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Aug 19, 2023

Dispositivos de prueba molecular para on

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4245 (2023) Citar este artículo

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Las células de Escherichia coli (E. coli) están presentes en las materias fecales que pueden ser la principal fuente de agentes causantes de enfermedades en el agua. Como resultado, se recomienda E. coli como indicador de la calidad del agua. Hemos desarrollado una plataforma innovadora para detectar E. coli para monitorear la calidad del agua en el sitio mediante la integración de la preparación de muestras en papel con la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. La plataforma lleva a cabo la lisis bacteriana y el enriquecimiento de ADN en una almohadilla de papel a través de válvulas de bola para el control de fluidos, sin necesidad de equipo de laboratorio, seguido de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) en una taza de café que funciona con batería y detección colorimétrica. . Hemos utilizado la plataforma para detectar E. coli en muestras de agua ambiental en aproximadamente 1 h, con un límite de cuantificación de 0,2 CFU/mL y 3 copias por reacción. La plataforma fue confirmada para detectar múltiples cepas de E. coli y para muestras de agua de diferentes concentraciones de sal. Validamos las funciones de la plataforma analizando muestras de agua recreativa recolectadas cerca del Océano Atlántico que contienen diferentes concentraciones de sal y bacterias.

Los recursos hídricos en todo el mundo están sujetos a una variedad de contaminantes, ya sean biológicos o no biológicos, y su presencia más allá de ciertos niveles puede ser perjudicial para los seres humanos1. La buena salud pública requiere un control regular de la calidad del agua para evitar que las personas contraigan enfermedades. En todo el mundo, aproximadamente 1,6 millones de personas mueren cada año debido a enfermedades transmitidas por el agua causadas por contaminantes biológicos1, lo que afecta a países de todos los niveles económicos2. Los patógenos son los principales contaminantes biológicos en el agua y, por lo tanto, es importante monitorear la presencia de estos en las fuentes de agua potable y recreativa. Algunos de estos patógenos incluyen Salmonella, Staphylococcus, Vibrio cholera, Legionella, Shigella, Escherichia coli (E. coli) y otras bacterias coliformes3. Estos patógenos pueden introducirse en las fuentes de agua y luego ingresar al cuerpo humano directamente al beber agua o indirectamente durante el baño y otras actividades acuáticas recreativas. Por ello, los límites aceptables de algunos de estos patógenos han sido definidos en la legislación por diferentes organizaciones como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) o la Unión Europea4.

La contaminación fecal es la principal fuente de agentes causantes de enfermedades en el agua1,4, incluidas las bacterias presentes en los excrementos de humanos y animales de sangre caliente. E. coli es un tipo de bacteria que normalmente vive en los intestinos de los animales de sangre caliente, aunque algunas cepas tóxicas (p. ej., E. coli O157:H7) pueden causar calambres abdominales, vómitos y diarrea. Incluso pequeñas cantidades de agua contaminada con estas cepas tóxicas pueden causar enfermedades5. Dado que los humanos y los animales de sangre caliente tienen E. coli presente en sus intestinos, y estas bacterias se liberan a través de las heces, E. coli puede funcionar como un indicador de contaminación fecal en agua dulce4,6.

La EPA informó un criterio actualizado en 2012 con una recomendación para la calidad del agua dulce y marina en aguas recreativas7. Informaron 2 criterios, uno para una tasa de enfermedad estimada (NGI, o enfermedad NEEAR-GI, mientras que NEEAR significa Evaluación epidemiológica y ambiental nacional de aguas recreativas y GI significa gastrointestinal) de 36 por 1000 recreadores de contacto primario, y uno para 32 por 1000 recreadores de contacto primario. El criterio recomendado para E. coli en agua dulce para el NGI de 32 por 1000 recreadores de contacto primario en cualquier intervalo de 30 días es una media geométrica de 100 unidades formadoras de colonias (CFU) por 100 mL y un valor de umbral estadístico (STV) de 320 UFC por 100 mL7. Como resultado, el límite de cuantificación (LoQ) de cualquier método desarrollado para monitorear la calidad del agua debe ser inferior a 100 CFU/100 mL o 1 CFU/mL.

Los métodos convencionales para detectar patógenos en el agua son en su mayoría enfoques basados ​​en cultivos y técnicas de separación/filtración en laboratorios8. Aunque estos ensayos de laboratorio convencionales son los métodos estándar debido a su precisión y sensibilidad, requieren instrumentos voluminosos y costosos, personal calificado y un tiempo de respuesta prolongado. Un sistema de prueba ampliamente utilizado es el IDEXX Colilert, que puede cuantificar la cantidad de coliformes totales y E. coli en una sola prueba. Si bien el sistema IDEXX Colilert es popular y relativamente fácil de usar, requiere un equipo voluminoso y costoso, como una incubadora, con un largo tiempo de obtención de resultados (24 h) debido al cultivo bacteriano9. Por lo tanto, existe una tendencia creciente a desarrollar dispositivos pequeños, fáciles de usar y rentables para métodos in situ con resultados más rápidos1, que permiten acciones inmediatas, lo que podría prevenir que las personas contraigan enfermedades. El desarrollo de metodologías in situ de bajo costo también puede beneficiar a los países o regiones con recursos limitados donde los entornos de laboratorio no están disponibles o no son de fácil acceso.

