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May 22, 2023

Activación de la urotensina

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 511 (2023) Citar este artículo

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Remdesivir es un medicamento antiviral utilizado para el tratamiento de COVID-19 en todo el mundo. Se han asociado efectos secundarios cardiovasculares con remdesivir; sin embargo, el mecanismo molecular subyacente sigue siendo desconocido. Aquí, realizamos un examen de detección de receptores acoplados a proteína G a gran escala en combinación con modelos estructurales y descubrimos que remdesivir es un agonista parcial selectivo para el receptor de urotensina-II (UTS2R) a través del eje AKT/ERK dependiente de Gαi/o. Funcionalmente, el tratamiento con remdesivir indujo un potencial de campo prolongado y APD90 en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas y una contractilidad alterada en cardiomiocitos tanto neonatales como adultos, todo lo cual refleja la patología clínica. Es importante destacar que las disfunciones cardíacas mediadas por remdesivir se atenuaron de manera efectiva al antagonizar la señalización de UTS2R. Finalmente, caracterizamos el efecto de 110 variantes de un solo nucleótido en el gen UTS2R informado en la base de datos del genoma y encontramos cuatro variantes sin sentido que muestran efectos de ganancia de función en la sensibilidad del receptor a remdesivir. En conjunto, nuestro estudio ilumina un mecanismo previamente desconocido que subyace a los eventos cardiovasculares relacionados con remdesivir y que las variaciones genéticas del gen UTS2R pueden ser un factor de riesgo potencial de eventos cardiovasculares durante el tratamiento con remdesivir, lo que en conjunto allana el camino para una oportunidad terapéutica para prevenir tales eventos en el futuro.

Los análogos de nucleósidos tienen una larga historia en el campo del diseño de fármacos para el tratamiento antiviral porque los nucleósidos se utilizan como componentes básicos para la síntesis de ADN y ARN durante la replicación viral1. El mecanismo principal de las actividades antivirales de los análogos de nucleósidos se atribuye a la inhibición de la ARN polimerasa viral dependiente de ARN2. En respuesta a la pandemia mundial de COVID-19, se han desarrollado varios análogos de nucleósidos, como remdesivir, molnupiravir y favipiravir, para tratar la enfermedad.

Remdesivir (GS-5734; Veklury) es un análogo de adenosina modificado que contiene un resto de profármaco de McGuigan, que incluye fenol y éster etílico de l-alanina, que aumenta su lipofilicidad y permeabilidad celular3. Después de la administración intravenosa, remdesivir se convierte rápidamente en la forma de mononucleósido (GS-441524) y es metabolizado intracelularmente por múltiples enzimas del huésped a su forma de trifosfato farmacológicamente activa, que, a su vez, actúa como un inhibidor potente y selectivo del ARN- ARN polimerasa dependiente de múltiples virus4,5. Remdesivir se usó inicialmente para el tratamiento del virus del Ébola6 y se aprobó para el tratamiento de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) en medio de la pandemia mundial. Remdesivir acortó el tiempo de recuperación en adultos que fueron hospitalizados con COVID-19 y tenían evidencia de infección del tracto respiratorio inferior7. Datos más recientes demostraron una reducción significativa en las hospitalizaciones con un curso de 3 días de remdesivir8 por vía intravenosa. Aunque el remdesivir generalmente es bien tolerado por la mayoría de las personas, se han informado eventos adversos comunes para el remdesivir, que incluyen sarpullido, dolor de cabeza, náuseas, diarrea y transaminasas elevadas7. Las pautas actuales para remdesivir sugieren un control cuidadoso de la función hepática durante el tratamiento y desaconsejan su uso en pacientes con disfunción renal9. Además, se han informado eventos cardiovasculares, que incluyen hipotensión, bradicardia, prolongación del intervalo QT y anormalidad de la onda T10,11,12,13. Cuando se administra por vía intravenosa, remdesivir muestra una amplia distribución tisular, incluido el corazón14, pero el mecanismo molecular preciso que subyace a los efectos secundarios cardiovasculares de remdesivir sigue sin estar claro.

Molnupiravir (EIDD-2801/MK-4482; Lagevrio) ha sido autorizado para uso de emergencia por la FDA bajo una Autorización de uso de emergencia para el tratamiento de COVID-19 de leve a moderado en adultos que tienen un alto riesgo de progresión a grave. COVID-19. Molnupiravir es un análogo de citosina oral que contiene un profármaco de éster isopropílico de la β-d-N4-hidroxicitidina (NHC). La forma activa de NHC es un sustrato de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral y perjudica la fidelidad de la replicación del SARS-CoV-2, provocando una catástrofe de errores15. Un ensayo clínico en adultos no hospitalizados mostró que el tratamiento temprano con molnupiravir redujo efectivamente el riesgo de hospitalización o muerte en adultos en riesgo no vacunados con COVID-1916. Además de molnupiravir, favipiravir (T-705; Avigan), que es un fármaco contra la influenza, se ha sometido a ensayos clínicos para el tratamiento de la COVID-19. Favipiravir sa análogo de nucleobase derivado de pirazina carboxamida (6-fluoro-3-hidroxi-2-pirazinacarboxamida)17. Los modos de acción sugeridos de favipiravir comprenden una combinación de eventos de terminación de cadena y mutadores18. Se informaron varios eventos adversos durante el uso de molnupiravir y favipiravir, que incluyen diarrea, mareos y náuseas para molnupiravir19 e hiperuricemia y aumento de la alanina aminotransferasa para favipiravir20. Es importante destacar que, a diferencia de remdesivir, no se han informado efectos secundarios cardiovasculares con el uso de molnupiravir o favipiravir.

Además de su función como bloques de construcción para la síntesis de ADN/ARN, los nucleótidos/nucleósidos pueden actuar como ligandos endógenos para los receptores acoplados a proteína G (GPCR) e inducir diversas respuestas fisiopatológicas21,22,23,24,25. Dada la presencia de estructuras que imitan a los nucleósidos en remdesivir, molnupiravir y favipiravir, planteamos la hipótesis de que estos fármacos podrían causar efectos secundarios al activar directamente el GPCR. Aquí, informamos que remdesivir, pero no molnupiravir y favipiravir, es un ligando selectivo para el receptor de urotensina-II (UTS2R) y causa disfunción cardíaca.

Examinamos fármacos anti-COVID-19, incluidos remdesivir, molnupiravir y favipiravir, frente a 348 GPCR mediante un ensayo de eliminación del factor de crecimiento transformante α marcado con fosfatasa alcalina (AP-TGFα)26. Usamos proteínas de la subunidad Gα quimérica para la detección inicial para detectar de manera eficiente la activación del receptor independientemente del tipo de subunidad Gα involucrada26. Entre los tres fármacos, descubrimos que remdesivir es un activador selectivo del receptor de urotensina-II (UTS2R) (Fig. 1a, Fig. 1a complementaria, Datos complementarios 1). Dado que remdesivir indujo de manera potente la respuesta UTS2R sin ninguna proteína Gα quimérica, el análisis UTS2R posterior se realizó sin la adición exógena de la proteína Gα quimérica. Un análisis de concentración-respuesta reveló que la mitad de la concentración efectiva máxima (pCE50) de remdesivir fue de 4,89 ± 0,03 (CE50 = 13 ± 0,9 μM, Fig. 1b izquierda). Cabe señalar que tanto la potencia como la eficacia de remdesivir (Emax = 47 ± 1,4 % de liberación de AP-TGFα) frente a UTS2R son inferiores a las del ligando peptídico endógeno urotensina-II (UT2, pEC50 = 10,72 ± 0,04; EC50 = 21 ± 2,1 fM, Emax = 59 ± 0,70 %AP-TGFα liberado, Fig. 1b derecha). Sin embargo, se considera que la administración de remdesivir a una dosis clínica está dentro del rango de trabajo de los efectos agonistas porque la concentración plasmática máxima de remdesivir alcanza 9,03 μM después de la inyección intravenosa en adultos sanos27. Curiosamente, a diferencia de UT2, remdesivir no logró inducir una respuesta de reclutamiento de β-arrestina (Fig. 1c, Fig. 1b complementaria).

