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Oct 24, 2023

Inmunogenicidad de un C secretado

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 296 (2023) Citar este artículo

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Las vacunas actuales de virus vivos, atenuados y muertos para el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) tienen sus limitaciones. Aquí, informamos el desarrollo de una vacuna de subunidades de BVDV mediante (i) la expresión de una forma secretada de una glicoproteína E2 recombinante utilizando células BHK21 y (ii) la determinación de las respuestas inmunitarias en ratones. La glicoproteína E2 se modificó mediante la eliminación del dominio de anclaje transmembrana C-terminal y la fusión con una etiqueta de epítopo V5. Esto permitió la detección usando anticuerpos monoclonales anti-V5 junto con una simple purificación de la forma secretada y expresada de E2 del medio celular. Además, fusionamos genéticamente la proteína fluorescente verde (GFP) unida a E2 a través de una secuencia de omisión de ribosomas del virus 2A (T2A) de Thesea asigna, creando así una poliproteína de autoprocesamiento [GFP-T2A-BVDV-E2trunk-V5], produciendo [GFP- T2A] y [E2trunk-V5] productos de traducción: la fluorescencia de GFP actúa, por lo tanto, como un marcador sustituto de la expresión de E2, se inocularon ratones BALB/c con [E2trunk-V5] purificado a partir de medios celulares y se observaron respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares. . Nuestro sistema de expresión de antígenos proporciona, por lo tanto, (i) un protocolo simple de purificación de antígenos junto con (ii) una estrategia factible para una mayor producción de vacunas a gran escala.

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un importante agente infeccioso en bovinos, cerdos y otros rumiantes; causa diarrea viral bovina y enfermedad de las mucosas, lo que lleva a diversos resultados clínicos que van desde una enfermedad leve hasta una enfermedad aguda y grave que pone en peligro la vida1. Los signos clínicos de la infección por BVDV incluyen fiebre, depresión, anorexia, erosiones de la mucosa, secreción ocular y nasal purulenta, tos, atonía ruminal, diarrea, aborto y disminución de la producción de leche2. La infección por BVDV también causa inmunosupresión, lo que aumenta la susceptibilidad a la neumonía bacteriana o viral3. En animales con inmunosupresión inducida por BVDV, la exposición a otros patógenos puede aumentar en gran medida su morbilidad y mortalidad, con el correspondiente impacto económico perjudicial en las industrias láctea y de carne4,5.

El genoma de BVDV es un ARN de sentido positivo monocatenario de aproximadamente 12,3 kb. El BVDV pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae, junto con el virus de la enfermedad de la frontera (que afecta a los ovinos) y el virus de la peste porcina clásica6. BVDV comprende dos genotipos principales: BVDV-1 (Pestivirus A, dividido en 22 subtipos de BVDV-1a a BVDV-1v) y BVDV-2 (Pestivirus B, dividido en cuatro subtipos de BVDV-2a a BVDV-2d). Otro pestivirus atípico conocido como virus similar a HoBi se identificó tentativamente como BVDV-3, que tiene cuatro subtipos7. Cada BVDV tiene dos biotipos, citopáticos y no citopáticos, según los efectos del virus desarrollado en células cultivadas. La cepa no citopática no daña las células infectadas8. Puede infectar al feto en desarrollo si las vacas están expuestas al virus durante la gestación temprana. Además, el BVDV se perpetúa en el rebaño a través de la producción de terneros persistentemente infectados (PI)9, ya que se vuelven inmunotolerantes al virus y excretan grandes cantidades de virus a lo largo de su vida. Por lo tanto, los animales PI se consideran una fuente importante de propagación de BVDV10. Las medidas más efectivas en los programas de prevención de BVDV incluyen medidas de bioseguridad, erradicación del ganado PI y vacunación5,11.

Las vacunas actuales contra el BVDV son vacunas multivalentes de virus vivos modificados y vacunas de virus inactivados11,12,13,14. Las vacunas vivas, atenuadas e inactivadas disponibles comercialmente tienen seguridad y eficacia limitadas: la vacuna de virus vivo modificado puede volver a la virulencia y dar lugar a terneros con IP, mientras que la vacuna de virus inactivado tiene una protección de corta duración y no puede estimular una respuesta inmunitaria celular15. Por lo tanto, se requiere una vacuna de subunidad BVDV segura y eficaz para la protección a largo plazo del ganado contra BVDV.