Las plataformas portátiles in situ incluyen enfoques basados ​​en ensayos enzimáticos10,11,12, microfluídica13,14,15, tiras de flujo lateral16,17 y dispositivos analíticos basados ​​en papel11,18 junto con detección de fluorescencia19, colorimetría20 o electroquímica21 para una interpretación rápida y fácil de resultados Las limitaciones citadas a menudo de estos enfoques incluyen un bajo volumen de muestra procesada (p. ej., dispositivos de microfluidos), sensibilidad relativamente baja debido a que no hay amplificación (p. ej., tiras de flujo lateral y técnicas de hibridación de ácidos nucleicos) y largos tiempos de incubación (p. ej., ensayos enzimáticos). . Por otro lado, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), brindan una mayor sensibilidad y un tiempo de obtención de resultados más rápido que los métodos de cultivo y, por lo tanto, a menudo son los preferidos22,23,24. Sin embargo, los enfoques de PCR requieren preparación de muestras, instrumentos sofisticados y personal capacitado, mientras que las técnicas de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), son más fáciles de implementar debido a que no requieren ciclos de temperatura25,26,27. Por ejemplo, Lee et al. emplearon filtros de jeringa y perlas magnéticas para extraer ADN, seguido de LAMP en un instrumento portátil27.

En este trabajo, informamos el desarrollo de una plataforma de prueba in situ para la detección de E. coli en el agua. La plataforma puede (1) procesar grandes volúmenes de muestra (1 a 10 ml) mediante un método de preparación de muestras basado en papel habilitado por válvula, (2) amplificar el ADN mediante LAMP y (3) detectar amplicones en función del cambio de color. Utilizamos un dispositivo impreso en 3D y válvulas de bola para la entrega secuencial de los reactivos necesarios para la lisis celular, el enriquecimiento y la purificación del ADN, y el ADN resultante se concentró en un papel de cromatografía. Luego, LAMP se logró mediante una taza de café inteligente alimentada por batería que funciona como un baño de agua, proporcionando una temperatura constante. Se utilizó colorante SYBR Green para la detección colorimétrica. Hemos demostrado la detección de E. coli en muestras de agua ambiental en aproximadamente 1 h (~ 30 min. de preparación de la muestra y ~ 45 min. LAMP) usando esta plataforma de prueba.

Como se muestra en la Fig. 1, el dispositivo consta de una unidad tampón, una unidad de mezcla, una unidad de detección y un contenedor de residuos. La unidad de detección estaba hecha de una capa de policarbonato, cinta adhesiva de doble cara, dos capas de películas termoplásticas y un papel de cromatografía. Se le dio forma al contenedor en un cuadrado de 2 cm × 2 cm a partir de una lámina de policarbonato de 3 mm de espesor (McMaster-Carr, Elmhurst, IL) usando una fresadora CNC (Sherline Products, Vista, California), y un pozo de 4- mm (o 6 mm) de diámetro en el centro. Una pieza de papel de cromatografía Whatman™ 1 (Fisher Scientific) y dos películas de laminación de unión térmica de poliéster de 75 μm de espesor (Lamination Plus, Kaysville, UT, EE. UU.) se cortaron en círculos de 3,5 mm o (5,5 mm) de diámetro utilizando un Plotter de corte Graphtec Craft Robo-S (Graphtec Corporation, Yokohama, Japón). Luego, el papel se intercaló entre las dos películas termoplásticas y se pasó a través de una laminadora, GBC® Catena 65 Roll Laminator (GBC, Lake Zurich, IL, EE. UU.), configurada a una velocidad de laminación de "1" y a una temperatura de 220 °F. como se describió previamente28,29. A continuación, esta almohadilla de papel laminado se unió a la capa de pocillo de policarbonato utilizando cinta adhesiva de doble cara (cinta adhesiva blanca 3 M 9087, RS Hughes, Sunnyvale, CA), formando la unidad de detección.

Vista despiezada de los componentes del dispositivo. La unidad de amortiguamiento en la parte superior contiene cuatro depósitos y una abertura. Estos 4 depósitos son para el tampón de lisis, el tampón de unión y los 2 tampones de lavado. La abertura en la parte inferior de cada pozo está bloqueada por una bola de acero inoxidable para evitar que los reactivos fluyan hacia abajo hasta que se desee. La unidad de mezcla en el medio tiene forma de embudo para mejorar la mezcla y hacer que los reactivos y la muestra pasen a través del papel en la unidad de detección, que se inserta por la protuberancia (➇) en la parte inferior de la unidad de mezcla. La unidad de mezcla tiene un pasador que empuja la bola hacia arriba, lo que abre la válvula y permite que los reactivos bajen cuando se gira la unidad tampón para alinear el pasador con la bola. Finalmente, el contenedor de desechos en la parte inferior sirve para 2 propósitos, (1) recolectar los desechos y (2) si es necesario, acelerar el proceso de filtración al conectarle una aspiradora o un mecanismo de succión.

Se utilizó una impresora 3D comercial, Ultimaker 3 (Ultimaker, Geldermalsen, Países Bajos), para fabricar la unidad tampón, la unidad de mezcla y el contenedor de residuos. Los dispositivos se imprimieron utilizando acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), con la altura de la capa de impresión establecida en 0,1 mm y la densidad de relleno establecida en 100 %. Las bolas utilizadas para la válvula en cada pozo eran bolas de acero inoxidable 316 resistentes a la corrosión de 4,0 mm de diámetro (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). El concepto de válvula se ilustra en la Fig. 2. Este mecanismo de válvula es como un bolígrafo, en el que la tinta se dispensa sobre el papel cuando se presiona la bola de metal en la punta del bolígrafo mientras se escribe.

Mecanismo de válvulas basado en bolas. (izquierda) La válvula está cerrada cuando la bola impide que el reactivo fluya hacia abajo. (derecha) La válvula se abre después de girar la unidad tampón y el pasador se alinea con la bola, levantando la bola y permitiendo que los reactivos fluyan hacia la unidad mezcladora.