a Estructuras químicas de los compuestos probados y mapas de calor que muestran los niveles relativos de activación de GPCR medidos por el ensayo de desprendimiento de TGFα. La escala de colores representa el % de activación de GPCR en comparación con la activación del receptor mediada por TPA (13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol), que induce la respuesta máxima de desprendimiento de TGFα independientemente de GPCR. La celda amarilla representa la activación de UTS2R por remdesivir. Las concentraciones de los compuestos probados fueron 10 μM para remdesivir, molnupiravir, GS-441524 y sofosbuvir, y 100 μM para favipiravir (n = 3). b Curvas de respuesta de desprendimiento de TGFα para UTS2R por remdesivir (izquierda) y urotensina-II (UT2, derecha) en presencia o ausencia de urantide, un antagonista de UTS2R (Los datos se muestran como medias ± SEM, n = 3). La mitad de la concentración efectiva máxima (pEC50) de remdesivir fue de 4,89 ± 0,03 (EC50 = 13 μM, Emax = 47 ± 1,4 % de liberación de AP-TGFα). La mitad de la concentración efectiva máxima (pCE50) de UT2 fue de 10,72 ± 0,04 (CE50 = 21 fM, Emax = 59 ± 0,70 % de liberación de AP-TGFα). c Ensayo de reclutamiento de β-arrestina 1 mediado por remdesivir (izquierda) o urotensina-II (UT2, derecha) para UTS2R. Los datos se muestran como medias ± SEM (n = 3). d, e Ensayo de unión competitiva utilizando el péptido biotina-UT2. La fracción de membrana de las células HEK293 que expresaban FLAG-UTS2R (entrada) se incubó con biotina-UT2 en presencia o ausencia de remdesivir o urantida. FLAG-UTS2R fue derribado por microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina (M280), y FLAG-UTS2R fue detectado por western blot. d Se mostró una imagen representativa de tres ensayos independientes. e Densitometría de banda. ***p < 0,001 y **p < 0,01 frente al grupo vehículo + UT2 10 µM (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett); significa ± SEM.

Para evaluar si remdesivir puede interactuar directamente con UTS2R, realizamos un ensayo de unión competitiva. Un estudio anterior ha demostrado que un péptido UT2 sintético con una etiqueta de biotina N-terminal (biotina-UT2) puede formar una unión estable con UTS2R28. Es importante destacar que la unión fue lo suficientemente estable para la extracción bioquímica de UTS2R utilizando resina de estreptavidina. Aprovechando la propiedad única del péptido biotina-UT2, realizamos un ensayo desplegable utilizando una fracción de membrana de células HEK293 que expresan UTS2R en presencia o ausencia de remdesivir (Fig. 1c complementaria). Entre varios tipos de perlas magnéticas que probamos, las perlas magnéticas con recubrimiento hidrofóbico mostraron la máxima eficacia de extracción con baja unión no específica (Fig. 1d complementaria). Usando el protocolo optimizado, encontramos que remdesivir y uranide afectaron significativamente el pulldown de UTS2R mediado por biotina-UT2 (Fig. 1d, e, Fig. 1e complementaria). Estos resultados sugieren que remdesivir puede interactuar directamente con UTS2R, interfiriendo así en la unión biotina-UT2-UTS2R.

Investigamos más a fondo si los metabolitos de remdesivir activan UTS2R. GS-441524 y GS-704277, los metabolitos principal y secundario de remdesivir6,27, respectivamente, no mostraron ningún efecto sobre la activación de UTS2R (Fig. 1a, Fig. 1a complementaria). Para investigar si la fracción del profármaco de McGuigan es responsable de la activación de UTS2R de remdesivir, probamos sofosbuvir (GS-7977), un profármaco de clase McGuigan3 aprobado por la FDA, contra UTS2R. Sin embargo, sofosbuvir no activó UTS2R (Fig. 1a, Fig. 1a complementaria). Estos resultados sugieren que se requieren tanto el resto de profármaco de McGuigan como la base de nucleósido de remdesivir para activar el receptor.

UTS2R pertenece a la familia de GPCR de clase A29 y consta de 7 hélices transmembrana (TM) canónicas, la hélice anfipática 8 en el extremo C-terminal (H8), dos hebras β antiparalelas en el bucle extracelular 2, un N-terminal relativamente corto dominio con dos sitios de N-glicosilación y un ancla de palmitoilación en la cola C-terminal (Fig. 2a superior). Mientras tanto, remdesivir es un análogo de la adenosina y un profármaco de fosforamidato de la clase McGuigan (fenol y l-alanina etilbutil éster), que enmascara el resto de fosfato aniónico en remdesivir, mejorando así la administración del fármaco. Para dilucidar aún más la base molecular de la unión del ligando al receptor, realizamos un acoplamiento estructural in silico de UTS2R en presencia de remdesivir (Fig. 2a inferior). Nuestro análisis mostró múltiples residuos de aminoácidos en el bolsillo ortostérico que potencialmente estabilizan la unión a remdesivir. Primero, el grupo ciano del nucleoazúcar de remdesivir forma un enlace de hidrógeno con el residuo UTS2R T3047.42×41 (los superíndices indican el sistema de numeración genérico GPCR30). En segundo lugar, el grupo fenilo del resto profármaco de McGuigan de remdesivir está rematado con N2977.35×34. Finalmente, el grupo amino de la nucleobase de remdesivir forma un enlace de hidrógeno con M1343.36 en la parte inferior del bolsillo (NH···S enlace de hidrógeno31).

un Panel superior, Esquema de UTS2R; Panel inferior, modelo de acoplamiento de UTS2R con remdesivir. La estructura AlphaFold del UTS2R humano se muestra como cintas verdes, omitiendo TM5 para mayor claridad. Remdesivir y las cadenas laterales seleccionadas del receptor se muestran como barras y de color gris y verde, respectivamente. Las líneas discontinuas negras indican enlaces de hidrógeno. b, c Efectos de las mutaciones indicadas sobre la activación del receptor mediada por remdesivir (b) o UT2 (c). El eje y (valor ⊿pEC50) representa la potencia de activación relativa de cada receptor mutante en comparación con el receptor WT. ⊿valor pEC50 = pEC50 mutante − pEC50 WT. El valor de corte de ⊿pEC50 se estableció en −1, como se indica mediante líneas discontinuas. Los valores de EC50 se determinaron mediante el ensayo de desprendimiento de TGFα. **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a WT mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Los datos se muestran como medias ± SEM (n ≥ 3).

Para validar el modelo de acoplamiento, mutamos estos residuos de UTS2R (T3047.42 × 41, N2977.35 × 34 y M1343.36) a otros aminoácidos y probamos si estas mutaciones afectan la activación de UTS2R mediada por remdesivir (Fig. 2b, c , Figura complementaria 2a, b). De acuerdo con la simulación in silico, la mutación de los tres residuos eliminó casi por completo la potencia de activación de remdesivir a UTS2R, lo que indica que remdesivir necesita ponerse en contacto con UTS2R en múltiples residuos para lograr una unión estable. Tanto el resto de nucleósido como el de McGuigan son esenciales para la unión del receptor, con N2977.35x34 interactuando con el resto de McGuigan y M1343.36 y T3047.42x41 interactuando con el resto de nucleósido. Esta observación estructural explica por qué la mutación de un solo aminoácido reduce notablemente la actividad de remdesivir hacia UTS2R. Esta explicación está respaldada por el resultado de que UTS2R no responde a ningún metabolito de remdesivir, del cual se elimina metabólicamente el resto de McGuigan. Por el contrario, estas mutaciones solo redujeron parcialmente la activación de UTS2R mediada por UT2. Mientras tanto, al contrario de estos tres residuos, encontramos que D1303.32 tiene un efecto inhibidor sobre la unión de remdesivir-UTS2R. La mutación D1303.32N eliminó la activación de UTS2R mediada por UT2 pero aumentó significativamente la activación del receptor mediada por remdesivir (Fig. 2b, c, Fig. 2a, b complementaria). De acuerdo con el modelo de acoplamiento, el residuo D1303.32 se localiza cerca del resto de nucleobase de remdesivir (Fig. 2a). Especulamos que la carga negativa del residuo D1303.32 puede inducir un efecto de repulsión de electrones32, lo que lleva a la desestabilización de la interacción entre el residuo D1303.32 y la nucleobase. Estos resultados demuestran que la activación de UTS2R mediada por remdesivir está mediada por la unión específica entre UTS2R y su resto de profármaco de McGuigan y su base de nucleósido, que difiere de la de UTS2R y el ligando endógeno.

