analizaron por MS.

Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro Thermo Q-Exactive Plus equipado con una fuente de iones de ionización por electropulverización calentada estándar (HESI) mediante inyección directa desde una jeringa Hamilton impulsada por una bomba de jeringa bajo el control del software de control del instrumento Tune. Para minimizar los volúmenes muertos, el puerto de la jeringa se conectó directamente a la fuente HESI sin conectar los tubos. Las muestras se rociaron a una velocidad de flujo de 10 µl min-1 en tampón de rociado con los siguientes parámetros: gas envolvente 6, gas auxiliar 2, gas de barrido 0, calentamiento del gas, modo positivo de voltaje de rociado 4,1 kV, temperatura del capilar de transferencia de iones 280 ° C.

Los espectros de MS1 se registraron como escaneos segmentados con ventanas de m/z 100 entre m/z 300 y 1400 durante 1,2 min, seguidos de los espectros de MS2 mediante adquisición independiente de datos durante 19 min utilizando listas de inclusión de m/z 305,373 a 1400,119 en m/ intervalos de z 1,0006, para adaptarse a los defectos de masa típicos de los lípidos en las respectivas masas. Los parámetros típicos de escaneo fueron, para escaneos MS1: objetivo de control automático de ganancia 3 × 106, tiempo máximo de iones 800 ms, resolución 280,000, centroide de modo pico; para exploraciones MS2: objetivo de control automático de ganancia 2 × 105, tiempo máximo de iones 700 ms, resolución 280 000, sin multiplexación espectral, primera masa dinámica, ventana de aislamiento m/z 0,4, energía de colisión normalizada escalonada 10, 35, 40, tipo de datos de espectro centroide . Además, se realizó un segundo escaneo para especies con doble carga en el rango de escaneo de m/z 300–700, con escaneos MS2 de m/z 300,8052 a 700,0648 a intervalos de m/z 0,5002 y una ventana de aislamiento de m/z 0.4. Las especies con triple carga (TG;Y3 y PC;Y2) se escanearon utilizando una lista de inclusión dirigida que comprende todas las combinaciones teóricas de FA;Y con una ventana de aislamiento de m/z 0,3.

Los archivos sin procesar se convirtieron en archivos .mzml con MSConvert y se analizaron con LipidXplorer32. Para la identificación y cuantificación de los lípidos marcados, se escribieron archivos mfql que identifican las especies por la presencia de un pico correspondiente a las masas esperadas de la clase de lípidos marcados combinados con las pérdidas neutras características. Para obtener detalles y ejemplos, consulte la información complementaria y la ref. 12. Una búsqueda completa comprendió 44 archivos mfql para especies de carga única, 69 para especies de carga doble y 18 para especies de carga triple. Para la búsqueda de modificación de FA en especies TG;Y, se utilizó otro conjunto de archivos de 20 mfql. El procesamiento posterior de los datos se realizó utilizando el cálculo estándar de MS Excel.

Los experimentos reales de persecución de pulsos se realizaron exactamente de la misma manera que se describió anteriormente para los FA marcados con alquino, con la excepción de que se usaron FA marcados con isótopos pesados ​​en lugar de los FA; Los extractos de lípidos se analizaron directamente por MS1/MS2 sin reacción de clic y sin multiplexación. Para todos los TG marcados con isótopos, se escribieron algoritmos de búsqueda mfql que identifican los TG mediante una combinación de la masa no fragmentada de los aductos de amonio en MS1 ​​y las pérdidas neutras combinadas de los FA marcados con isótopos más amoníaco en MS2. Estos picos de MS2 también se usaron para la cuantificación, en relación con el fragmento de MS2 correspondiente del estándar interno TG 50:1[D4]. Para la combinación de FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18], la búsqueda incluyó especies de 40 a 56 átomos de C con etiquetas simples y dobles, y para FA 16:0[13C16 ]/18:2[13C18]/19:1[D8], especies de 48–57 átomos de carbono. Las especies triplemente etiquetadas se identificaron utilizando archivos de búsqueda específicos individuales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los archivos .raw de datos primarios de MS y los archivos .sc de importación de LipidXplorer y las hojas de cálculo de Excel están disponibles a partir de la fecha de publicación del artículo en un archivo de acceso público: https://doi.org/10.22000/925. El archivo de salida anotado de LipidXplorer que contiene todas las identificaciones primarias, las intensidades sin procesar y los cálculos de pmol del experimento resuelto en el tiempo que da lugar a las Figs. 3, 4a–f y 6a,c,e se presenta como Datos complementarios 1.