La proteína transmembrana E2 es una de las proteínas estructurales de BVDV, anclada en la membrana viral a través del dominio C-terminal. Como una de las principales glicoproteínas inmunogénicas, E2 participa en la fusión del virus con las células huésped y contiene sitios antigénicos importantes que pueden generar anticuerpos neutralizantes durante la infección con BVDV16,17. Por lo tanto, E2 es un candidato principal para el diseño de vacunas de subunidades. En este estudio, desarrollamos un sistema de expresión eucariota para expresar la glicoproteína E2 recombinante que se clonó con el dominio de anclaje transmembrana eliminado, lo que permite que esta glicoproteína truncada E2 se secrete en los medios de cultivo tisular después de la transfección de células de mamífero. Se produjo glicoproteína E2 recombinante en células de mamíferos para garantizar las modificaciones postraduccionales correctas, y se observó que los patrones de glicosilación correctos eran inmunogénicos en ratones. Las secuencias que codifican la forma de E2 eliminada del dominio transmembrana se fusionaron genéticamente con la etiqueta del epítopo V5 para (i) la detección de proteínas mediante transferencia Western y (ii) la purificación de la E2 truncada expresada del medio celular. Además, utilizamos la secuencia de autoescisión del virus de Thesea asigna 2A (T2A) para vincular el gen E2 truncado y la proteína fluorescente verde (GFP). Los péptidos 2A son pequeños y pueden mediar en la escisión de manera eficiente para la coexpresión de múltiples genes18,19. La GFP se usó como un marcador sustituto para la expresión de la proteína E2, y este marcador se visualiza fácilmente mediante microscopía de fluorescencia de células vivas no invasiva después de la transfección de células de riñón de hámster bebé (BHK) -21. También evaluamos la inmunogenicidad de las glicoproteínas E2 truncadas C-terminal secretadas en ratones a través de una variedad de respuestas inmunitarias, a saber, el título de anticuerpos específicos de antígeno en suero, la proliferación de linfocitos, la subpoblación en esplenocitos y la concentración de varias citoquinas.

La forma truncada C-terminal sintetizada del gen BVDV E2 (Fig. 1A y B) se clonó inicialmente en el sistema pGEM-T Easy Vector y se verificó mediante secuenciación automática de Sanger antes de ser escindida (usando ApaI y PstI) de este vector y ser transferido al vector de expresión pJC3 (Fig. 1C). Se utilizó el programa NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)20 para predecir los sitios de N-glicosilación a partir de la glicoproteína E2 de BVDV de longitud completa. Este programa predice que la glicoproteína E2 de BVDV de longitud completa tiene 5 sitios potenciales de N-glucosilación (N115, N184, N228, N259, 296) (Fig. 1D).

Estructura del genoma de BVDV y síntesis de la región que codifica la glicoproteína E2. Organización del genoma de BVDV (no a escala) y procesamiento de poliproteínas (A). Se muestran la estrategia de clonación y la síntesis de genes que codifican las formas truncadas en el extremo C (dominios de anclaje transmembrana eliminados) de la glicoproteína E2 (áreas recuadradas), junto con el péptido señal (área de eclosión horizontal) y la etiqueta del epítopo V5 C-terminal (barra oblicua). área) (B). Clonación de la forma truncada de la glicoproteína E2 en el vector de expresión pJC3. El plásmido pJC3 codifica una poliproteína [GFP-T2A-mCherry] codificada por un único marco de lectura abierto. La transcripción está impulsada por el potenciador/promotor del citomegalovirus humano y el ARNm poliadenilado por la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Las secuencias que codifican la forma truncada de la glicoproteína E2 se extirparon mediante restricción con ApaI y PstI del pGEM-T Easy Vector, luego se insertaron en pJC3, con una restricción similar, para eliminar mCherry FP y crear el plásmido [tronco GFP-T2A-BVDV-E2] ( C). El servidor NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) se utilizó para predecir sitios N-glucosilados a partir de glicoproteínas E2 de longitud completa. Un potencial de N-glicosilación > 0,5 fue el valor de corte para las secuencias (D).

Para determinar si la forma truncada en el extremo C de la glicoproteína E2 del BVDV se secretó en los medios de cultivo celular, se emplearon ensayos de inmunotransferencia puntual en los medios usando un anticuerpo monoclonal contra la etiqueta del epítopo V5 o antisuero anti-BVDV de ratón presente en diferentes concentraciones. veces después de la transfección. El análisis de transferencia Western de los extractos de células BHK-21 transfectadas indicó la expresión máxima de la glicoproteína E2 truncada a las 48 h. La banda de proteína observada a ~ 55 kDa es algo difusa, consistente con el grado de heterogeneidad en la masa molecular que surge de la glicosilación de proteínas (Fig. 2A). Las transferencias de puntos inmunes indicaron que la glicoproteína E2 truncada se secretó en el medio y se reconoció por la etiqueta del epítopo V5 y el antisuero BVDV (Fig. 2B); esta forma secretada fue estable en el medio celular durante la duración del experimento (96 h), de acuerdo con los datos de la transferencia Western.