Para determinar si la activación de UTS2R mediada por remdesivir induce la transducción de señalización intracelular, estimulamos las células HEK293 que expresan UTS2R con remdesivir y examinamos el estado de fosforilación de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2. La aplicación de remdesivir durante hasta 72 h evocó una fosforilación de ERK1/2 de larga duración y dependiente de la dosis (Fig. 3a, Fig. 3a complementaria). Es importante destacar que la fosforilación de ERK mediada por remdesivir fue abolida por el antagonista de UTS2R (Fig. 3a, Fig. 3a complementaria). La respuesta de ERK1/2 inducida por remdesivir fue similar a la inducida por UT2 (Fig. 3b complementaria).

Se estimularon células HEK293 privadas de suero que sobreexpresaban UTS2R con las concentraciones indicadas de remdesivir durante 5 min con o sin urantida, un antagonista de UTS2R, y los lisados ​​se sometieron a análisis de transferencia Western. Las relaciones de activación de ERK1 y ERK2 (pERK1/ERK1 y pERK2/ERK2) se calcularon con datos normalizados para el vehículo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 según la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se representan como medios ± SEM (n = 3). b Izquierda, correlación temporal entre la duración del potencial de campo y el intervalo QT en el ECG de superficie. Derecha, esquema de la plataforma de matriz de electrodos múltiples (MEA). c Forma de onda de potencial de campo representativa en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM) tratados con remdesivir 1 µM en presencia o ausencia de urantida durante 72 h. d Efecto de remdesivir y urantide en la prolongación del potencial de campo en hiPSC-CM. *p < 0,05, **p < 0,01 por ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Šídák. Los datos se representan como medios ± SEM (n = 3). e Pinza de parche perforada para registrar potenciales de acción espontáneos de hiPS-CM en modelos de pinza de corriente. Los hiPSC-CM se trataron con remdesivir 10 µM en presencia o ausencia de urantida 50 µM durante 72 h. *p < 0,05 y **p < 0,01 por la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se representan como medias ± SEM (n ≥ 3).

UT2 y su receptor UTS2R se expresan ampliamente en los tejidos, con una expresión relativamente alta en los sistemas cardiovasculares33 (Fig. 3c, d complementarias). Impulsados ​​por el potencial cardiotóxico de remdesivir10,11,12,13, evaluamos el impacto de remdesivir en las funciones de los cardiomiocitos. Examinamos el efecto de remdesivir en el potencial de campo (FP) utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM)34, en los que el nivel de expresión de UTS2R es comparable al del corazón humano (Fig. 3e complementaria ). La duración de la FP (FPD) se correlaciona estrechamente con el intervalo QT en un electrocardiograma (ECG)35 (Fig. 3b izquierda). En particular, la prolongación del intervalo QT se ha relacionado con la aparición de arritmias graves y potencialmente mortales, y la prolongación del intervalo QT es la principal causa de toxicidad cardiovascular inducida por fármacos36. Para la evaluación de la FPD, el uso de una plataforma de matriz de electrodos múltiples (MEA) es bien aceptado por su capacidad para monitorear la electrofisiología de los cardiomiocitos a nivel de población celular (Fig. 3b derecha)35. Un análisis MEA reveló que los hiPSC-CM tratados con remdesivir mostraron una FPD prolongada de 1,32 ± 1,38 % a las 24 h, 5,60 ± 1,60 % a las 48 h y 15,57 ± 3,49 % a las 72 h, respectivamente. En particular, la prolongación fue suprimida significativamente por el antagonista de UTS2R (Fig. 3c, d). De hecho, la aplicación del antagonista de UTS2R con remdesivir casi no mostró retraso en la FPD a las 24 h (−1,71 ± 1,60 %) y 48 h (−0,61 ± 0,11 %), mientras que el efecto de reversión seguía siendo significativo pero se volvió parcial a las 72 h (Fig. .3d).

Además de la FPD, evaluamos la prolongación del intervalo QT mediante un parche perforado y registramos los potenciales de acción espontáneos de hiPS-CM. Medimos el APD90 (duración del potencial de acción al 90% de repolarización). Remdesivir prolongó significativamente el APD90 en hiPS-CM, y esta prolongación se atenuó notablemente con la administración de urantide (Fig. 3e). Por lo tanto, estos resultados aclaran un mecanismo previamente desconocido de los riesgos proarrítmicos informados de remdesivir11,12,13, que depende al menos parcialmente de UTS2R. A continuación, evaluamos los efectos de remdesivir sobre la contractilidad cardíaca. Con este fin, utilizamos cardiomiocitos de rata neonatal (NRCM) y evaluamos la fuerza de contracción. Bajo un protocolo de estimulación constante, los NRCM con tratamiento crónico con remdesivir mostraron contractilidad reducida, que fue atenuada significativamente por el antagonista de UTS2R (Fig. 4a).

a, b Izquierda, forma de onda representativa de la contractilidad bajo estimulación en cardiomiocitos de rata neonatal (NRCM) por remdesivir 1 µM con o sin urantida o toxina b pertussis (PTX), un inhibidor de Gαi/o, y YM-254890, un Gαq/11 inhibidor, a las 48 h. A la derecha, el efecto de remdesivir con aurantide o b PTX y YM-254890 sobre la contractilidad bajo estimulación en NRCM. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 según la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se representan como medios ± SEM (n = 3). c, d Western blot representativo para la fosforilación de c ERK1/2 yd proteína quinasa B (AKT). Las células HEK293 privadas de suero que sobreexpresan UTS2R se estimularon con las concentraciones indicadas de remdesivir durante 48 h. Para la inhibición de la proteína Gi/o, las células se incubaron con PTX durante al menos 18 horas a 150 ng/mL. Las relaciones de activación de ERK1, ERK2 y AKT se calcularon con datos normalizados para el vehículo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 según la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se muestran como medias ± SEM (n = 3). e, f Los efectos de remdesivir en la contractilidad de los cardiomiocitos de ratones adultos. Se trataron cardiomiocitos de ratones adultos aislados con remdesivir (10 µM) durante 30 min, y se midió el cambio de percentil en el área celular (e) y la proporción de acortamiento de cardiomiocitos (f) durante la estimulación eléctrica. ****p < 0,001 por prueba t no pareada. Los datos se muestran como medias ± SEM (un total de 54 células de 3 ratones).

Las proteínas G heterotriméricas, incluidas Gαs, Gαi/o, Gαq/11 y Gα12/13, son los efectores aguas abajo de los GPCR. Entre ellos, la familia Gαi/o se ha implicado en la contractilidad miocárdica y la frecuencia cardíaca a través de la modulación de los canales iónicos37. Dado que UTS2R está acoplado a Gαi / o y Gαq29, buscamos determinar qué proteína Gα está involucrada en la disminución de la contracción miocárdica mediada por remdesivir. El inhibidor de la toxina pertussis (PTX) de Gαi/o, pero no el inhibidor de Gαq/11 YM-254890, bloqueó por completo el efecto de remdesivir y restauró las contracciones máximas de los NRCM (Fig. 4b). Un estudio anterior demostró cómo la activación de Gαi/o en NRCM conduce a la liberación de Gβγ, que activa intracelularmente PI3K, lo que conduce a la activación de AKT y ERK1/238. De acuerdo con esta observación, la inhibición de Gαi/o redujo la fosforilación inducida por remdesivir de ERK1/2 y AKT (Fig. 4c, d). Estos resultados sugieren que remdesivir reduce la contractilidad de los cardiomiocitos a través de la vía de transducción de señales AKT/ERK dependiente de Gαi/o. Colectivamente, nuestros resultados indican que remdesivir en sí mismo puede funcionar como un ligando exógeno de UTS2R. Además, identificamos el potencial proarrítmico e inotrópico negativo de remdesivir, ambos dependientes de UTS2R.