La unidad tampón tiene forma cilíndrica con un diámetro de 7,1 cm, una altura de 1 cm, tres depósitos con un diámetro superior de 2 cm y uno con 2,4 cm, todos con una profundidad de 1 cm y un diámetro inferior de 0,38 cm. El pozo más grande (en la Fig. 1) es para acomodar el mayor volumen de muestra y reactivo. Estos depósitos pueden contener volúmenes de hasta 1,28 y 1,78 ml, respectivamente. La apertura en la parte superior fue diseñada para 2 propósitos: (1) visualizar cuando los reactivos atraviesan el papel por completo, moviéndose al siguiente paso, y (2) permitir, si es necesario, agregar muestras mayores a 1 mL (hasta 10 mL). ). La unidad mezcladora tiene una altura de 4,5 cm, un diámetro superior exterior de 6,5 cm, un diámetro superior interior de 5,5 cm, un diámetro inferior exterior de 8 cm y un diámetro interior de 6 cm. El grosor de la pared en la parte superior es de 1 cm y de 2 cm en la parte inferior, lo que ayuda a lograr el vacío en el dispositivo sin fugas de aire en las paredes del material impreso en 3D. La protuberancia en la parte inferior de la unidad mezcladora (parte n.° 8 en la Fig. 1) permite que encaje perfectamente con el pozo de la unidad de detección. El paso de líquido de la unidad de mezcla a la unidad de detección tiene un diámetro de 5 mm para la integración con las unidades de detección de 6 mm de diámetro, que se encuentra a 3 cm de la parte superior del pozo de mezcla. El contenedor de residuos tiene un diámetro exterior de 10 cm y una altura de 3 cm, sin embargo, estas dimensiones y las de la unidad de mezcla podrían reducirse si no se utiliza vacío o si se fabrica un dispositivo utilizando una técnica de fabricación diferente. En general, cuando el dispositivo está ensamblado, la altura total es de 7,5 cm.

El proceso de preparación de muestras del dispositivo consiste en la liberación secuencial de las soluciones tampón para la lisis, la unión y el lavado del ADN desde la unidad tampón a la unidad mezcladora mediante la activación de válvulas de bola. Estas soluciones luego se dirigen para pasar a través de la unidad de detección para el enriquecimiento y purificación de ADN en el papel de cromatografía. En primer lugar, todas las soluciones tampón se cargan en sus respectivos depósitos en la unidad tampón, incluidos 200 μl de tampón de lisis AL (QIAGEN), 200 μl de etanol, 500 μl de AW1 (QIAGEN) y 500 μl de AW2 (QIAGEN). En segundo lugar, se agrega 1 ml de una muestra de agua al primer depósito que contiene la solución de lisis para lisar la muestra durante 10 minutos y luego la mezcla se descarga a la unidad de mezcla girando la unidad de amortiguación y accionando la válvula. Esto fue seguido por la rotación inmediata de la unidad tampón nuevamente para descargar el tampón de unión del depósito n.° 2 para mezclarlo con la mezcla de muestra/lisis. Después de que estas soluciones pasen por completo a través de la unidad de mezcla y luego a la almohadilla de papel en la unidad de detección, la unidad tampón se gira nuevamente para descargar los tampones de lavado, AW1 del depósito n.º 3 y AW2 del depósito n.º 4, uno a la vez para purificar el ADN recogido en el papel.

Después de la purificación del ADN, la unidad de detección se separa de la unidad de mezcla, lista para el siguiente paso: la amplificación del ADN. Después del desprendimiento, el lado inferior de la unidad de detección se sella con un trozo de cinta PCR, y luego se agrega la mezcla LAMP de 50 µL con una pipeta desechable. Se coloca otro trozo de cinta PCR en la parte superior de la unidad de detección para sellar la unidad de detección y evitar la posible evaporación o fuga. A continuación, la unidad de detección se sumerge en agua en una taza de café a 62,5 °C durante 45 min. Después de la amplificación, se saca la unidad de detección de la taza y se retira el trozo de cinta de la parte superior, y luego se agrega 1 µL de SYBR Green para la detección colorimétrica. En la figura complementaria S1 se muestra un esquema del proceso general y los pasos de la plataforma. El video complementario S1 muestra todo el proceso del dispositivo, desde su preparación hasta la detección colorimétrica de los amplicones.

Las válvulas de control de fluidos se emplean para realizar la preparación de muestras mediante la liberación secuencial de los reactivos desde la unidad tampón a la unidad mezcladora sin necesidad de equipo básico de laboratorio. Cada válvula consta de una bola de acero inoxidable colocada en el fondo de un pozo de solución amortiguadora para evitar que el reactivo fluya hacia abajo hasta que se desee. La bola sobresale 1,5 mm desde la parte inferior de la unidad tampón, de modo que el pasador de la unidad mezcladora levanta las bolas y permite que los reactivos fluyan hacia abajo cuando el pasador está alineado con las bolas, como se muestra en la Fig. 2. Este mecanismo de válvula es esencialmente el mismo que informamos anteriormente28,29, aunque a través de deslizamiento horizontal en el trabajo anterior, en lugar de rotación en este trabajo. Para evitar el desplazamiento de la bola y las fugas durante el transporte, se crea una unión a base de cera rompible entre la bola y el depósito. Primero, se funde con calor un trozo de cera (Akrowax™ 130, Akron, OH, EE. UU.) en un vaso de precipitados pequeño, y luego se sumerge una bola en la cera derretida. La bola que contiene una fina capa de cera se coloca inmediatamente en el depósito, lo que permite que la cera se solidifique y cree una unión rompible para evitar cualquier movimiento no deseado.