Los archivos de búsqueda LipidXplorer .mfql que contienen los algoritmos de búsqueda utilizados en esta publicación están disponibles a partir de la fecha de publicación del artículo en un archivo de acceso público: https://doi.org/10.22000/925.

Reshef, L. et al. Gliceroneogénesis y el ciclo de triglicéridos/ácidos grasos. J. Biol. química 278, 30413–30416 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Newsholme, EA & Crabtree, B. Ciclos de sustratos en la regulación metabólica y en la generación de calor. Bioquímica Soc. Síntoma 41, 61–109 (1976).

CAS Google Académico

Wolfe, RR, Klein, S., Carraro, F. & Weber, JM Papel del ciclo de triglicéridos-ácidos grasos en el control del metabolismo de las grasas en humanos durante y después del ejercicio. Soy. J. Physiol. 258, E382–E389 (1990).

CAS PubMed Google Académico

Miyoshi, H. et al. Control hormonal del ciclo de sustratos en humanos. J. Clin. Invertir. 81, 1545–1555 (1988).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elia, M., Zed, C., Neale, G. & Livesey, G. El costo energético del reciclaje de triglicéridos y ácidos grasos en sujetos no obesos después de una noche de ayuno y cuatro días de inanición. metab. clin. Exp. 36, 251–255 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Veliova, M. et al. El bloqueo de la importación de piruvato mitocondrial en los adipocitos marrones induce la pérdida de energía a través del ciclo de los lípidos. EMBO Rep. 21, e49634 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oeckl, J. et al. La pérdida de la función UCP1 aumenta el reclutamiento de ciclos de lípidos inútiles para la termogénesis en la grasa parda murina. mol. metab. 61, 101499 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chouchani, ET, Kazak, L. & Spiegelman, BM Nuevos avances en termogénesis adaptativa: UCP1 y más allá. Metab. celular 29, 27–37 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carobbio, S., Guénantin, A.-C., Samuelson, I., Bahri, M. & Vidal-Puig, A. Grasa marrón y beige: de las moléculas a la fisiología y fisiopatología. bioquimica Biografía. Acta Mol. Biol celular. Lípidos 1864, 37–50 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Leibel, RL & Hirsch, J. Una técnica radioisotópica para el análisis de la reesterificación de ácidos grasos libres en tejido adiposo humano. Soy. J. Physiol. 248, E140–E147 (1985).

CAS PubMed Google Académico

Previs, SF et al. Nuevas metodologías para estudiar la síntesis y el recambio de lípidos: mirar hacia atrás para poder avanzar. bioquimica Biografía. Acta 1842, 402–413 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Thiele, C., Wunderling, K. & Leyendecker, P. Seguimiento multiplexado y unicelular del metabolismo de los lípidos. Nat. Métodos 16, 1123–1130 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wunderling, K. et al. La síntesis hepática de triacilgliceroles que contienen ácidos grasos de cadena media está dominada por la diacilglicerol aciltransferasa 1 y etomoxir la inhibe eficazmente. mol. metab. 45, 101150 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Conti, R. et al. La inhibición reversible selectiva de la carnitina palmitoil-transferasa hepática 1 por teglicar reduce la gluconeogénesis y mejora la homeostasis de la glucosa. Diabetes 60, 644–651 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giannessi, F. et al. Descubrimiento de un derivado de carbamoil aminocarnitina de cadena larga, un inhibidor reversible de carnitina palmitoiltransferasa con actividad anticetósica y antidiabética. J.Med. química 46, 303–309 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Crown, SB, Marze, N. & Antoniewicz, MR El catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada contribuye significativamente a la síntesis de ácidos grasos de cadena par e impar en adipocitos 3T3-L1. PloS One 10, e0145850 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