Debido a que los cardiomiocitos neonatales no se diferencian terminalmente, investigamos más a fondo el efecto de remdesivir en los cardiomiocitos maduros aislados de corazones de ratones adultos (Fig. 3f complementaria). La contracción de los cardiomiocitos se registró en condiciones de marcapasos y el grado de contracción se evaluó mediante análisis morfológico. De manera similar a los cardiomiocitos neonatales, remdesivir perjudicó significativamente la contracción de los cardiomiocitos adultos (Fig. 4e, f).

Un estudio anterior sugirió que la cardiotoxicidad relacionada con remdesivir puede ser causada por una disfunción mitocondrial39, ya que la forma activa de remdesivir muestra un efecto inhibidor de la ARN polimerasa mitocondrial (mtRNAP) en dosis altas40. Sin embargo, el tratamiento con remdesivir a 10 μM, que es equivalente a la concentración plasmática máxima luego de la administración de remdesivir en humanos27, no afectó los niveles de estado estacionario de las proteínas del complejo respiratorio mitocondrial (Fig. 3g, h complementarias).

Para comprender el impacto de la variación genética en la susceptibilidad a la señalización de remdesivir-UTS2R en humanos, extrajimos información de la variante de un solo nucleótido (SNV) de una base de datos del genoma que incluye el Panel de referencia del genoma 14KJPN, que es un estudio genómico basado en la población a gran escala. base de datos construida a partir de la secuencia de ADN de 14.000 individuos japoneses41, seguida de un ensayo funcional sobre la activación del receptor. Se informa un total de 2178 variantes en el locus UTS2R, de las cuales 139 variantes son variantes sin sentido (Datos complementarios 2). Un número considerable de SNV sin sentido enumerados en 14KJPN también se informan en la base de datos gnomAD (https://gnomad.broadinstitute.org), que contiene SNV de etnias más amplias.

En consecuencia, generamos 110 mutantes sin sentido correspondientes a los SNV humanos en el gen UTS2R. Excluimos 29 mutaciones sin sentido en la región 5′ de UTS2R ya que la puntuación de confianza para la predicción estructural del extremo N era relativamente baja. Entre los 110 SNV sin sentido, 44 ​​SNV mostraron una disminución en la sensibilidad a remdesivir en comparación con el receptor WT (⊿pEC50 <−0.3, lo que corresponde a un aumento de EC50 de más del doble en comparación con el receptor WT; Fig. 5a panel superior). Mientras tanto, 47 SNV mostraron una menor sensibilidad a UT2 en comparación con el receptor WT, de los cuales 18 SNV se superpusieron con aquellos que mostraron una menor sensibilidad a remdesivir (Fig. 5a panel inferior, Fig. 4a complementaria). En particular, encontramos cuatro SNV sin sentido (G681.49C, D1303.32G, V15934.54M y A249ICL3G) que pueden aumentar la sensibilidad del receptor hacia remdesivir en comparación con el receptor WT (⊿pEC50> 0,3, lo que corresponde a un <0,5 veces Disminución de EC50 en comparación con el receptor WT (Fig. 5a-c). Además, entre estos cuatro SNV UTS2R sensibles a remdesivir con ganancia de función, los mutantes G681.48C y D1303.32G exhibieron una disminución en la sensibilidad hacia UT2, mientras que los mutantes V15934.54M y A249ICL3 mostraron un aumento moderado o insignificante en Sensibilidad UT2 (⊿pEC50 <0,3; Fig. 5c, Fig. 4a complementaria). En conjunto, los resultados sugieren que las personas con una mutación G681.49C, D1303.32G, V15934.54M o A249ICL3G en el gen UTS2R son sensibles a remdesivir, lo que posiblemente las haga más susceptibles a la cardiotoxicidad mediada por UTS2R, aunque las frecuencias alélicas de la las variantes de ganancia de función son bajas (Fig. 4b complementaria).

a Efectos de 110 SNV sin sentido del gen UTS2R en (panel superior) la activación del receptor mediada por remdesivir y (panel inferior) mediada por UT2, medidos por el ensayo de desprendimiento de TGFα. El eje y (valor ⊿pEC50) representa la potencia de activación relativa de cada receptor mutante en comparación con el receptor WT. El valor de corte de ⊿pEC50 se estableció en −1, como se indica mediante líneas discontinuas. Las bandas de color azul claro representan el rango de −0,3 < ⊿pEC50 < 0,3, que corresponde al rango de un cambio de 0,5 a 2 veces (menos de 2 veces) en la EC50 del receptor mutante en comparación con el receptor WT. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresan como medias. b Diagrama de diagrama de serpiente de UTS2R que muestra las ubicaciones de las mutaciones y sus efectos sobre la potencia de remdesivir (modificado de www.gpcrdb.org). c Efectos de las mutaciones seleccionadas en la activación del receptor mediada por remdesivir (izquierda) y mediada por UT2 (derecha). Los valores de EC50 se determinan mediante el ensayo de desprendimiento de TGFα. "ns" p > 0,05 y ****p < 0,0001 frente a WT mediante ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett. Los datos se muestran como medias ± SEM (n ≥ 3).

Tras la finalización del Ensayo de tratamiento adaptativo para la COVID-19 1 (ACTT-1)7, que demostró la superioridad de remdesivir sobre el placebo para mejorar el tiempo de recuperación en pacientes hospitalizados con COVID-19, remdesivir ha sido uno de los medicamentos recetados con mayor frecuencia para pacientes hospitalizados. para la infección por COVID-19. Es importante destacar que los investigadores de ACTT-1 informaron que el 0,2 % de los pacientes que recibieron remdesivir, pero no los pacientes que recibieron placebo, mostraron arritmias (aparte de fibrilación auricular, taquicardia supraventricular, taquicardia ventricular y fibrilación ventricular), aunque estos efectos cardiovasculares no se consideraron adversos. efectos Sin embargo, el porcentaje de pacientes que experimentan arritmias podría estar subestimado ya que los primeros ensayos clínicos no tienen el poder estadístico suficiente para detectar eventos adversos poco comunes42. De hecho, un gran estudio de cohorte retrospectivo de farmacovigilancia, que utilizó registros médicos de más de 130 países y 20 millones de pacientes, informó que el paro cardíaco, la bradicardia y la hipotensión están asociados con el uso de remdesivir10. La elevación de la concentración plasmática de remdesivir se asocia con un aumento en la duración de la FP con amplitudes máximas de Na+ disminuidas y frecuencias de latidos espontáneos, lo que podría inducir potencialmente un intervalo QT prolongado y torsade de point43,44. Es importante destacar que los efectos adversos cardíacos parecen ser causados ​​directamente por remdesivir, ya que se informó que se resolvieron dentro de las 24 a 48 horas posteriores a la interrupción de remdesivir45,46. Hasta la fecha, el mecanismo preciso subyacente a los efectos secundarios cardíacos del remdesivir sigue sin estar claro, sin forma de predecir las poblaciones susceptibles a sus efectos secundarios cardíacos y sin un tratamiento específico para la cardiotoxicidad. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de comprender cómo remdesivir induce la disfunción cardíaca.