Cada mezcla LAMP de 25 μL contiene 2,5 μL de tampón de amplificación isotérmica 10X, 8 U Bst 2.0 WarmStart® ADN polimerasa, 2,5 μL de mezcla de cebadores concentrados 10X y una concentración final de dNTP 1,4 mM y MgSO4 6 mM. El volumen de 25 μL se llenó con agua libre de nucleasas (no tratada con dietilpirocarbonato o DEPC). A excepción del agua libre de nucleasas y los dNTP de ThermoFisher Scientific (MA, EE. UU.), los demás reactivos de la mezcla LAMP se obtuvieron de New England Biolabs (NEB) (Ipswich, MA, EE. UU.). La mezcla de cebadores 10x contiene 16 μM de cebador interno directo (FIP) y cebador interno regresivo (BIP), cebador externo directo de 2 μM (a menudo llamado F3) y cebador externo regresivo (a menudo llamado B3), y cebador de bucle delantero de 8 μM (LF ) y cebador de bucle hacia atrás (LB); sus secuencias se muestran en la Tabla complementaria S1. Los cebadores se adquirieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EE. UU.), y sus secuencias se eligieron siguiendo la literatura30. Cuando se usaron 50 μL de mezcla LAMP para reemplazar la mezcla de 25 μL, los volúmenes de todos los reactivos se duplicaron, manteniendo la misma concentración final. Para evitar la amplificación no específica y posibles resultados falsos positivos, se agregaron uracilo ADN glicosilasa (UDG) y dUTP a las reacciones LAMP para eliminar la contaminación por arrastre. UDG se ha utilizado ampliamente para prevenir la contaminación por arrastre sin comprometer la sensibilidad en LAMP y otros ensayos de amplificación de ácidos nucleicos31,32,33.

Para lograr LAMP sin la necesidad de conexión a una toma de corriente, elegimos una taza de café a batería disponible en el mercado (Taza de viaje Ember™, Ember Technologies, Inc., Westlake Village, CA) como un baño de agua como se informó anteriormente28,29 . Antes de colocarlas en la taza Ember™ que contenía agua a 62,5 °C, las unidades de detección se sellaron con dos piezas de cinta (Fellows®) para cubrir las partes inferior y superior para evitar fugas y evaporación. Después de 45 min de incubación, las unidades de detección se sacaron para la detección colorimétrica, la cual se llevó a cabo agregando 1.0 μL de 10,000X concentrado SYBR green I en dimetilsulfóxido (ThermoFisher Scientific) a cada unidad de detección. Usamos SYBR green, un colorante fluorescente, para la detección colorimétrica de amplicones; el cambio de color se puede visualizar a simple vista o grabar con la cámara de un teléfono inteligente. Para ayudar a la visualización, se usó una linterna LED azul (diodo emisor de luz) ULAKO (Amazon, WA, EE. UU.) alimentada por una batería AA para observar la fluorescencia verde cuando había E. coli presente. Los resultados también se pueden verificar mediante electroforesis en gel si es necesario. Tenga en cuenta que LAMP produce una variedad de amplicones con diferentes tamaños; por lo tanto, no tiene una banda de gel específica como PCR34. Elegimos SYBR green porque detecta los amplicones directamente, mientras que otros colorantes como la calceína35, el azul de hidroxinaftol36 (HNB) o el rojo de fenol37 detectan los subproductos de la amplificación LAMP. Otros tintes, como SYTO-9, son difíciles de visualizar a simple vista cuando se encuentran en una concentración baja que no inhibe la reacción LAMP, pero se pueden usar para la detección en tiempo real con un instrumento38.

Para estudiar el tiempo de incubación requerido para el ensayo LAMP, se llevaron a cabo experimentos LAMP en tiempo real agregando 0,5 µL de concentrado 10X SYBR green I (ThermoFisher Scientific) a la mezcla de reacción LAMP de 25 µL. La señal de fluorescencia de la reacción LAMP se leyó a través del sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific). Probamos diferentes cantidades de ADN de E. coli, 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 y 8 × 101 copias, cada una de las cuales se añadió a una solución de reacción de 25 μL. Probamos 3 réplicas de cada concentración, incluidos 3 controles sin plantilla (NTC).

Para evaluar el límite de cuantificación (LoQ) del ensayo LAMP para la detección de E. coli, se extrajo ADN de células de E. coli DH5-α utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Se determinó que la concentración del ADN purificado era de 160 ng/µL usando un espectrofotómetro ultravioleta-visible. Se calcularon las copias/µL del ADN extraído, que se determinó que eran aproximadamente 3 × 107 copias/µL utilizando el peso molecular del genoma de E. coli. Se realizaron diluciones en serie de esta solución madre utilizando agua libre de nucleasas (Fisher Scientific). Se añadió 1 µL de ADN purificado de las diferentes concentraciones a reacciones LAMP de 25 µL, junto con un NTC.

El número de copias se calculó en función del número de pares de bases en la secuencia, que se determinó a partir del NCBI GenBank (CP026085.1), que contiene 4 833 062 pares de bases. Entonces, usando la Ec. (1) a continuación39, calculamos el número de copias del ADN purificado.

Se recolectaron muestras de agua ambiental en la región noreste de Florida, en Pellicer Creek (ubicación del mapa: 29.66260 N 81.26837 W), Mouth of Pellicer Creek (29.66431 N 81.22892 W) y Whitney Lab Docks (29.669249 N 81.216506 W). Pellicer Creek está vinculado a áreas residenciales y su flujo de agua hacia o desde (según la marea) los muelles de Whitney Lab, que se encuentran junto al océano Atlántico. La muestra n.º 1 se recolectó en Whitney Lab Docks el 30 de agosto de 2019, mientras que la muestra n.º 2 se recolectó en la desembocadura de Pellicer Creek el 6 de septiembre de 2019. Tenga en cuenta que la muestra n.º 1 se recolectó antes de que el huracán Dorian azotara el área mientras que la muestra n.º 2 se recolectó después del huracán. Ambos fueron filtrados utilizando un filtro de fibra de vidrio Whatman y una bomba peristáltica. Las muestras n.º 3 y n.º 4 (tres réplicas para cada muestra) se recolectaron en Pellicer Creek y Whitney Lab Docks, respectivamente, el 26 de mayo de 2021. En la Tabla complementaria S2 se proporciona un resumen de la información de las muestras ambientales. Las muestras n.° 3 y n.° 4 fueron recibidas sin filtrar y ciegas por el investigador que realizó los experimentos para validar la plataforma. Algunas de las muestras n.° 3 y n.° 4 se filtraron con un filtro de fibra de vidrio Whatman (0,7 µm) y una jeringa de 50 ml, y se comparó el rendimiento del ensayo entre muestras filtradas y sin filtrar. Todas las muestras de agua se procesaron utilizando el dispositivo de la Fig. 1.