Evaluación de la expresión de la glicoproteína E2 truncada. (A) Análisis de transferencia Western de extractos de células transfectadas. Se prepararon y analizaron muestras de extractos celulares (12% SDS-PAGE) antes de la transferencia, como se describe en los métodos. (B) Análisis de inmunotransferencia de puntos de los medios celulares. Medios de cultivo de tejidos de células BHK-21 transfectadas con glicoproteína E2 truncada en los puntos de tiempo indicados. Las membranas se probaron con el anticuerpo monoclonal anti-V5 de ratón (1:8000) o antisuero anti-BVDV de ratón (1:4000) como anticuerpo primario. Carril M: marcador de proteína preteñido, carril simulado: células BHK-21 no transfectadas.

Las concentraciones séricas de anticuerpos específicos de BVDV de diferentes subtipos (IgG, IgG1 e IgG2a) se determinaron mediante ELISA. Después de la primera vacunación, el título total de anticuerpos IgG en el grupo de dosis alta fue significativamente mayor (P < 0,05) que en el grupo de dosis baja hasta la semana 8 (Fig. 3A). Además, la glicoproteína E2 truncada estimuló la producción simultánea de anticuerpos IgG1 (Fig. 3B) e IgG2a (Fig. 3C). En comparación con el grupo de control, el nivel de IgG1 aumentó aproximadamente 3,5 veces y el nivel de IgG2a aproximadamente 2,5 veces, lo que indica una regulación positiva de los subtipos de IgG asociados con la inmunidad dependiente de células T.

Análisis ELISA de las respuestas de anticuerpos específicos de BVDV inducidas por la glicoproteína E2 truncada: (A) IgG total, (B) IgG1 y (C) IgG2a. Las respuestas de anticuerpos en ratones se evaluaron a las 0, 2, 4, 6 y 8 semanas después de la inmunización intraperitoneal con 5 o 35 μg de glicoproteína E2 truncada o PBS. Los ratones se inyectaron dos veces en las semanas 0 y 2. Los datos se presentan como valores medios de absorbancia ± desviaciones estándar. Letras diferentes (a, b, c) en la barra indican diferencias significativas (P < 0,05) entre grupos en el mismo punto de tiempo utilizando la prueba de Duncan. () Grupo I: 5 µg de glicoproteína E2 truncada; () Grupo II: 35 μg de glicoproteína E2 truncada; () Grupo III: PBS.

Para evaluar la respuesta inmune mediada por células, se aislaron esplenocitos de ratones y se reestimularon in vitro con 5 µg de glicoproteína E2 truncada. Se evaluó la proliferación de linfocitos para representar el índice de estimulación (SI). Como ilustra la Fig. 4, la actividad proliferativa de linfocitos T en el grupo de dosis alta fue significativamente (P < 0,05) mayor que la de los grupos de control y de dosis baja. No se observó ningún efecto sobre la proliferación de linfocitos en el grupo de control, que mostró que la glicoproteína E2 truncada puede inducir una respuesta inmunitaria mediada por células in vivo.

Estimulación de la proliferación de linfocitos de ratón por la glicoproteína E2 truncada. El índice de estimulación (SI) se calculó dividiendo el valor medio de la DO de los pocillos estimulados por el de los pocillos de control (solo medios). Los datos se presentan como la media ± desviaciones estándar de tres experimentos individuales. Los tratamientos con letras diferentes (a, b, c) en la barra indican diferencias significativas (P < 0,05). () Grupo I: 5 μg de glicoproteína E2 truncada;() Grupo II: 35 μg de glicoproteína E2 truncada;() Grupo III: PBS;() Control positivo: ConA.

Para determinar el fenotipo de la subpoblación de células T en linfocitos de bazo, se realizó citometría de flujo, con marcaje único para definir diferentes subpoblaciones. A las 4 semanas de la inmunización, el porcentaje de aumento de linfocitos T CD4+ en el bazo fue significativamente mayor en el grupo de dosis alta (24,6 % ± 1,6 %, P < 0,05) que en los otros grupos, y el porcentaje de aumento en Los linfocitos T CD8+ en el bazo fueron significativamente más altos en el grupo de dosis alta que en el grupo de dosis baja (5 μg) (10,7 % ± 1,0 % frente a 7,7 % ± 1,9 %, P < 0,05; fig. 5).