Usando una estrategia de detección de GPCR imparcial y a gran escala, identificamos que remdesivir, pero no molnupiravir y favipiravir, puede activar selectivamente UTS2R. La interacción entre remdesivir y UTS2R fue respaldada aún más por el ensayo de unión competitiva que utiliza el péptido biotina-UT2. Curiosamente, UTS2R se expresa en gran medida en el tejido cardíaco, incluidos los cardiomiocitos. La activación de UTS2R por Urotensina-II (UT2), el ligando endógeno de UTS2R, se ha implicado en la disfunción cardíaca. Por ejemplo, el nivel plasmático de UT2 y el nivel de expresión de UTS2R en cardiomiocitos están elevados en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva en etapa terminal47. De acuerdo con estos estudios previos, encontramos que la activación de UTS2R por remdesivir a una concentración de 1 μM indujo anormalidades eléctricas y deterioro de la fuerza de contracción en cardiomiocitos cultivados, los cuales se asemejan a los efectos secundarios cardíacos informados en humanos. Además, estos efectos adversos se bloquearon eficazmente al antagonizar UTS2R o al inhibir su señalización aguas abajo. Clínicamente, remdesivir se administra por vía intravenosa a una dosis de 200 mg una vez, seguida de 100 mg al día durante un total de 5 a 10 días en adultos y niños ≥40 kg. La concentración plasmática máxima estimada de remdesivir es de 9,03 μM en adultos sanos y puede ser mayor en pacientes con insuficiencia renal o hepática debido a su excreción renal y biliar48. Nuestros resultados sugieren que la dosis clínica de remdesivir es suficiente para activar UTS2R, y los pacientes con insuficiencia renal o hepática pueden tener un alto riesgo de eventos adversos mediados por el eje remdesivir-UTS2R. En particular, nuestro ensayo GPCR mostró claramente que remdesivir no tiene efecto sobre los receptores de adenosina, cuya activación también puede afectar las funciones cardíacas. Por lo tanto, la activación de UTS2R probablemente sea responsable de los efectos secundarios cardíacos.

Un hallazgo importante de este estudio es que las SNV en la región de codificación de UTS2R tienen un gran impacto en su respuesta al remdesivir. Este resultado está en línea con estudios previos que muestran que las SNV en los genes GPCR están asociadas con la fisiopatología de diversas enfermedades, incluidas las enfermedades CV, y afectan los resultados terapéuticos49. Mientras que el 40 % de las SNV en UTS2R (44/110) mostró al menos una reducción del doble en la potencia hacia remdesivir en comparación con el receptor WT, y el 56 % (62/110) no mostró cambios notables (dentro del rango de 0,5 veces a cambio de 2 veces), identificamos cuatro SNV de ganancia de función que mostraron un aumento de más del doble en respuesta a remdesivir. En particular, D1303.32G era una variante en el mismo aminoácido para el que identificamos una mutación de ganancia de función (D1303.32N) utilizando modelos in silico, lo que indica la importancia del residuo D1303.32 en el reconocimiento de remdesivir.

La activación de GPCR a menudo induce el reclutamiento de β-arrestina en el receptor, seguido de la internalización del receptor en el compartimento intracelular. Esta internalización finaliza la activación de GPCR y promueve vías de señalización secundarias50. Curiosamente, a diferencia del ligando endógeno UT2, que induce efectivamente el reclutamiento de β-arrestina (Fig. 1c)51, la activación de UTS2R mediada por remdesivir no indujo el reclutamiento de β-arrestina. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que remdesivir es un ligando sesgado por proteína G (Fig. 1c, Fig. 1b complementaria). Tal activación sesgada de UTS2R por remdesivir puede tener un impacto importante en la función cardíaca de una manera que permite la activación prolongada de UTS2R sin el cierre mediado por β-arrestina y, por lo tanto, una exageración de la señalización posterior y efectos cardiotóxicos mejorados. Sin embargo, también es concebible que la potencia modesta de remdesivir podría haber dificultado la detección de la respuesta de β-arrestina. Se necesitan más estudios que utilicen una nueva metodología para la detección sensible de la respuesta de la β-arrestina para evaluar el efecto de sesgo de remdesivir.

Tras la unión del ligando, los GPCR, incluido el UTS2R, inician un cambio conformacional que induce la activación de las proteínas G heterotriméricas y la disociación de los complejos de subunidades Gα y Gβγ. Las proteínas Gα incluyen las proteínas Gαs, Gαi/o, Gαq/11 y Gα12/13, que son responsables de la transducción de señales corriente abajo. Los miembros de la familia Gαi/o están ampliamente distribuidos, incluso en el sistema cardíaco, donde se expresan en gran medida y actúan para regular la contractilidad miocárdica y la frecuencia cardíaca a través de la modulación de los canales iónicos37. Por ejemplo, la frecuencia cardíaca en reposo está controlada por señales colinérgicas mediadas por receptores muscarínicos M2 acoplados a Gαi. Estos efectos se producen por inhibición de la adenilil ciclasa (AC) y por inhibición Gβγ de un canal de potasio en el nódulo sinoauricular. El mecanismo de transducción de UTS2R es el acoplamiento y la activación de Gαi/o así como de Gαq29, de acuerdo con el eje UT2-UTS2R implicado en la regulación CV a través de vías de señalización complejas, tanto fisiológica como patológicamente. Nuestros resultados utilizando NRCM mostraron claramente que la disminución de la contracción miocárdica mediada por remdesivir depende de Gαi/o, pero no de Gαq/11 (Fig. 4b). Dado que los NRCM se asemejan al fenotipo de los miocitos auriculares52, la disminución de la contractilidad miocárdica bajo estimulación constante por remdesivir indica un deterioro del manejo del calcio53, lo que es consistente con la disminución de la frecuencia cardíaca, un efecto secundario cardiovascular distintivo de remdesivir10. Además, demostramos que remdesivir afectó significativamente la contractilidad de los cardiomiocitos adultos (Fig. 4e, f).

A pesar del descubrimiento de que remdesivir puede activar UTS2R y causar cardiotoxicidad, la falta de evidencia clínica es una limitación importante de este estudio. Sin embargo, dado que las frecuencias alélicas de las variantes de ganancia de función son bajas (Fig. 4b complementaria) y se espera que el uso de remdesivir disminuya debido a la prevalencia reciente de la variante Omicron COVID-19 con sus síntomas más leves, una gran El estudio clínico a gran escala sobre la asociación entre la sensibilidad a remdesivir y la variación genómica es un desafío de ejecutar. Además, no hemos determinado los mecanismos moleculares precisos que inducen el riesgo proarrítmico dependiente de UTS2R de remdesivir. Las posibles explicaciones son la alteración de la regulación de la expresión génica o el tráfico de los canales de potasio ERG, que son esenciales para la actividad eléctrica en el corazón54. Alternativamente, los efectos cardiotóxicos crónicos y acumulativos del eje remdesivir-UTS2R son consistentes con un impacto posterior en la traducción y la transcripción. Aunque no excluimos la posibilidad de que remdesivir pueda afectar el metabolismo mitocondrial a través de la transducción de señales UTS2R (Fig. 3f complementaria), los datos actuales sugieren que el eje remdesivir-UTS2R es el objetivo principal de remdesivir.

En conclusión, hasta donde sabemos, este es el primer informe que muestra que remdesivir es un agonista selectivo de UTS2R y que la activación de UTS2R mediada por remdesivir es la base de la cardiotoxicidad mediada por fármacos. Además, descubrimos que SNV específicos en UTS2R pueden aumentar la sensibilidad a remdesivir. Por lo tanto, este estudio proporciona información mecanicista sobre los efectos secundarios cardíacos mediados por remdesivir y la oportunidad terapéutica para prevenir eventos aversivos en el futuro.