Para estudiar los posibles efectos de la sal en el agua del océano en la preparación de muestras y el ensayo LAMP y para demostrar la capacidad de procesar una amplia variedad de muestras de agua, probamos la plataforma utilizando muestras preparadas añadiendo células de E. coli DH5-α en células desionizadas ( DI) agua, que contiene 3,5%, 2,0%, 0,5% y 0,0% (porcentaje en peso) de cloruro de sodio (NaCl). Estas concentraciones se eligieron para simular la concentración de sal en el agua de los océanos (3,5 %) al agua dulce (~ 0 %). Cualquier concentración entre ellos se puede encontrar en el agua en diferentes puntos de los estuarios. Se probaron cinco réplicas para cada concentración de sal. Para preparar estas muestras, se agregaron células de E. coli DH5-α en un medio de suspensión a un tubo de 2 ml y se centrifugaron para formar un sedimento celular. Después de retirar el medio sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió en 0,4 ml de agua DI y se mezcló mediante agitación vorticial pulsada. A continuación, la muestra se dividió en cuatro tubos de 2 ml. Cada tubo se centrifugó nuevamente y se descartó el agua DI, seguido de la adición de 1 ml del agua que contenía un tipo de concentración de sal.

La figura 1 muestra el diseño del dispositivo para la extracción, enriquecimiento, purificación y detección de ADN de E. coli en muestras de agua ambiental. El dispositivo consta de una unidad tampón en la parte superior, una unidad de mezcla en el medio, una unidad de detección insertada en la parte inferior de la unidad de mezcla y un contenedor de residuos. La unidad tampón contiene los reactivos necesarios para la preparación de muestras; cada solución se descarga girando la unidad tampón sobre la unidad mezcladora para accionar las válvulas de bola. Estas válvulas de control de fluidos evitan que los reactivos bajen hasta que las bolas sean levantadas por el pasador en la unidad mezcladora. Luego, estos reactivos se mezclan y pasan por la unidad de detección para la recolección de ADN purificado en el papel de cromatografía, seguido de la amplificación de ADN a través de LAMP. Los reactivos se pueden empaquetar previamente en la unidad tampón para su almacenamiento y transporte mientras los pocillos están sellados, y las válvulas de bola no muestran fugas cuando se usa cera para fijar las bolas como se muestra anteriormente28.

Nuestro dispositivo integra todos los pasos necesarios para un ensayo de ácido nucleico, incluida la lisis, el enriquecimiento y la purificación del ADN, la amplificación y la detección. Como resultado, nuestra plataforma elimina la necesidad de transportar muestras desde el sitio de muestreo hasta un laboratorio. También tiene un tiempo de ensayo mucho más corto que los enfoques basados ​​en cultivos. En comparación con los métodos tradicionales de preparación de muestras basados ​​en columnas de extracción sólidas, el enriquecimiento de ADN en una almohadilla de papel reduce aún más pasos como la transferencia de ADN entre tubos, evitando posibles problemas de contaminación y degradación, y eliminando cualquier paso de elución para extraer el ADN de la columna sólida. El ADN en la almohadilla de papel de nuestro dispositivo se puede usar directamente para LAMP, lo que ofrece ventajas significativas sobre el método de columna de extracción porque no se puede eluir todo el ADN de la columna y no hay dilución cuando se elimina el paso de elución. Se eligió un papel de cromatografía de celulosa sin tratar para el enriquecimiento de ADN después de su comparación con la tarjeta FTA disponible en el mercado y el papel de microfibra de vidrio, que mostró un enriquecimiento de ácido nucleico ligeramente mejor de los virus de influenza40.

Para optimizar el tamaño del papel en la unidad de detección, llevamos a cabo el siguiente análisis. Calculamos el tiempo de preparación de la muestra utilizando la ecuación. (2). El volumen de la muestra es de 1 mL, mientras que el volumen total de los reactivos de tampones de lisis/unión/lavado es de 1,4 mL. La velocidad de flujo es de 4,33 mm/min según el fabricante del papel de cromatografía. Es comprensible que cuanto mayor sea el área de superficie del círculo de papel, menor será el tiempo de preparación de la muestra. El tiempo calculado en función del diámetro del papel se muestra en la figura complementaria S2a. Los resultados muestran que el tiempo teórico de preparación se reduce de 44 a 19 min cuando se aumenta el diámetro del papel de 4 a 6 mm. También observamos que a partir de un determinado tamaño de papel (> 7 mm), la disminución del tiempo de preparación de la muestra no es significativa. Al mismo tiempo, cuando aumenta el diámetro del círculo de papel, el volumen de mezcla LAMP necesario para cubrir toda el área aumenta proporcionalmente con el área de la superficie (o el cuadrado del diámetro). Dado que el volumen de la mezcla LAMP es de 25 µL en un pozo de 4 mm, como informamos anteriormente28,29, el volumen de mezcla LAMP requerido para otros tamaños de círculos de papel se puede calcular utilizando la ecuación. (3). Los resultados se representan en la figura complementaria S2b e indican que el volumen y, en consecuencia, el costo de la mezcla LAMP aumenta considerablemente. Como resultado, elegimos un tamaño de papel de 6 mm de diámetro y un volumen de mezcla LAMP de 50 µL para la comparación experimental.