Análisis de citometría de flujo del porcentaje de linfocitos T CD4+ y CD8+ en bazo. Los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal dos veces en las semanas 0 y 2 con glicoproteína E2 truncada, y los ratones del grupo de control se inmunizaron con PBS. Se aislaron esplenocitos de ratones 4 semanas después de la inmunización y se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-CD4+ y CD8+ de ratón. Los datos se presentan como la media ± desviaciones estándar de los ratones en el mismo tratamiento (n = 4). Letras diferentes (a, b, c) en la barra indican diferencias significativas (P < 0,05) entre grupos en el mismo punto de tiempo.() Grupo I: 5 μg de glicoproteína E2 truncada;() Grupo II: 35 μg de glucoproteína E2 truncada glicoproteína E2;() Grupo III: PBS.

Para caracterizar aún más la polarización de la respuesta inmune, las concentraciones de citoquinas Th1, IL-12 (Fig. 6A) e IFN-γ (Fig. 6B), o una citoquina Th2, IL-4 (Fig. 6C), en el suero de los ratones inmunizados se midieron en las semanas 0, 2 y 4. A diferencia de los sueros del grupo de control, los sueros de los ratones en ambos grupos de estudio contenían IL-12, IFN-γ e IL-4. Estos resultados demuestran que las glicoproteínas E2 truncadas pueden provocar de forma eficaz respuestas Th1 y Th2 específicas.

Concentración de citocinas (A) IL-12, (B) IFN-γ y (C) IL-4 en ratones inmunizados con 5 o 35 μg de glicoproteína E2 truncada o PBS. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar de la concentración sérica de cada citoquina determinada usando kits ELISA comerciales. Letras diferentes (a, b, c) en la barra indican diferencias significativas (P < 0,05) entre grupos en el mismo punto de tiempo.() Grupo I: 5 μg de glicoproteína E2 truncada;() Grupo II: 35 μg de glucoproteína E2 truncada glicoproteína E2;() Grupo III: PBS.

El control de la infección por BVDV en el ganado se basa en medidas de bioseguridad, identificación y eliminación del ganado PI y vacunación. Los terneros PI son los principales transmisores de BVDV ya que se vuelven inmunotolerantes al virus y eliminan grandes cantidades de virus a lo largo de su vida. Por lo tanto, las vacunas ahora ayudan a proporcionar poblaciones inmunes; la inmunidad es particularmente vital para las hembras reproductoras en la manada1. En los últimos años, muchos estudios han intentado desarrollar vacunas contra el BVDV más eficaces. Las vacunas vivas atenuadas se han utilizado ampliamente contra el BVDV, lo que induce fuertes respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células con una fuerte protección del feto21,22. Las vacunas vivas atenuadas basadas en la cepa no citopática generalmente no se recomiendan para la vacunación de animales preñados ya que esta cepa puede atravesar la placenta e infectar al feto. Los estudios han intentado superar el problema de seguridad de desarrollar un virus mutante eliminando el gen Npro e inactivando la actividad endorribonucleasa de la glicoproteína estructural Erns22,23, pero el virus de la vacuna aún podría atravesar la placenta24. Las vacunas inactivadas son seguras durante el embarazo25,26,27, pero su eficacia es limitada porque no inducen una respuesta inmune celular28,29. No se ha informado una protección cruzada significativa contra diferentes cepas de virus30,31. Por lo tanto, el desarrollo de vacunas de subunidades es un enfoque eficaz. Además, los antígenos expresados ​​en diferentes cepas de virus son posibles candidatos a vacunas; estas vacunas podrían desencadenar una protección cruzada contra diferentes cepas de BVDV. En el presente estudio, clonamos y expresamos una glicoproteína E2 truncada. La glicoproteína E2 es el antígeno más divergente entre los tipos 1 y 2 de BVDV y los pestivirus tipo HoBi, y puede provocar anticuerpos neutralizantes16,17.