El objetivo general de este estudio fue explorar los mecanismos moleculares de la cardiotoxicidad relacionada con remdesivir en la terapia anti-COVID-19. Primero realizamos la detección de GPCR utilizando los principales fármacos anti-COVID-19 como ligandos (n = 3 por GPCR). Validamos los resultados de la detección de GPCR mediante análisis de concentración-respuesta y determinamos los valores EC50 y Emax de remdesivir contra UTS2R (n = 16). También realizamos una simulación de acoplamiento con AlphaFold y determinamos los residuos de aminoácidos clave que eran esenciales para la unión de remdesivir-UTS2R, como lo demostró un estudio de mutagénesis (n ≥ 3). A continuación, examinamos el potencial cardiotóxico de remdesivir. Usando cardiomiocitos derivados de hiPS, encontramos que el riesgo proarrítmico de remdesivir está mediado en gran medida por UTS2R (n = 3). Además, usando NRCM, demostramos que la disminución de la fuerza de contracción por remdesivir está mediada por el eje UTS2R-Gαi/o (n = 3). Finalmente, los efectos de los SNV en el gen UTS2R sobre la activación del receptor mediada por remdesivir se evaluaron mediante un ensayo GPCR (n = 3 por SNV).

Remdesivir (GS-5734), GS-441524 y sofosbuvir (GS-7977) se adquirieron de Selleck Chemicals. Favipiravir se adquirió de Tokyo Chemical Industry. La fibronectina se adquirió de Sigma-Aldrich. Todos los demás reactivos eran de grado analítico y se obtuvieron de fuentes comerciales.

Para buscar SNV en UTS2R, utilizamos una base de datos pública de 14 000 individuos japoneses sanos, llamada 14KJPN, publicada por la Organización Megabanca Médica Tohoku de la Universidad de Tohoku (ToMMo, https://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/)41, que cubre los datos de frecuencia variante.

Para medir la activación del GPCR, se realizó un ensayo de desprendimiento del factor de crecimiento transformante-α (TGFα)26. Brevemente, las células HEK293A se sembraron en una placa de cultivo de 12 pocillos. Se prepararon un total de 348 plásmidos pCAG que codifican un GPCR sin etiquetar, incluida la construcción UTS2R (Datos complementarios 1). Los mutantes UTS2R, incluidos 110 mutantes sin sentido correspondientes a los SNV humanos en el gen UTS2R, se generaron mediante la introducción de mutaciones de un solo punto utilizando un kit de mutagénesis KOD-Plus. Las células se transfectaron utilizando un reactivo de polietilenimina (PEI) (2,5 µl de 1 mg/ml por pocillo de aquí en adelante; Polysciences) con estos plásmidos UTS2R (100 ng por pocillo de aquí en adelante), junto con los plásmidos que codifican TGFα marcado con fosfatasa alcalina (AP) ( AP-TGFα; 250 ng). Los ensayos de activación de UTS2R se realizaron con proteína G endógena a menos que se especifique lo contrario. Se usaron proteínas de la subunidad Gα quimérica (mezcla de Gαq/s, Gαq/i1, Gαq/i3, Gαq/o, Gαq/z, Gαq/12, Gαq/13 y Gα16; cada 10 ng) para la detección inicial de 348 GPCR (Figura 1a). Después de un cultivo de 24 horas, las células transfectadas se cosecharon y recolectaron por centrifugación. Las células se suspendieron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contenía HEPES 5 mM (pH 7,4) y se sembraron en una placa de 96 pocillos. Después de una incubación de 30 minutos, se añadió el compuesto de prueba a las células. Después de 1 h de incubación, los medios acondicionados se transfirieron a una placa vacía de 96 pocillos. La solución de reacción AP (una mezcla de p-nitrofenilfosfato 10 mM (p-NPP), Tris-HCl 120 mM (pH 9,5), NaCl 40 mM y MgCl2 10 mM) se añadió a placas que contenían células y medios acondicionados. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices) antes y después de 1 hora de incubación de las placas a temperatura ambiente. La liberación de AP-TGFα inducida por el compuesto se calculó restando la señal de liberación espontánea de AP-TGFα de la señal de liberación de AP-TGFα inducida por el compuesto, y los porcentajes se ajustaron a una curva de concentración-respuesta sigmoidal de cuatro parámetros usando el software Prism 9 (GraphPad Prism) , y se obtuvieron los valores EC50 y Emax.

Se realizó un ensayo de reclutamiento de β-arrestina basado en la complementación enzimática NanoBiT55. Brevemente, las células HEK293A se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos y se transfectaron usando un reactivo PEI (5 µl de 1 mg/ml por pocillo de aquí en adelante) con una mezcla de plásmidos que constaba de 500 ng de construcción ssHA-FLAG-UTS2R-SmBiT (N -secuencia de señal de hemaglutinina terminal seguida de una etiqueta de epítopo FLAG, más SmBiT C-terminal con un conector flexible de 15 aminoácidos), 100 ng de construcción de LgBiT-β-arrestina (LgBiT N-terminal con un conector flexible de 15 aminoácidos) y 400 ng de plásmido vacío. Después de un cultivo de 24 h, las células transfectadas se recogieron, se suspendieron en 2 ml de tampón de ensayo (solución salina equilibrada de Hanks que contenía HEPES 5 mM (pH 7,4) y albúmina de suero bovino al 0,01 %) y se sembraron en una placa de 96 pocillos a un volumen de 80 µl por pocillo. Se añadió coelenterazina (20 µl de 50 µM diluida en el tampón de ensayo) a las placas de células, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad. Después de la medición de la luminiscencia inicial utilizando un lector de microplacas Spectra Max L (Molecular Devices), se añadió remdesivir o UT2 (20 µl de concentración 6x). La luminiscencia se midió cada 20 s después de la adición del compuesto. La señal luminiscente promedio durante 5 a 10 minutos se normalizó a un valor inicial. Los valores de cambio de pliegue se normalizaron adicionalmente a los de la condición tratada con vehículo y se ajustaron a una curva de respuesta de concentración sigmoidal de cuatro parámetros para obtener valores de CE50 utilizando el software Prism 9.

Para la reducción de afinidad de UTS2R, se sintetizó un péptido UT2 con una etiqueta de biotina N-terminal y un espaciador GSSG (Peptide Institute, INC)28. Las células HEK293 se transfectaron con el plásmido que codifica FLAG-UTS2R y se privaron de suero durante 6 h antes de la experimentación. Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo. Se añadió solución hipotónica (HEPES 50 mM, pH 7,5 con cócteles de inhibidores de proteasa) a la placa de células y las células se recogieron mediante raspado. Las células se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Dounce (IKA EUROSTAR 20 digital) a 2000 rpm durante 20 golpes a 4 °C, y se homogeneizaron adicionalmente utilizando una ruptura de tejido (Qiagen) durante 5 s a 4 °C. El homogeneizado se centrifugó a 800 xg durante 10 min a 4 °C para eliminar las células intactas y el núcleo. El sobrenadante se volvió a centrifugar a 30.000 xg durante 30 min a 4° (CP80NX, himac). El sedimento resultante se utilizó como fracción de membrana bruta y se suspendió en solución hiperosmótica (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, EDTA 2 mM con inhibidor de proteasa).

Posteriormente, la suspensión de membrana cruda se incubó en presencia o ausencia de remdesivir durante 1 h, seguido de incubación con biotina-UT2 durante la noche. El complejo UTS2R unido a biotina-UT2 se solubilizó utilizando un tampón hiperosmótico que contenía detergente (N-dodecil-β-D-maltopiranósido; DDM, 5x CMC) y se redujo utilizando perlas magnéticas de estreptavidina. Las perlas adecuadas para el experimento se seleccionaron de 5 tipos (Fig. 1d complementaria, kit de prueba de estreptavidina Dynabeads, Thermo Fisher y perlas magnéticas de estreptavidina, NEB) y se desnaturalizaron con tampón SDS. A continuación, los lisados ​​se sometieron a SDS-PAGE seguido de una transferencia Western usando un anticuerpo anti-FLAG para detectar FLAG-UTS2R (anticuerpo monoclonal Sigma M2, 1:2000).