Usamos las muestras de agua n.° 1 y n.° 2 (ambas filtradas cuando se proporcionaron las muestras) para comparar el tiempo de preparación de la muestra entre las almohadillas de papel de 4 mm y 6 mm de diámetro. Vimos una gran diferencia como se resume en la Tabla complementaria S3. Las muestras tomaron más de 131 min. procesar utilizando los papeles de 4 mm de diámetro, mientras que tardaron 23 min. para los papeles de 6 mm de diámetro. Estos resultados confirmaron el rendimiento mucho mejor del tamaño de papel más grande en nuestro dispositivo. Una desventaja de usar un papel de 6 mm de diámetro es su aumento en el volumen de mezcla LAMP como se mencionó anteriormente, así como el costo del reactivo resultante. También comparamos el tiempo de preparación de la muestra de dos tipos adicionales de muestras utilizando papeles de 6 mm de diámetro: muestras de agua sin filtrar y muestras de agua destilada enriquecidas con sales para los experimentos de salinidad. Observamos que el tiempo disminuyó unos 8 min. de las muestras sin filtrar (31 min.) a las muestras filtradas (23 min.), y se redujo aún más alrededor de 4 min. de las muestras filtradas a las enriquecidas (19 min.), respectivamente. Los resultados también se resumen en la Tabla complementaria S3.

Empleamos una máquina de PCR en tiempo real para identificar el tiempo mínimo requerido para el ensayo LAMP. La Figura 3a muestra las curvas de amplificación de fluorescencia promedio para 4 concentraciones de ADN diferentes, utilizando 3 réplicas para cada curva. Todas las muestras cruzaron la línea del umbral (definida como 10 veces la desviación estándar del ruido de fondo por encima de la línea de base) en 35 min y alcanzaron una meseta en 45 min. Como resultado, elegimos 45 min como el tiempo de reacción de LAMP. Todas las reacciones en la Fig. 3 se incubaron durante 60 min y no se observó amplificación no específica en todas las réplicas de NTC. Dado que LAMP implica muchos pasos complejos, la señal de fluorescencia no se correlaciona con la cantidad de bacterias inicial. Sin embargo, el tiempo de umbral se puede utilizar para correlacionar con la cantidad inicial de bacterias, como en PCR41. La Figura 3b muestra la curva de calibración entre el tiempo umbral (que proporcionó el instrumento) y la cantidad de bacterias, lo que indica que la detección semicuantitativa de E. coli es factible.

Amplificación LAMP en tiempo real utilizando ADN purificado de E. coli DH5-alfa. (a) Señal fluorescente de 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 y 8 × 101 copias bacterianas por reacción en función del tiempo. NTC, control sin plantilla. (b) Curva de calibración que muestra el tiempo umbral (Ct) en función de las copias en cada reacción (en escala logarítmica). Los resultados se generaron a partir de 3 réplicas de cada concentración de muestras de ADN. Las barras de error indican una desviación estándar.

Estudiamos el límite de cuantificación del ensayo LAMP utilizando 300, 30, 3 y 1 copias de ADN de E. coli DH5-α y observamos las señales positivas en las 5 réplicas de 300, 30 y 3 copias, como se muestra en la Fig. 4. Sin embargo, para muestras de 1 copia, observamos señales positivas en solo 1 de cada 3 repeticiones, lo que indica que el LoQ de nuestro ensayo está entre 3 y 30 copias, similar al límite de detección informado anteriormente de 10 copias por reacción30. Los resultados se confirmaron mediante electroforesis en gel. Los resultados de esos experimentos repetitivos que no están incluidos en la Fig. 4 se muestran en la Fig. S3 complementaria.

(a) Fotografías de los tubos de reacción tomadas bajo las luces de la habitación después del ensayo LAMP a 62,5 °C durante 45 min. La cantidad de ADN de E. coli son 300 copias para el control positivo (P), y las demás están marcadas en los tubos, 30, 3 copias y 1 copia, así como un control negativo (N). (b) Los mismos tubos de (a) bajo una linterna LED azul. (c) Electroforesis en gel de esas muestras en (a).

Primero analizamos las muestras de agua filtrada n.º 1 y n.º 2, cuyos coliformes totales se midieron en 517,2 CFU/100 ml y 270 CFU/100 ml utilizando el sistema IDEXX Colilert. Tenga en cuenta que los coliformes totales son una colección de diferentes tipos de bacterias, incluida la E. coli y muchas otras. Después de analizar cada muestra cinco veces, obtuvimos resultados positivos para las cinco pruebas de la muestra n.° 1 y cuatro de cinco pruebas para la muestra n.° 2. La figura complementaria S4 muestra los resultados de 3 réplicas para cada muestra.

Dado que la cantidad de E. coli en estas dos muestras (n.° 1 y n.° 2) no está disponible (en ese momento solo se midió el total de coliformes), recolectamos más muestras: tres réplicas de muestras de Pellicer Creek (muestra n.° 3) y tres muestras de Whitney Lab Docks (muestra #4). Después de medir los coliformes totales y E. coli usando el sistema IDEXX Colilert, estas réplicas se entregaron como muestras ciegas a los investigadores que realizaron los experimentos a continuación usando el dispositivo descrito en este trabajo. Primero, cada réplica de la muestra se probó 2 veces y obtuvimos resultados positivos de las 6 pruebas para las tres réplicas de la muestra n.° 4, pero solo 2 de 6 pruebas para las tres réplicas de la muestra n.° 3, la mitad para las réplicas n.° 1 y n.° 2 , y 0/2 para la réplica #3. Para confirmar los resultados, analizamos la muestra n.º 3 una vez más y obtuvimos resultados positivos para las réplicas n.º 1 y n.º 2, y negativos para la réplica n.º 3.