Los principales objetivos del presente estudio fueron (i) clonar una forma truncada secretada de la glicoproteína E2 del BVDV, (ii) utilizar cultivos de células de mamíferos como plataforma de expresión de antígenos y (iii) evaluar los efectos inmunitarios de la vacuna en ratones. . La estrategia de construcción que aplicamos en este estudio fue generar una fusión genética de glicoproteína E2 truncada C-terminal (anclaje transmembrana eliminado) con GFP unida a través de una secuencia de salto de ribosoma T2A para crear una poliproteína de autoprocesamiento (GFP-T2A-BVDV-E2 trompa). Esta estrategia no afecta la función de cada proteína aguas abajo de T2A18,19,32. Además, las ventajas de esta estrategia son (i) la facilidad de identificar y cuantificar las intensidades de señal de células vivas de fluorescencia GFP mediante el uso de ensayos y (ii) la posterior clasificación de células activadas por fluorescencia de células transfectadas de forma estable. Las vacunas de subunidades a menudo dependen de una sola proteína para generar una respuesta inmunitaria eficaz dentro del huésped vacunado; como tal, tanto la cantidad como la autenticidad antigénica de la proteína recombinante son cruciales33. Por lo tanto, nuestra glicoproteína E2 truncada se expresó en líneas celulares de mamíferos para producir un plegamiento de proteínas más auténtico de tipo viral y una glicosilación compleja que afecta a varias funciones de las proteínas, incluido el plegamiento, la estabilidad, la actividad, la antigenicidad auténtica, el transporte y la respuesta inmunitaria. Nuestros datos indicaron que la glicoproteína E2 truncada se secretó con éxito en los medios de cultivo de tejidos (Fig. 2B) y la expresión en curso se detectó dentro de la célula (Fig. 2A), de acuerdo con nuestros hallazgos informados anteriormente32. Los análisis de transferencia Western de extractos celulares después de la transfección de la glicoproteína E2 truncada revelaron una banda difusa, en lugar de discreta, del peso molecular predicho (55 kDa), característica de la glicosilación (Fig. 2A). Además, la glicoproteína E2 truncada exhibió antigenicidad, como se demostró en inmunotransferencia usando antisuero anti-BVDV de ratón (Fig. 2).

Debido a que la calidad de la respuesta inmune es crucial para la eficacia de la vacuna, investigamos la respuesta inmune después de la inmunización con la vacuna de glicoproteína E2 truncada. Cuando se usó BVDV de virus completo como antígeno de recubrimiento ELISA, el título de IgG total fue significativamente mayor en los grupos de vacunación (glucoproteína E2 truncada) en comparación con el grupo de control después de la inmunización (Fig. 3A). Además, la glicoproteína E2 truncada mediaba las respuestas de anticuerpos IgG1 (Th2) (Fig. 3B) e IgG2a (Th1) (Fig. 3C) específicas de BVDV. Además, los ratones inmunizados con la vacuna exhibieron un predominio de IgG1, que está relacionado con la respuesta de cambio de Th2. Paralelamente, los niveles de IL-4 en los grupos de vacunación fueron significativamente más altos que los del grupo de control (Fig. 6C). IL-4 es una citoquina representativa de tipo Th2 que está asociada con la proliferación, diferenciación y madurez de las células B, y regula la producción de anticuerpos34. En conjunto, estos resultados revelan que la glicoproteína E2 truncada es eficaz para inducir una respuesta inmunitaria humoral específica.

Las células Th1 están implicadas en la inmunidad celular y secretan la citocina efectora de tipo Th1. Por lo tanto, el nivel de citocinas Th1 y la actividad proliferativa de los linfocitos T pueden reflejar el estado básico de la inmunidad celular35. Nuestros datos indicaron que los niveles de citoquinas de tipo Th1 (IL-12 e IFN-γ) en los grupos de vacunación después de la inmunización fueron significativamente más altos que en el grupo de control (Fig. 6A y B). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los grupos de dosis baja y dosis alta. En particular, observamos un SI marcadamente mejorado en los linfocitos T de bazo reestimulados de ratones inmunizados con glicoproteína E2 truncada (Fig. 4). Además, los porcentajes de células T CD4+ y CD8+ en el bazo de los ratones inmunizados aumentaron significativamente, aunque las CD4+ fueron ligeramente más altas que las CD8+ (Fig. 5), lo que indica una fuerte activación de las células T. Las células T CD4+ secretan un espectro de citoquinas y son fundamentales para la activación de la inmunidad tanto humoral como celular, mientras que las células T CD8+ están asociadas con la actividad de citoquinas de los linfocitos T para eliminar patógenos intracelulares 36. Estos hallazgos sugieren que la glicoproteína E2 truncada puede inducir una respuesta inmune celular en ratones.