Se preparó una estructura UTS2R humana a partir de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold56,57 (AlphaFold Monomer v2.0) recortando la región N-terminal similar a un párpado (1–42) con una puntuación pLDDT baja. Se agregaron átomos de hidrógeno al receptor recortado con el programa Reduce58. Remdesivir se acopló en el bolsillo ortostérico del receptor mediante AutoDockFR59 con 50 evoluciones de algoritmos genéticos y un máximo de 2 500 000 evaluaciones. Las poses de acoplamiento se agruparon en el límite de 2 Å, y los cinco grupos principales se inspeccionaron según el criterio de enlace de hidrógeno entre el receptor y remdesivir. Las estructuras se visualizaron y analizaron con CueMol y PyMOL (Schrödinger, Inc.). Los archivos utilizados en este estudio fueron depositados en Zenodo.

Para transferencias de pERK, ERK, pAKT, AKT y β-actina, se estimularon células HEK293A transfectadas con UTS2R y privadas de suero con remdesivir 0,1 o 1 μM o UT2 10 o 100 nM. Antes de la estimulación con estos compuestos, las células se incubaron con urantida (Peptide Institute) durante 30 min a 100 nM (para la inhibición de UTS2R) o con 150 ng/mL de toxina pertussis (PTX; Wako) durante la noche (para la inhibición de Gαi/o). Para transferencias de proteínas mitocondriales (OXPHOS total, MT-COI, TFAM y VDAC), se agregó remdesivir 1 o 10 μM o GS-441524 1 o 10 μM a células HEK293A transfectadas con UTS2R durante 48 h. Se prepararon lisados ​​de células enteras en tampón de lisis RIPA (Thermo Fischer Scientific) que contenía inhibidores de proteasa (Thermo Fischer Scientific) e inhibidores de fosfatasa (Nacalai Tesque). Los lisados ​​celulares se sometieron a ultrasonidos y se aclararon mediante centrifugación. Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) y se ajustaron a 1 mg/mL, y 10 μg de proteínas se sometieron a transferencia Western para cada experimento. Las muestras se separaron utilizando geles de poliacrilamida SDS y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las transferencias se bloquearon con leche descremada al 5 % en TBS-T (solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1 %) durante 1 h, luego se sondearon usando varios anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios y las diluciones de trabajo utilizadas fueron las siguientes: pERK (AB_331646), 1:2000; ERK (AB_330744), 1:2000; pAKT (AB_329825), 1:1000; AKT (AB_329827), 1:1000; βactina (AB_10697039), 1:10000; OXFOS total (AB_2756818), 1:10000; MTCO1 (AB_2084810), 1:2000; TFAM (AB_10841294), 1:1000; VDAC (AB_2272627), 1:1000. Los antígenos diana se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados (señalización celular) y se visualizaron mediante un sustrato ECL (GE Healthcare). Los niveles de proteína fosforilada se normalizaron frente a los niveles totales de la proteína objetivo (Figs. 3a y 4c, d, Fig. 3a, b complementaria). Para medir las proteínas mitocondriales (Fig. 3g complementaria), se detectaron subunidades OXPHOS, VDAC, MTCO1 y TFAM mediante anticuerpos específicos en diferentes membranas de PVDF, respectivamente. Los niveles de proteína de las subunidades OXPHOS, MTCO1 y TFAM se normalizaron al nivel de VDAC.

Para evaluar la expresión de ARNm de UTS2R humano (hUTS2R) en tejidos humanos adultos normales, se compraron ADNc disponibles en el mercado que se originaron de varios tejidos humanos de TaKaRa (la información detallada de la muestra se proporciona en Datos complementarios 3), y 2 ng de ADNc se sometieron a PCR cuantitativa (qPCR) (Rotor-Gene Q, Qiagen), según lo recomendado por los fabricantes. Para evaluar la expresión de ARNm de UTS2R (mUTS2R) de ratón en tejidos de ratones adultos normales, se compraron ratones macho C57BL/6J de Japan Clea y se aisló el ARN de múltiples tejidos. Las muestras de ARN se transcribieron inversamente en ADNc y se sometieron a análisis de qPCR. Los cebadores utilizados para la cuantificación relativa se muestran en los Datos complementarios 4. Los niveles de expresión de hUTS2R y mUTS2R se normalizaron a los genes de mantenimiento de G3PDH y 18 s rRNA, respectivamente.

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM) se adquirieron de Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. (CDI; iCell cardiomyocytes 2.0). Para preparar la sonda (MED-PG515A, Alpha MED Sciences), las áreas de registro se cubrieron con fibronectina y se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco para crear una solución de 50 µg/mL. El área de registro se cubrió con 1–2 µL de solución de fibronectina y las sondas se incubaron a 37 °C durante al menos 1 hora. Las células se descongelaron y se suspendieron en iCell Cardiomyocytes Plating Medium (CDI) y se colocaron en placas sobre las sondas a una densidad de 3,5 × 104 células en un medio de placas de 2 µl. Las células se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 3–4 h antes de llenar cada sonda con 1 ml de medio de mantenimiento de cardiomiocitos (CDI) iCell, que se utilizó como medio de cultivo. El medio se cambiaba cada 2-3 días, cultivándose las células en las sondas durante 5-14 días para obtener una lámina de cardiomiocitos con actividad eléctrica espontánea y sincrónica.

Se realizó registro de FP35,60. Antes de medir los FP, las láminas de cardiomiocitos iCell se equilibraron durante al menos 4 h en un medio de cultivo fresco utilizando una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C. Después del equilibrio, las sondas se transfirieron al sistema de matriz de electrodos múltiples (MEA) (MED64, Alpha med Scientific) y se incubaron en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. La estabilidad y constancia de las formas de onda se confirmaron monitoreando las señales durante al menos 30 min. Una vez que los FP alcanzaron un estado estable, se registraron durante 10 min en la línea de base y luego 24, 48 y 72 h después del tratamiento farmacológico. Las soluciones madre de fármacos se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) o agua destilada a una concentración objetivo de 1000 veces. La solución madre se diluyó en un medio de cultivo hasta una concentración final de DMSO al 0,1 %.

La duración de FP (FPD) se definió como la duración desde el primer al segundo pico en FP35. El FPD se corrigió por la frecuencia de latidos (intervalo entre picos (ISI)) con la fórmula de Fridericia (Ec. 1), que fue el método principal de corrección en este estudio:

Los valores de ISI y FPD se promediaron a partir de los últimos 30 latidos o 30 latidos en puntos de tiempo que mostraban un ISI y FPD estables.

La técnica de pinza de parche perforada se utilizó para registrar potenciales de acción espontáneos en modelos de pinza de corriente de hiPS-CM a 25 °C, utilizando un amplificador de pinza de parche EPC-10 (HEKA, Lambrecht, Alemania)61. Los hiPS-CM suelen generar automaticidad espontánea en una solución Tyrode normal. Los potenciales de acción espontáneos se registraron utilizando una pipeta de parche pulida al fuego (resistencia, 2,0–4,0 MΩ) llena con una solución de pipeta que contenía aspartato de potasio 70 mM, KCl 50 mM, KH2PO4 10 mM, MgSO4 1 mM, trifosfato de adenosina (ATP) 3 mM. (sal disódica; Sigma Chemical Company, St. Louis), EGTA 5 mM, HEPES 5 mM y trifosfato de guanosina (GTP) Li2 0,1 mM (Sigma Chemical Company) (pH ajustado a 7,2 con KOH). Se añadió anfotericina B (Wako Pure Chemical Industries) a la solución de la pipeta a una concentración de 100 mg/ml. El cubreobjetos de vidrio (3 × 5 mm2) que contenía hiPS-CM en placas de cultivo de 35 mm se colocó en una cámara de registro con solución Tyrode normal".

