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Oct 22, 2023

Genética de la naturaleza volumen 55,

Nature Genetics volumen 55, páginas 268–279 (2023)Citar este artículo

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El perfil de expresión génica ha identificado numerosos procesos alterados en el envejecimiento, pero se desconoce en gran medida cómo surgen estos cambios. Aquí combinamos la secuenciación de ARN naciente y la inmunoprecipitación de cromatina de ARN polimerasa II seguida de secuenciación para dilucidar los mecanismos subyacentes que desencadenan cambios en la expresión génica en ratones envejecidos de tipo salvaje. Encontramos que en el hígado de 2 años, el 40% de las polimerasas de ARN que se alargan están estancadas, lo que reduce la transcripción productiva y sesga la producción transcripcional de una manera dependiente de la longitud del gen. Demostramos que este estrés transcripcional es causado por el daño endógeno del ADN y explica la mayoría de los cambios en la expresión génica en el envejecimiento en la mayoría de los órganos posmitóticos, lo que afecta específicamente las vías distintivas del envejecimiento, como la detección de nutrientes, la autofagia, la proteostasis, el metabolismo energético, la función inmune y el estrés celular. resiliencia. El estrés transcripcional relacionado con la edad se conserva evolutivamente desde los nematodos hasta los humanos. Por lo tanto, la acumulación de daño endógeno estocástico en el ADN durante el envejecimiento deteriora la transcripción basal, lo que establece el transcriptoma relacionado con la edad y provoca la disfunción de las principales vías distintivas del envejecimiento, revelando cómo el daño en el ADN subyace funcionalmente a los principales aspectos del envejecimiento normal.

El envejecimiento se caracteriza por un declive molecular, celular y fisiológico progresivo que da como resultado una reducción de la vitalidad, enfermedades relacionadas con la edad y un aumento de la mortalidad. Debido a que muchos procesos disminuyen o se alteran con la edad1, sorprendentemente se sabe poco sobre el estado funcional del proceso de transcripción basal en el envejecimiento. Los cerebros de ratas y moscas de la fruta envejecidas producen menos ARN mensajeros2,3 y la variación de célula a célula en la transcripción aumenta en varios tejidos4,5,6, mientras que la coordinación transcripcional de gen a gen disminuye con el envejecimiento7. Sin embargo, la transcripción en el envejecimiento se estudia principalmente en relación con los cambios en la expresión génica. La transcriptómica contribuyó significativamente a la identificación de numerosas vías y procesos celulares afectados por el envejecimiento8,9,10. Aunque parte de los cambios en la expresión génica específicos de órganos relacionados con la edad pueden explicarse por factores de transcripción, microARN11,12, composición alterada del tipo celular8,13 y cambios epigenéticos14,15, un metanálisis transcriptómico reciente indicó que la mayoría de las similitudes en la expresión génica entre los órganos de ratón no se pueden atribuir a estos mecanismos reguladores conocidos8.

La acumulación de daño en el ADN se ha postulado como una causa subyacente del envejecimiento normal16,17 y los fenotipos transcripcionales antes mencionados6,7,18,19, principalmente en base a las similitudes con las células expuestas a agentes que dañan el ADN o los trastornos de reparación del ADN por envejecimiento prematuro, como el síndrome de Cockayne y tricotiodistrofia. Estas condiciones tienen defectos en la reparación acoplada a la transcripción (TCR), lo que conduce a polimerasas de ARN estancadas en lesiones de ADN20, lo que sugiere que el daño del ADN que bloquea la transcripción también podría estar involucrado en el envejecimiento normal. Aunque las lesiones endógenas del ADN que bloquean la transcripción se acumulan en el envejecimiento normal21,22,23,24,25, actualmente no está claro si provocan respuestas transcripcionales significativas. En este estudio, analizamos la transcripción basal que subyace a los cambios en la expresión génica en ratones envejecidos normales de tipo salvaje (WT) utilizando un método de secuenciación de ARN naciente in vivo combinado con inmunoprecipitación de cromatina con ARN polimerasa II (RNAPII) seguida de secuenciación (ChIP-seq) y imágenes confocales. Revelamos una fuerte disminución transcripcional relacionada con la edad y un sesgo de la producción transcripcional mediante la acumulación de daño en el ADN como un fenotipo general de envejecimiento, lo que causa cambios de transcripción relacionados con la edad en general, que afectan particularmente las vías características del envejecimiento que determinan la duración de la vida.

Para investigar el proceso de transcripción en el envejecimiento normal, ratones macho WT adultos (15 semanas) y envejecidos (2 años) (n = 3 por grupo) recibieron una única inyección intraperitoneal con etinilo-uridina (EU), un análogo de uridina que se incorpora en ARN recién sintetizado in vivo26. Cinco horas después de la inyección, la tinción de fluorescencia de la UE reveló una señal de la UE reducida en 1,5 veces en hígados viejos (Fig. 1a). La disminución fue en todo el hígado, afectó a casi todos los hepatocitos y no se limitó a la poliploidización relacionada con la edad (Fig. 1b). Debido a que la reducción de la señal de la UE fue pannuclear, excepto por los nucléolos (Fig. 1a), lo que apunta a una transcripción dependiente de RNAPII reducida, probamos si los niveles más bajos de RNAPII podrían explicar la transcripción reducida. Sorprendentemente, la tinción por inmunofluorescencia de RNAPII utilizando las mismas muestras de hígado indicó un aumento de 1,4 veces, en lugar de una disminución en el hígado envejecido (Fig. 1c y Datos ampliados, Fig. 1a). El inicio de RNAPII y la pausa proximal del promotor marcada por la fosforilación de los residuos de serina 5 (ser5p) en el dominio C-terminal (CTD) no difirieron significativamente (Fig. 1d y Datos extendidos Fig. 1b), lo que sugiere que la actividad del promotor de RNAPII en todo el genoma permanece prácticamente inalterable con el envejecimiento. Sin embargo, el alargamiento de RNAPII marcado por la fosforilación de serina 2 CTD (ser2p) demostró un aumento de 1,5 veces (Fig. 1e y Datos extendidos Fig. 1c). Estos datos indican que la transcripción basal está alterada en el hígado envejecido.