Los resultados de estas pruebas se compartieron con quienes proporcionaron muestras ciegas y luego se compararon con el total de coliformes y E. coli medidos por el sistema IDEXX Colilert. Dos conjuntos de datos no se correlacionaron exactamente entre sí, como se muestra en la Tabla 1; la muestra n.º 3 tenía una concentración de E. coli más alta que la muestra n.º 4 según el sistema IDEXX Colilert, mientras que nuestro dispositivo detectó la muestra n.º 4 con más éxito que la muestra n.º 3. Durante estos experimentos, se observó que todas las réplicas de la muestra #3, especialmente la réplica #3, dejaban numerosas partículas oscuras en el papel de las unidades de detección. Por lo tanto, sospechábamos que algunos contaminantes en la muestra #3 podrían haber inhibido las reacciones LAMP. Para verificar, filtramos las muestras n.° 3 y n.° 4 con filtros de fibra de vidrio Whatman de 0,7 µm para eliminar los materiales particulados al igual que las muestras n.° 1 y n.° 2 que se procesaron (es decir, se filtraron previamente). Luego, probamos las muestras filtradas, junto con las no filtradas para comparar; estos resultados se combinan en la Tabla 1 y algunas imágenes de las unidades de detección se muestran en la Fig. 5.

Fotografías de las unidades de detección para la muestra n.° 3 (a,b) recolectada en Pellicer Creek (P1, P2, P3 en tres réplicas de muestra) y la muestra n.° 4 (c y d) recolectada en Whitney Lab Docks (W1, W2, W3) y comparación entre muestras sin filtrar (fila superior) y filtradas (marcadas con f, fila inferior), junto con un control positivo (izquierda, en un tubo) y un control sin plantilla (derecha). Las imágenes en (a) y (c) se tomaron bajo la luz de la habitación, mientras que las imágenes en (b) y (d) se tomaron con una linterna LED azul con un filtro de plástico amarillo.

Para la muestra #3, tuvimos una tasa de éxito del 100 % para las muestras filtradas frente a una tasa de éxito del 50 % para las muestras sin filtrar. Estos resultados confirmaron que esas partículas filtradas de la muestra #3 inhibían las reacciones LAMP. Para la muestra #4, la tasa de éxito entre las muestras filtradas y sin filtrar es similar. La posible diferencia entre la muestra n.° 3 y la muestra n.° 4 es que la muestra n.° 3 se recolectó en Pellicer Creek, que está vinculado a áreas residenciales, mientras que la muestra n.° 4 se recolectó en Whitney Lab Docks, que está al lado del océano Atlántico. Como resultado, la filtración durante el muestreo, como se hizo con las muestras n.º 1 y n.º 2, debe emplearse para nuestro protocolo de prueba de dispositivos para eliminar este problema. También se debe tener en cuenta que la filtración no afectó la detección, como se ilustra en la muestra n.º 4, tanto filtrada como sin filtrar, con una tasa de éxito de prueba similar.

Para abordar la preocupación de los posibles efectos del agua del océano en el ensayo LAMP, realizamos experimentos con muestras de agua enriquecidas con varias concentraciones de sal y la misma cantidad de células de E. coli. La concentración de sal osciló entre 0 y 3,5%, correspondiente a agua dulce y agua de mar. Para cada concentración de sal, realizamos 5 experimentos repetidos. Para todas las concentraciones de sal, obtuvimos resultados positivos en 4 o 5 de 5 pruebas, como se resume en la Tabla 2. La Figura complementaria S5 muestra las imágenes de un resultado de prueba representativo. Estos resultados sugieren que la concentración de sal en o por debajo del nivel del agua del océano no tiene un efecto significativo ni en la preparación de la muestra ni en las reacciones LAMP. Tenga en cuenta que se produjeron tres resultados negativos en la Tabla 2 en los primeros dos experimentos cuando la mezcla no fue lo suficientemente completa antes de dividir y agregar células de E. coli en agua salada. Después de solucionar el problema, todas las réplicas se detectaron correctamente.

Nuestra plataforma con preparación de muestras y LAMP es sensible, como lo indica la detección consistente de E. coli en la muestra n.º 4 (réplica n.º 3), que contiene 20 CFU/100 ml medidos por el sistema IDEXX Colilert. Esto sugiere que el límite de cuantificación (LoQ) de nuestra plataforma es de al menos 0,2 CFU/mL, ya que usamos muestras de 1 mL. Por lo tanto, el LoQ de nuestra plataforma es al menos cinco veces menor que el límite de umbral sugerido por la EPA, que es de 100 CFU/100 mL7. Tenga en cuenta que el LoQ de nuestro ensayo LAMP fue de 3 copias usando muestras de agua enriquecidas con E. coli, como se muestra en la Fig. 4.

Hemos desarrollado una plataforma de prueba in situ para la detección de E. coli en muestras de agua ambiental. En comparación con la mayoría de los dispositivos en la literatura, una característica única de nuestra plataforma es su preparación de muestras, que consta de tres pasos simples: (1) rotar la unidad de tampón, (2) esperar a que los reactivos se mezclen y pasen por la almohadilla de papel, y (3) retirar la unidad de detección basada en papel para el paso de amplificación subsiguiente. La amplificación del ADN enriquecido se logra sumergiendo la unidad de detección dentro de una taza de café alimentada por batería que se mantiene a una temperatura constante. Los resultados de las pruebas se indican mediante cambios de color, que se pueden observar a simple vista o registrar con la cámara de un teléfono inteligente. Nuestra plataforma es fácil de usar, portátil para realizar pruebas in situ y con un límite de detección bajo. Además, esta plataforma se puede adaptar fácilmente para detectar otros patógenos simplemente modificando las secuencias de los cebadores en el ensayo LAMP.

La plataforma en este trabajo sigue conceptos de válvulas similares a los del VLEAD28 o VLEAD29 de 2 plex desarrollados anteriormente, pero con modificaciones significativas para la aplicación actual, como se resume en la Tabla 3. Las principales diferencias incluyen (1) el mecanismo de operación que se cambió de deslizamiento a la rotación, (2) el volumen y tipo de muestra procesada, (3) los patógenos objetivo y (4) los kits y volúmenes de reactivos utilizados para el proceso de preparación de muestras debido a los diferentes patógenos/muestras objetivo. Mientras que VLEAD se dirige a los virus de ARN y captura su ARN, el dispositivo de este trabajo se dirige a las bacterias de ADN y captura su ADN. Debido a la naturaleza de las muestras, el dispositivo de este trabajo requiere un volumen de muestra mucho mayor, ya que la E. coli presente en el agua recreativa está mucho menos concentrada que los virus en las muestras humanas. Esto también es parte de las razones por las que agregamos vacío opcional en este dispositivo para permitir un tiempo de resultado más rápido si cualquier mecanismo de succión (por ejemplo, jeringas) está disponible en el punto de prueba. Es previsible adaptar esta plataforma para estudios basados ​​en aguas residuales como los de estimación de prevalencia y transmisión del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en una comunidad42.