VAUGHAN, M. La producción y liberación de glicerol por tejido adiposo incubado in vitro. J. Biol. química 237, 3354–3358 (1962).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Romero, Md. M., Sabater, D., Fernández-López, JA, Remesar, X. & Alemany, M. Producción de glicerol a partir de glucosa y fructosa por células 3T3-L1: un mecanismo de defensa de los adipocitos frente al exceso de sustrato. PLoS ONE 10, e0139502 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rotondo, F. et al. El glicerol es sintetizado y secretado por los adipocitos para eliminar el exceso de glucosa, a través de la glicerogénesis y el aumento del recambio de acil-glicerol. ciencia Rep. 7, 8983 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Flachs, P. et al. Inducción de lipogénesis en la grasa blanca durante la exposición al frío en ratones: vínculo con el fenotipo magro. En t. J. Obes. (2005) 41, 372–380 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Motillo, EP et al. Acoplamiento de la lipólisis y la lipogénesis de novo en tejidos adiposos de color marrón, beige y blanco durante la activación crónica del receptor β3-adrenérgico. J. Lipid Res. 55, 2276–2286 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palomer, X., Pizarro-Delgado, J., Barroso, E. & Vázquez-Carrera, M. Ácido palmítico y oleico: el yin y el yang de los ácidos grasos en la diabetes mellitus tipo 2. Tendencias Endocrinol. metab. 29, 178–190 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hishikawa, D. et al. Descubrimiento de una familia de lisofosfolípidos aciltransferasa esencial para la asimetría y diversidad de membranas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 105, 2830–2835 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mouchlis, VD & Dennis, EA Catálisis de fosfolipasa A2 y lipidómica de mediadores de lípidos. bioquimica Biografía. Acta Mol. Biol celular. Lípidos 1864, 766–771 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hadley, KB, Ryan, AS, Forsyth, S., Gautier, S. y Salem, N. La esencialidad del ácido araquidónico en el desarrollo infantil. Nutrientes 8, 216 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Christophersen, BO, Hagve, TA & Norseth, J. Estudios sobre la regulación de la síntesis de ácido araquidónico en células de hígado de rata aisladas. bioquimica Biografía. Acta 712, 305–314 (1982).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fahy, E. et al. Actualización del sistema de clasificación integral LIPID MAPS para lípidos. J. Lipid Res. 50, S9–S14 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Liebisch, G. et al. Actualización sobre la clasificación, nomenclatura y notación abreviada de LIPID MAPS para estructuras lipídicas derivadas de la EM. J. Lipid Res. 61, 1539–1555 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Milne, SB et al. Captura y liberación de glicerofosfolípidos derivatizados con alquino mediante la química del cobalto. Nat. química Biol. 6, 205–207 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuerschner, L. et al. Polieno-lípidos: una nueva herramienta para obtener imágenes de lípidos. Nat. Métodos 2, 39–45 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kuerschner, L. et al. Desarrollo de ácidos grasos oxaalquinos y alquinos como trazadores novedosos para estudiar vías e intermedios de beta-oxidación de ácidos grasos. J. Lipid Res. https://doi.org/10.1016/j.jlr.2022.100188 (2022).

Herzog, R. et al. Un concepto informático novedoso para la lipidómica de escopeta de alto rendimiento basada en el lenguaje de consulta de fragmentación molecular. Genoma Biol. 12, R8 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación)—identificadores del proyecto: SFB 1454 número de proyecto 432325352, TH 780/4-1 Trazado multiparalelo de lípidos, TH 780/5-1 SPP 2306 Ferroptosa a CT; KU 2374/3-1 a LK; y por la Estrategia de Excelencia de Alemania—EXC2151—subvención no. 390873048 a CT

LIMES Life and Medical Sciences Institute, Universidad de Bonn, Bonn, Alemania

Klaus Wunderling, Jelena Zurkovic, Fabian Zink, Lars Kuerschner y Christoph Thiele

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

KW, JZ y FZ diseñaron y realizaron experimentos y analizaron datos. LK diseñó figuras y contribuyó a la organización del manuscrito y redacción de textos. CT conceptualizó el proyecto, realizó la síntesis química, escribió el código mfql, analizó datos, diseñó figuras y escribió el texto.

Correspondencia a Christoph Thiele.

La Universidad de Bonn (propietario) y CT (inventor) han presentado una patente (EP3587382, solicitud de patente de EE. UU. 17/254,922) que cubre partes importantes de la tecnología de rastreo de MS de lípidos alquinos que es el núcleo metodológico de esta publicación.

Nature Metabolism agradece a Guanghou Shui, Douglas Mashek y Zheng Ouyang por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Isabella Samuelson, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El ejemplo es un TG 50:2;Y1 que contiene FA 13C9-16:0;Y de una muestra multiplexada. Después de hacer clic en la reacción de muestras individuales con uno de los reactivos C175-7x relacionados (Thiele et al., 2019), MS2 analizó las muestras agrupadas del pico precursor en m/z 1010,92. Este precursor común sufre fragmentación por pérdida neutra de las cuatro trialquilaminas isotópicas para dar la serie de picos en m/z 937,83. La pérdida neutra adicional de ácidos grasos por eliminación da lugar a dos series de picos en m/z 683,61 y 655,58. La diferencia con la serie en 937.83 identifica los dos FA no marcados en la molécula TG. Si la molécula de TG en estudio contiene dos FA idénticos sin marcar, solo se ve una serie de picos en este rango de masas (consulte la Fig. 5b, c como ejemplo). El recuadro muestra la estructura de pico multiplex típica producida por las pérdidas de trialquilamina de 73, 75, 76 y 77 Da que permite una asignación clara a las muestras individuales en el grupo multiplex. La serie de picos am/z 363,34 es la señal del FA;Y que reaccionó con clic después de la pérdida neutra de 73,09 que se liberó como un FA libre de la molécula TG. Esta serie de picos contiene información sobre si el FA;Y de entrada original se utilizó para la síntesis de TG sin cambios o si se modificó previamente, por ejemplo, mediante elongación, desaturación o degradación parcial.