Se aislaron cardiomiocitos de rata neonatal (NRCM) de crías de rata Sprague-Dawley (Japan SLC Inc.) en los días postnatales 1–362. Los ventrículos de las crías se diseccionaron y trituraron en hielo después de la anestesia terminal (inhalación de sevoflurano al 1,5%) y la eutanasia por dislocación cervical. El tejido triturado se predigirió en tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco) durante la noche a 4 °C y luego se digirió en 1 mg/mL de colagenasa tipo 2 (Worthington) en PBS durante 30 min a 37 °C mientras se agitaba el matraz (125 rpm). ). Las células disociadas se filtraron a través de un filtro celular (70 μm, Falcon) y se centrifugaron durante 2 min a 180 x g. Después de eliminar el sobrenadante, los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de Eagle 12 modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10 % y penicilina al 1 % y se sembraron con estreptomicina en una placa de cultivo de 10 cm. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda (5 % CO2, 95 % aire) durante 90 min. Los NRCM flotantes se recogieron y se sembraron en placas de cultivo recubiertas con matrigel. Después de 24 h, el medio de cultivo se cambió a DMEM sin suero y se incubó durante más de 2 días antes de los experimentos. Todos los experimentos con animales fueron revisados ​​y aprobados por los comités de ética de los Institutos Nacionales de Ciencias Naturales o el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kyushu. Todos los procedimientos informados se ajustan a la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Los NRCM (4 × 105 células/pocillo) se sembraron en placas con fondo de vidrio de 3,5 cm en DMEM sin suero. Las células se trataron con remdesivir (1 μM) durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2. Al mismo tiempo se añadió urantida (100 nM). La toxina de la tos ferina (PTX; 150 ng/mL) se trató 18 h antes de agregar remdesivir, y YM-254890 (1 μM) se trató 30 minutos antes de agregar remdesivir. Se registraron imágenes microscópicas de NRCM durante 13 s en condiciones de estimulación. La estimulación del NRCM se estimuló a 4 V cada segundo, con una frecuencia de 10 ms, utilizando un estimulador eléctrico (NIHON KOHDEN, SEN-3301). Los datos de imágenes se adquirieron a seis fotogramas por segundo con un microscopio BZ-X800 (Keyence) y se analizaron con el software Fiji63.

Se adquirieron ratones C57BL/6J para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japón). Se realizó el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares de ratón adulto64. Se anestesiaron ratones macho por inhalación con isoflurano. Se extirpó rápidamente el corazón y se sujetó la aorta con una pequeña pinza vascular. El corazón se perfundió anterógradamente con tampón de aislamiento (menos de 3 ml) que contenía NaCl 130 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 0,5 mM, NaH2PO4 0,33 mM, HEPES 25 mM, glucosa 22 mM e insulina bovina (Sigma) 50 μU/ml ( pH 7,4, ajustado con NaOH) suplementado con EGTA 0,4 mM, seguido de la perfusión de solución enzimática (10 mL) (tampón de aislamiento que contiene 1 mg/mL de colagenasa tipo 2 (Worthington), 0,06 mg/mL de tripsina (Sigma), 0,06 mg /ml de proteasa (Sigma) y CaCl2 0,3 mM). A continuación, se retiró la cámara LV y se cortó en pequeños trozos en una solución enzimática que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2 % y CaCl2 0,7 mM. La suspensión de células de tejido se filtró a través de un filtro de células (100 μm, Falcon) y se centrifugó durante 3 min a 50 x g. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió en un tampón de aislamiento suplementado con BSA al 0,2 % y CaCl2 1,2 mM y se incubó durante 7 min a 37 °C. Después de la centrifugación (50 × g, 3 min), las células se resuspendieron en solución A de Tyrode (que contenía NaCl 140 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,5 mM, NaH2PO4 0,33 mM, HEPES 5,0 mM y glucosa 5,5 mM ( pH 7,4)) suplementado con 0,2% de BSA. Las células se sembraron en placas base de vidrio de 35 mm recubiertas con Matrigel (Corning) (IWAKI) y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Las células se usaron dentro de 1 a 6 h después del aislamiento.

Los cardiomiocitos de ratón adultos aislados se trataron con remdesivir (10 μM) durante 30 min a 37 °C. Se registraron imágenes microscópicas de cardiomiocitos durante 13 segundos en condiciones de marcapasos. El marcapasos de los cardiomiocitos se estimuló a 30 V cada segundo con una frecuencia de 10 ms utilizando un estimulador eléctrico (NIHON KOHDEN, SEN-3301). Los datos de imágenes se analizaron utilizando el software Fiji.

Los análisis estadísticos se realizaron con Prism Software (GraphPad), y los métodos se describen en las leyendas de las figuras. Los símbolos son valores medios y las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Se muestran resultados representativos de al menos tres experimentos independientes para cada figura, a menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. Los datos de origen subyacentes se proporcionan en Datos complementarios 1. Las transferencias sin recortar se presentan en la Figura complementaria 5. Los archivos de simulación de acoplamiento molecular se depositaron en Zenodo.

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Agradecemos las sugerencias y el apoyo técnico de todos los miembros del Departamento de Biología y Medicina Modómica de la Universidad de Tohoku. Agradecemos a Y. Takahata y H. Miyamoto por la asistencia técnica ya Natalie D. DeWitt por la lectura crítica y la edición del lenguaje. Este trabajo fue apoyado por fondos proporcionados por JSPS KAKENHI (Grant nos. JP20K18371, JP22H04628 y JP22H02813 a AO, JP21H05269 y JP22H02772 a MN, JP21H04791 y JP21H051130 a AI, JP21H02659 y JP21 H05265 a FYW y JP21H02634 a Y. Kanda. Este trabajo también recibió el apoyo de AMED (Grant nos. JP21mk0101189 a Y. Kanda, JP22zf0127007 a AI, 21he2302008j0002 a FYW, BINDS JP22ama121031 a MN y JP20am0101095 a AI, LEAP JP20gm0010004 a AI), FOREST de JST (Concesión n.º JPMJFR220K a AO, JPMJFR215T a AI, JPMJFR205Y a FYW), Moonshot R&D JPMJMS2023 de JST a AI, CREST JPMJCR2024 (20348438) de JST a MN, ERATO JPMJER2002 de JST a FYW, Daiichi Sankyo Foundation of Life Science a AI, Takeda Science Foundation a AO y AI , Uehara Memorial Foundation a AO y AI, Inamori Foundation a AO, Mitsubishi Foundation a AO, Terumo Life Science Foundation a AO y Naito Foundation a AO

Estos autores contribuyeron por igual: Akiko Ogawa, Seiya Ohira.

Departamento de Biología y Medicina Modómica, Instituto de Desarrollo, Envejecimiento y Cáncer (IDAC), Universidad de Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japón

Akiko Ogawa, Seiya Ohira y Fan-Yan Wei

Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japón

Seiya Ohira

Departamento de Fisiología, Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 812-8582, Japón

Yuri Kato, Xinya Mi, Yukina Ishii y Motohiro Nishida

Laboratorio de Bioquímica Molecular y Celular, Facultad de Posgrado en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Tohoku, 6-3, Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japón

Tatsuya Ikuta y Asuka Inoue

División de Farmacología, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, Kanagawa, 210-9501, Japón

Shota Yanagida y Yasunari Kanda

División de Ciencias Farmacéuticas, Escuela de Graduados en Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Okayama, Okayama, 700-8530, Japón

Shota Yanagida

Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas y Centro de Investigación Exploratoria sobre la Vida y los Sistemas Vivos, Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, Okazaki, 444-8787, Japón

Motohiro Nishida

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Los autores confirman su contribución al artículo de la siguiente manera: conceptualización y diseño del estudio: AO, MN, AI y FYW; recopilación de datos: AO, SO, Y. Kato, TI, SY, XM, YI y AI; análisis e interpretación de resultados: AO, Y. Kato, TI, SY, XM, Y. Kanda, MN, AI y FYW preparación del borrador del documento: AO, Y. Kato, TI, SY, XM, AI, FYW supervisión del proyecto: Y. Kanda, MN, AI, FYW Todos los autores revisaron los resultados y aprobaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Motohiro Nishida, Asuka Inoue o Fan-Yan Wei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Dipayan Chaudhuri y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Ogawa, A., Ohira, S., Kato, Y. et al. La activación del receptor de urotensina-II por remdesivir induce disfunción de los cardiomiocitos. Commun Biol 6, 511 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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Recibido: 10 noviembre 2022

Aceptado: 28 de abril de 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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