Nuestra plataforma de prueba portátil in situ es capaz de (1) detectar E. coli por debajo del límite de umbral de 100 CFU/100 ml utilizando NAAT, (2) integrar todos los pasos necesarios, incluida la preparación de la muestra, la amplificación del ADN y la detección en un plataforma única sin necesidad de equipos de laboratorio voluminosos o sofisticados, y (3) obtener los resultados en aproximadamente una hora. Los reactivos de nuestra plataforma se pueden preenvasar en la unidad tampón para su almacenamiento y transporte para las pruebas in situ, y las válvulas de bola no han mostrado fugas durante varias semanas cuando se usa cera para fijar la bola al depósito respectivo. La mezcla LAMP también puede precargarse en pipetas desechables y almacenarse con bolsas de hielo. Una alternativa al almacenamiento en frío es usar reactivos RT-LAMP liofilizados que se pueden almacenar a temperatura ambiente como se informó en otro lugar43,44. Por lo tanto, nuestra plataforma se puede utilizar en el campo, monitoreando la calidad del agua en el acto.

En comparación con otras plataformas portátiles para la detección de E. coli en muestras de agua, nuestra plataforma es una de las mejores en términos de tiempo de obtención de resultados, LoQ y simplicidad, que son 3 parámetros importantes para las plataformas de análisis in situ. La comparación de este trabajo con otras plataformas para la detección de E. coli en agua se muestra en la Tabla 4.

Una de las razones fundamentales del bajo LoQ de esta plataforma es el uso de un gran volumen de muestra de agua (1 ml). Este volumen de muestra se compara favorablemente con otras plataformas, especialmente aquellas basadas en microfluidos que pueden procesar solo unos pocos microlitros45,46. Incluso si un dispositivo puede detectar una sola célula, no es suficiente para detectar concentraciones inferiores a 100 CFU/100 mL (porque no hay ninguna célula en 1 µL de agua, a menos que se lleve a cabo primero un procedimiento de concentración). Además, nuestra plataforma ofrece mayor sensibilidad que los inmunoensayos en papel, que no son suficientes para detectar concentraciones por debajo de 100 CFU/100 ml, el límite de umbral recomendado por la EPA de EE. UU. El límite de detección de los inmunoensayos en papel es mayoritariamente superior a 50 UFC/mL47,48.

Otros enfoques, como los basados ​​en sustratos enzimáticos, ofrecen una alta sensibilidad y son capaces de procesar un gran volumen de muestra. Sin embargo, tienen tiempos de respuesta largos, entre 4 y 12 h de incubación, dependiendo de la concentración de las muestras10,11,12. Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos ofrecen un análisis rápido y una alta sensibilidad. Lin et al. desarrolló una membrana asimétrica para procesar muestras de agua de hasta 10 mL, combinándola con LAMP digital en los microporos de la membrana capaz de detectar E. coli tan bajo como 0,3 células/mL en 1 h25. Sin embargo, requiere equipo de laboratorio para su amplificación y detección, incluido un microscopio de fluorescencia25.

Los datos utilizados durante el estudio actual se pondrán a disposición del autor correspondiente a petición razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Florida a través de la Iniciativa Moonshot y parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01AI155735). Agradecemos a David Kaplan, Thomas Bianchi, Peter Ifju y al resto del grupo iCoast por su colaboración y ayuda.

Grupo Interdisciplinario de Microsistemas, Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Universidad de Florida, PO Box 116250, Gainesville, FL, 32611, EE. UU.

Charles Apples, Mortise Alipanah, George Adedokun y Z. Hugh Fan

Departamento de Ciencias de Ingeniería Ambiental, Universidad de Florida, PO Box 116580, Gainesville, FL, 32611, EE. UU.

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Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Universidad de Florida, PO Box 100266, Gainesville, FL, 32610, EE. UU.

Young S. Kim y Shouguang Jin

Laboratorio Whitney de Biociencia Marina, Universidad de Florida, PO Box 116580, St. Augustine, FL, 32080, EE. UU.

Todd Z. Osborne

Departamento de Ciencias del Suelo, Agua y Ecosistemas, Universidad de Florida, PO Box 110290, Gainesville, FL, 32611, EE. UU.

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J. Crayton Pruitt Family Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Florida, PO Box 116131, Gainesville, FL, 32611, EE. UU.

Fanático de Z. Hugh

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CM realizó la investigación, desarrolló los métodos, seleccionó los datos, creó las figuras y redactó el documento. MA y GA ayudó a realizar la investigación. YSK y SJ prepararon muestras de bacterias y midieron la concentración de ADN. EM proporcionó las muestras, desarrolló los métodos y proporcionó los recursos. TZO adquirió fondos, proporcionó las muestras, proporcionó recursos y supervisó el trabajo. ZHF desarrolló el concepto, obtuvo financiación, desarrolló los métodos, proporcionó recursos, supervisó el trabajo y redactó el documento. Todos los autores han revisado y aprobado el manuscrito final para su publicación.

Correspondencia a Elise Morrison, Todd Z. Osborne o Z. Hugh Fan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Manzanas, C., Morrison, E., Kim, YS et al. Dispositivos de prueba molecular para la detección in situ de E. coli en muestras de agua. Informe científico 13, 4245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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Recibido: 09 Diciembre 2022

Aceptado: 08 de marzo de 2023

Publicado: 14 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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