En este estudio, nuestra estrategia de expresión de antígeno produjo una proteína recombinante auténtica de tipo viral secretora y proporciona una estrategia factible para la producción a gran escala de vacunas; es posible una purificación simple adicional con una etiqueta de epítopo V5. Además, se descubrió que las glicoproteínas E2 truncadas inducen respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares. En particular, no aplicamos un adyuvante adicional en la formulación de la vacuna, lo que destaca la inmunogenicidad favorable de la glicoproteína E2 truncada. Nuestra estrategia de construcción nos permitió obtener una expresión de antígeno de alta calidad y nuestra evaluación confirmó la eficacia de la vacuna. Estos prometedores resultados pueden servir como base para futuras investigaciones. En el futuro, llevaremos a cabo ensayos de campo en bovinos para tener una investigación más detallada de la efectividad y evaluar exhaustivamente el potencial de esta vacuna de subunidades contra el BVDV.

El dominio transmembrana de la glicoproteína E2 de BVDV se predijo utilizando el programa TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM). Hasta donde sabemos, solo se ha informado la cepa BVDV tipo 2 en hatos de ganado en Taiwán. Por lo tanto, la forma truncada en el extremo C del gen BVDV E2 (posición 2462-3481 del ácido nucleico) se sintetizó usando una secuencia aislada de ganado en China (cepa XJ-04, secuencia de nucleótidos GenBank, número de acceso FJ527854) que también codificaba (i ) un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (-ENLYFQG-) que se puede usar para eliminar tanto (ii) una secuencia enlazadora corta (-GSDQTENSG-) como (iii) la etiqueta del epítopo V5 (-GKPIPNPLLGLDST-COOH) (Fig. 1A y B). El gen BVDV E2 sintetizado (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania) se clonó en pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. Todos los clones se verificaron mediante secuenciación Sanger automatizada (GATC Biotech, Cambridge, Reino Unido).

La secuencia codificada del gen BVDV E2 se digirió con ApaI y PstI (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido) y se clonó en el vector de expresión pJC3, restringido de manera similar (Fig. 1C). El vector de expresión pJC3 estaba basado en pcDNA3.1, con T2A enlazando GFP y genes de proteína fluorescente de cereza monomérica (mCherry FP)37,38. Esto produjo un clon que codificaba la forma truncada de la glicoproteína E2 (tronco GFP-T2A-BVDV-E2).

Se obtuvieron células BHK-21 (BCRC n.º 60041) y células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) (BCRC n.º 60126) del Bioresource Collection and Research Center, Taiwán, y se propagaron en medio esencial mínimo de Eagle (Invitrogen, NY, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % inactivado por calor (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en CO2 al 5 % a 37 °C.

En este estudio, utilizamos la cepa BVDV tipo 2 BVDV/TW 2014 obtenida del Hospital de Grandes Animales, Universidad Nacional de Ciencia y Tecnología de Pingtung (NPUST), Taiwán39. El virus se cultivó en células MDBK. Los títulos de BVDV se determinaron utilizando el método de Reed y Muench40 y se expresaron como la dosis infecciosa de anticuerpos fluorescentes FAID50/mL39,41. En resumen, se cocultivaron una muestra de virus (100 μL) y células MDBK (100 μL de 1 × 105 células/mL) en placas de 96 pocillos durante 6 días a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Se utilizó una solución tamponada de Formalde-Fresh (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para fijar las células y una dilución 1:5 de antisuero policlonal conjugado con fluorescencia anti-BVDV (VMRD, Pullman, WA, EE. UU.) para detección de virus Los pocillos fluorescentes se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus CKX41, Olympus Co. Ltd., Tokio, Japón).

Para detectar la proteína secretada, el ADN del plásmido se transfectó en monocapas de células BHK-21 (1 × 107 células por matraz T-175, 70 %–80 % de confluencia) utilizando el reactivo de transfección de ADN in vitro PolyJet (SignaGen Laboratories, Ijamsville, MD, UU.) según las instrucciones del fabricante. El medio y el extracto celular se recogieron a las 24, 48, 72 y 96 h después de la transfección en las células BHK-21. Los medios de cultivo celular se recolectaron y clarificaron mediante centrifugación (2000 × g a 4 °C durante 15 min), y el sobrenadante se decantó a un tubo nuevo antes de almacenarlo a -20 °C. Los sobrenadantes se descongelaron en hielo antes de colocarlos en una membrana de nitrocelulosa (0,2 µm; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.), donde se analizaron mediante un ensayo de transferencia de puntos con un anticuerpo monoclonal contra la etiqueta del epítopo V5 (1:8000; MBL International, Nagoya, Japón) o antisuero anti-BVDV de ratón (1:4000)39 como anticuerpo primario y IgG anti-ratón de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario (1:8000; KPL, Gaithersburg, MD, EE.UU). La señal se desarrolló utilizando el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad).