Los círculos simbolizan los pocillos de la placa de 24 pocillos, que contienen adipocitos 3T3-L1 diferenciados. Los números 16/11/18 se refieren a la entrada anterior FA;Y utilizada a 50 µM durante 2 h. Después de la incubación, se retiraron los medios, se lavaron las células y se extrajeron los lípidos en presencia de estándares internos. Los lípidos extraídos se hicieron reaccionar con clic con las moléculas informadoras C175-7x indicadas a la derecha. Después de la reacción, las muestras se agruparon de modo que un grupo contuviera las cuatro réplicas multiplexadas con entradas idénticas pero diferentes indicadores de clic, que luego se analizaron con MS1 ​​y MS2, seguido de un procesamiento de datos con el software LipidXplorer (Herzog et al., 2011).

El diagrama muestra todas las especies TG;Y1 etiquetadas que contienen FA 11:0;Y o FA 18:2;Y de 35-58 carbonos (#C) en las cadenas FA, con cantidades pmol (a) o relativas (b) color- codificado. Cada fila representa una especie. En el primer paso, cada especie se analizó si muestra el patrón de etiquetado típico esperado para FA 11:0;Y (por ejemplo, 1 →) o FA 18:2;Y (2 →) o un patrón mixto (3 →). En el segundo paso, las especies se asignaron a la respectiva entrada FA;Y o no se asignaron (c). La cantidad de pmol de estas asignaciones tomadas de las muestras con triple etiquetado se resumen en la parte inferior derecha, lo que indica que se asignó aproximadamente el 95 % del material etiquetado. Nótese que, en contra de las expectativas originales, numerosas especies pares fueron asignadas a FA 11:0;Y y numerosas especies impares a FA 18:2;Y. La razón de esto es la abundancia relativamente alta de ácidos grasos impares endógenos, principalmente 15:0, 15:1, 17:0 y 17:1, en los adipocitos 3T3-L1 (Crown et al., 2015). Los números se codifican por intensidad de color (mínimo-máximo por bloque de datos), derivados de promedios, n = 4.

Se muestran cantidades de picomoles (izquierda) y cantidades relativas (derecha) de 100 TG;Y2 doblemente marcados; cada bloque AF representa una combinación de FA;Y en los algoritmos de búsqueda de especies y cada columna representa una combinación de FA;Y de entrada como se indica en la parte superior. Cada fila representa una especie TG;Y2 definida. Los números se codifican por intensidad de color (mínimo-máximo por bloque de datos), derivados de promedios, n = 4.

Los cuatro espectros son espectros de pérdida neutra m/z 73,1 que muestran los lípidos neutros marcados con C175-73 para los tiempos de pulso y seguimiento como se indica en los paneles. En el panel superior, las regiones espectrales que contienen picos para TG;Y1, TG;Y2 y TG;Y3 se indican con barras negras. Tenga en cuenta la disminución gradual de la señal de TG;Y3 y TG;Y2 y el aumento paralelo de TG;Y1. Dentro del TG;Y1, se puede ver claramente la pérdida selectiva de especies que contienen FA 11:0;Y.

Las células 3T3-L1 se marcaron con alquino FA (11: 0; Y, 16: 0; Y, 18: 2; Y, cada una a 50 µM) durante 1 hora, y los extractos de lípidos se hicieron clic con reactivos C175-7x. Se registraron los espectros de MS2 y, utilizando la función de mapa de iones del software Themo Xcalibur, se reconstruyeron los espectros de fragmentación. El panel a es un espectro MS2 de pérdida neutral de 0 Da. En estos experimentos, la fragmentación se realiza a tres energías diferentes, la más baja de las cuales no conduce a la fragmentación. Por lo tanto, todos los espectros de MS2 contienen un pico fuerte del ion precursor no fragmentado, que es el pico NL 0. Las principales especies endógenas no etiquetadas están etiquetadas en azul, las especies etiquetadas con alquinos en rojo. Efectivamente, el panel a es un espectro MS1 total. El panel b es el espectro de pérdida neutra m/z 73,1 que muestra los lípidos neutros marcados con alquino en C175-73. El panel c muestra el espectro de iones precursores para el fragmento m/z 284.23, que es [FA 11:0;Y + (C175-73) – NL 73.1], específico para TG;Y1 que contiene FA 11:0;Y.