A las 24, 48, 72 y 96 h después de la transfección, las células BHK-21 se lavaron y las células se lisaron usando tampón de lisis y extracción RIPA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA (completo; Roche Diagnostics, Burgess Hill, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Luego, el lisado celular se analizó utilizando SDS-PAGE y se sometió a electrotransferencia en membranas de transferencia de difluoruro de polivinilideno (Immobilon-P; Merck Millipore, Tullagreen, Irlanda). Después de bloquear con leche descremada Difco al 5 % (p/v, BD, Le Pont de Claix, Francia), las membranas se probaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario que reconocía la etiqueta del epítopo V5 (1:8000; MBL International) o antisuero anti-BVDV de ratón (1:4000)39. Después de lavar tres veces en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con IgG-HRP anti-ratón de cabra como anticuerpo secundario (1:8000; KPL) y se tomaron imágenes con el sistema de imágenes G:BOX. y software de análisis (Syngene, Frederick, MD, EE. UU.).

Para cuantificar la glicoproteína E2 truncada, se recogieron los medios 48 h después de la transfección de las células BHK-21. El sobrenadante clarificado se aplicó al kit de purificación de proteínas con etiqueta V5 versión 2 (MBL International) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las fracciones de proteína eluidas que contenían la glicoproteína E2 truncada se combinaron y concentraron usando un filtro ultracentrífugo Amicon con un tamaño de poro de 30 kDa (Merck Millipore, Burlington, MA, EE. UU.). La estimación de proteínas se realizó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.).

La vacuna utilizada en este estudio era una vacuna sin adyuvante, que contenía una forma truncada purificada de glicoproteína E2 dividida en concentraciones bajas (5 µg) y altas (35 µg) por dosis. La concentración de antígeno de la vacuna se basó en un experimento previo dependiente de la dosis32. Las vacunas no contenían microorganismos viables, según los resultados de la prueba de esterilidad.

Los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la NPUST y se realizaron siguiendo las reglas y leyes éticas de la universidad (Aprobación IACUC No. 110-046). Los ratones utilizados en este estudio fueron criados y alojados en un ambiente aséptico para protegerlos de infecciones oportunistas. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h a temperatura constante (22 ± 1 °C) y humedad relativa de 50% ± 10%; todos los animales tuvieron acceso ad libitum a alimento y agua. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales, y los animales fueron sacrificados humanitariamente al final del período de estudio. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

Veintisiete ratones BALB/c de 4 semanas de edad (LASCO, Taipei, Taiwán) se dividieron en tres grupos de la siguiente manera: grupo I (vacunación, n = 9), que recibió 5 µg de glicoproteína E2 truncada; grupo II (vacunación, n = 9), recibiendo 35 µg de glicoproteína E2 truncada; y el grupo III (control, n = 9), que recibió solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los ratones inmunizados con 5 y 35 µg de glicoproteína E2 truncada sirvieron como grupos de dosis baja y dosis alta, respectivamente. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal dos veces en las semanas 0 y 2 con 200 μL de la vacuna. Se obtuvieron sueros de cada ratón para una determinación adicional en las semanas 0, 2, 4, 6 y 8.

Los títulos séricos específicos de anticuerpos contra BVDV se detectaron mediante ELISA indirecto. Placas de microtitulación de fondo plano de poliestireno (ExtraGENE, Taichung, Taiwán) se recubrieron con 1,25 μg/mL de antígeno de virus completo (BVDV/TW 2014) en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM y NaN3 3 mM; pH 9,6) y se dejó toda la noche a 4 °C. La concentración de recubrimiento óptima y la dilución del suero se determinaron mediante titulación de tablero de ajedrez. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 (PBST), se bloquearon con BSA al 1 % (KPL) en PBST a 37 °C durante 1 hora y se lavaron tres veces con PBST. Posteriormente, se añadieron a los pocillos 50 μL de antisuero de ratón adecuadamente diluido como anticuerpo primario y las placas se incubaron a 37 °C durante 1,5 h. A partir de entonces, las placas se lavaron cuatro veces con PBST, y 100 μl de IgG anti-ratón de cabra (KPL) adecuadamente diluida marcada con HRP, IgG1 anti-ratón (policlona, ​​Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE. UU.) o anti-ratón Se añadió IgG2a (policlona, ​​Bethyl Laboratories) como anticuerpo secundario. Luego, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h y se lavaron cuatro veces con PBST. A partir de entonces, se agregaron 100 μL de sustrato de peroxidasa de micropocillos (KPL) de 2 componentes TMB y se realizó la reacción de color durante 10 minutos antes de agregar la solución de parada TMB (KPL) para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Anthos 2020; Anthos, Cambridge, Reino Unido).

Cuatro semanas después de la inmunización, el ensayo de proliferación de linfocitos se realizó usando el ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 AQueous One Solution (MTS; Promega). Los esplenocitos de cuatro ratones seleccionados al azar por grupo se sembraron en una placa de fondo plano de 96 pocillos (1 × 106 células por pocillo) y se cocultivaron con glicoproteína E2 truncada (5 μg/ml) en RPMI-1640 complementado con FBS al 10 %. , y se mantuvo a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 72 h. Además, se corrieron en paralelo a la prueba medios libres de células que contenían RPMI-1640 completo. Las células solas sirvieron como control negativo, y el potente mitógeno concanavalina A (ConA; Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) se usó como control positivo para una concentración final de 2 μg/mL. Cada muestra de esplenocitos se evaluó por triplicado. Se añadió MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) a cada pocillo y luego se incubó durante 4 h a 37 °C. por debajo del 5% de CO2. Se midió la absorbancia a 490 nm. El índice de estimulación se determinó de la siguiente manera: (difracción óptica [OD] del tratamiento − OD del fondo)/(OD del control negativo − OD del fondo).

Se usaron cuatro ratones para determinar la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ para cada grupo de prueba 4 semanas después de la inmunización. Brevemente, los esplenocitos de los ratones de cada grupo se aislaron rompiendo los bazos usando un cilindro de jeringa de 3 ml en RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.). Después de pasar los homogeneizados de bazo a través de un filtro de células de 100 μm y tratarlos en tampón de lisis ACK (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para lisar los eritrocitos, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS que contenía albúmina al 1% de suero bovino. (1 × 107 células/mL). Los esplenocitos aislados (106 células) se incubaron con CD4+ anti-ratón de rata conjugado con FITC y CD8+ anti-ratón de rata conjugado con PE (BD Pharmingen, San Jose, CA) a 4 °C durante 30 min en la oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS y 50.000 células, según la proporción de células T CD4+ y CD8+, se caracterizaron por citometría de flujo utilizando un instrumento FACScalibur (BD Biosciences).

Los niveles de citoquinas en suero recolectado de ratones inmunizados en las semanas 0, 2 y 4, respectivamente, se detectaron usando interleuquina comercial (IL)-12 p70 (ab119531), interferón-gamma (IFN-γ; ab100689) e IL-4 ( ab100710) kits ELISA (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de cada citocina se calculó usando la curva estándar trazada.

Todos los datos se analizaron utilizando el software estadístico SAS (v. 9.0, Cary, NC, EE. UU.). Para los experimentos con ratones, las diferencias entre los tratamientos en cada punto de tiempo se analizaron mediante análisis de varianza y comparaciones múltiples de Duncan. Letras diferentes (a, b, c) en la barra indican diferencias significativas (P < 0,05) entre grupos en el mismo momento.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de Uniprot, número de acceso C4NF75.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer al profesor Chun Yen Chu (NPUST, Taiwán) que obtuvo financiación y brindó asesoramiento científico y al profesor RE Randall (Universidad de St. Andrews, Reino Unido) por los anticuerpos anti-V5.

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán [MOST-106-2911-I-020-501; MOST-107-2313-B-020-011-MY3] y el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido [BB/P025080/1].

Programa de Grado Internacional en Tecnología de Vacunas para Animales, Colegio Internacional, Universidad Nacional de Ciencia y Tecnología de Pingtung, No. 1, Shuefu Rd., Neipu, Pingtung, 91201, Taiwán

Yi Ting Lo, Wan Chen Chang y Hsing Chieh Wu

Complejo de Investigación de Ciencias Biomédicas, Facultad de Biología, Universidad de St Andrews, St Andrews, Escocia, Reino Unido

Martin D. Ryan y Garry A. Luke

Instituto de Graduados en Tecnología de Vacunas para Animales, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Ciencia y Tecnología de Pingtung, Neipu, Pingtung, Taiwán

Hsing Chieh Wu

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YTL llevó a cabo un trabajo experimental y redactó el manuscrito. MDR obtuvo fondos y diseñó el formulario truncado. GAL llevó a cabo la clonación de construcciones. WCC brindó asistencia técnica con las pruebas de inmunidad. HCW realizó construcción de clonación, análisis de datos y redactó el manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Hsing Chieh Wu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lo, YT, Ryan, MD, Luke, GA et al. Inmunogenicidad de una forma secretada, truncada en el extremo C, de la glicoproteína E2 del virus de la diarrea viral bovina como candidata potencial en el desarrollo de vacunas de subunidades. Informe científico 13, 296 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

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Recibido: 09 Agosto 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 06 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

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