Las células 3T3-L1 se marcaron con FA marcado con isótopos pesados ​​(11:0, 16:0, 18:2, cada uno a 50 µM) durante 1 hora y se extrajeron los lípidos. Se registraron los espectros y, utilizando la función de mapa de iones del software Themo Xcalibur, se reconstruyeron los espectros de fragmentación. El panel a es el espectro MS2 de pérdida neutral de 0 Da, equivalente a un espectro MS1 total. El panel b muestra el espectro de pérdida neutral para el fragmento m/z 206.2, que es FA 11:0[D3] + NH3, específico para TG que contiene FA 11:0[D3]. Comentario: Es obvio que los datos de etiquetado de isótopos en la Fig. 7 de datos extendidos no alcanzan la calidad del etiquetado de clic en la Fig. 6 de datos extendidos correspondiente. Los picos etiquetados en el etiquetado de isótopos tienden a desaparecer en el fondo, el La intensidad del espectro NL en el panel b es solo el 12 % de la correspondiente Fig. 6c de datos extendidos, aunque en realidad se trata de una muestra múltiplex que contiene la misma información cuatro veces (señales adicionales en m/z NL 75.1, 76.1 y 77.1). Además, los datos de la Fig. 7b de datos ampliados son más complejos que los de la figura 6c de datos ampliados, porque contienen no solo las especies con una sola etiqueta, sino también todas las combinaciones de FA 11:0[D3] consigo mismo y con el otro ácidos grasos marcados. Por el contrario, los datos extendidos de la Fig. 6c son un espectro limpio de TG;Y1 con FA 11:0;Y, porque las especies con doble y triple marca se encuentran en diferentes rangos del espectro y muestran diferentes preferencias de fragmentación.

Se buscaron espectros MS2 sin procesar de muestras del experimento pulso-persecución para el fragmento m/z 398,28, tolerancia 0,01 Da, que es característico de la presencia de FA 20:4;Y en TG;Y1. Los paneles muestran los espectros de iones precursores resultantes; todos están trazados en la misma escala para máxima intensidad. Las principales especies son: TG 52:6;Y en m/z 1021,8, TG 52:5;Y en m/z 1023,8, TG 54:6;Y en m/z 1049,8, TG 54:5;Y m/z 1051,8 .

Se buscaron espectros MS2 sin procesar de muestras del experimento pulso-persecución para el fragmento m/z 374,27, tolerancia 0,01 Da, que es característico de la presencia de FA 18:2;Y en TG;Y1. Los paneles muestran los espectros de iones precursores resultantes; todos están trazados en la misma escala para máxima intensidad. Las principales especies son: TG 50:4;Y en m/z 997,8, TG 50:3;Y en m/z 999,8, TG 50:2;Y en m/z 1001,8, TG 52:4;Y en m/z 1025,8, TG 52:3; Y en m/z 1027,8.

Los adipocitos 3T3-L1 diferenciados se marcaron con combinaciones de FA como se indica durante 1 h seguido de períodos de búsqueda como se indica. Las células se lavaron y se extrajeron los lípidos, se hicieron reaccionar con clic con los indicadores C175-7x y se analizaron mediante MS1/MS2 multiplexado. a, Se calculó la abundancia de especies marcadas que contenían de 2 a 5 dobles enlaces (# db) y de 34 a 38 átomos de C (# C) en las cadenas FA y se expresan como porcentaje del total de lípidos marcados con 18:2; de la respectiva clase de fosfolípidos. Los números están codificados por la intensidad del color, derivados de los promedios, n = 12. b,c, Distribución porcentual relativa del FA;Y total sobre las clases etiquetadas de TG;Yn. Los datos son promedio. +/- Desviación estándar, n = 11-12. Tenga en cuenta que los datos en el panel b son idénticos a los de la Fig. 4d.

Tablas complementarias 1 a 3, espectro 1 y métodos.

El archivo de datos de espectrometría de masas procesado y anotado que contiene los datos fuente para la Fig. 3 y partes de las Figs. 4, 5 y 6.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wunderling, K., Zurkovic, J., Zink, F. et al. El ciclo de los triglicéridos permite la modificación de los ácidos grasos almacenados. Nat Metab 5, 699–709 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

Descargar cita

Recibido: 13 Abril 2022

Aceptado: 27 de febrero de 2023

Publicado: 03 abril 2023

Fecha de emisión: abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Metabolismo de la naturaleza (2023)