a, ARN naciente marcado con UE (verde) en núcleos de hepatocitos (contratinción DAPI, azul) en hígado de ratón adulto (azul) y viejo (rojo). Derecha, intensidades de fluorescencia cuantificadas en diagramas de caja y bigotes. Las líneas centrales muestran las medianas, los límites de la caja marcan el IQR y los bigotes indican los valores mínimo y máximo. P = 2,1129 × 10−129 (prueba t no pareada bilateral). Núcleos contados: adulto n = 506; edad n = 500; n = 3 ratones por grupo. b, diagrama de dispersión XY de la intensidad de fluorescencia del ARN naciente marcado con UE (unidades arbitrarias (au)) y tamaños nucleares correspondientes medidos en hepatocitos individuales de hígado adulto (azul) y viejo (rojo) WT. c – e, RNAPII total (c), RNAPII fosforilado en ser5p (d) y RNAPII fosforilado en ser2p (e) tinción de inmunofluorescencia (rojo) en hepatocitos (contrateñido por DAPI, azul) en hígado adulto y viejo. Gráficos de caja y bigotes de intensidades de fluorescencia. Las líneas centrales muestran las medianas, los límites de la caja marcan el IQR y los bigotes indican los valores mínimo y máximo. Valores de p por prueba t no apareada de dos caras, n = 3 ratones por grupo. Núcleos contados y valores de P: c, adulto: n = 206; edad: n = 155, P = 6,64186 × 10−21; d, adulto n = 2926; edad n = 2643, P = 0,323195587; e, adulto n = 2697; edad n = 2.708. P = 0. Barra de escala, 50 μm. f, Diagrama de flujo del procedimiento experimental para la secuenciación de ARN naciente marcado con UE. g, Fracción (%) de lecturas EU-seq sintetizadas por diferentes ARN polimerasas. RNAPI–II y mtRNAP (izquierda) y RNAPIII (derecha), con lecturas de secuencia total de adultos y ancianos normalizados al 100 %. Los datos son la media ± sem n = 3 ratones por grupo. P = 0,012868073 (prueba t no pareada bilateral). h, Fracción (%) de lecturas EU-seq por RNAPII de regiones intrónicas y exónicas. Los datos son la media ± sem n = 3 ratones por grupo. P = 0,013520897 (prueba t no pareada bilateral).

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Para examinar estas observaciones aparentemente contradictorias de transcripción reducida y mayor abundancia de RNAPII, aislamos y secuenciamos selectivamente in vivo el ARN naciente marcado con UE (EU-seq), lo que dio como resultado una proporción significativamente mayor de lecturas intrónicas en comparación con la secuenciación del ARN total (Fig. 1f y datos extendidos Fig. 2a–c). Los experimentos de control apuntaron a densidades de incorporación de UE idénticas en hígados adultos y viejos (Datos extendidos Fig. 2d-g), descartando una menor captación de UE como explicación de la señal de UE más baja en el hígado viejo. A continuación, determinamos la contribución de cada ARN polimerasa al grupo de ARN celular naciente asignando lecturas a las especies de ARN transcritas por cada una de las diferentes polimerasas. Como era de esperar, la mayoría del ARN marcado con UE se originó a partir de RNAPII (Fig. 1g y Datos extendidos, Fig. 2h), la única ARN polimerasa que muestra una reducción significativa relacionada con la edad en la síntesis de ARN, como también se desprende de la disminución de aproximadamente 1,5 veces en Lecturas de secuencias derivadas de intrones (Fig. 1h). Como los eventos de empalme no se alteraron significativamente (Datos extendidos, Fig. 2i, j), la disparidad entre la síntesis de ARN de novo reducida y el aumento de RNAPII alargado sugiere una productividad de RNAPII específica más baja en el envejecimiento.

Para examinar más a fondo la discrepancia entre la abundancia y la transcripción de RNAPII, realizamos ChIP-seq usando anticuerpos contra RNAPII total, ser5p y ser2p de los mismos hígados descritos anteriormente. Primero investigamos si el silenciamiento del promotor en todo el genoma podría explicar la transcripción reducida. De acuerdo con los resultados de inmunofluorescencia (Fig. 1), la ocupación total y ser5p RNAPII en todo el genoma en los sitios de inicio transcripcional (TSS) en todos los genes no difirió significativamente en el envejecimiento (Fig. 2a, b). Además, la transición de RNAPII de promotor a elongación productiva no se alteró (Fig. 2c). Para evaluar el proceso de transcripción hacia la elongación temprana, medimos la producción de ARN naciente en todo el genoma en la primera kilobase medida en la primera kilobase de las regiones intrónicas (Fig. 2d) o del TSS (Fig. 2e). Observamos una correlación de casi 1:1 en la primera kilobase de la transcripción en todos los genes, lo que indica que la actividad promotora general que avanza efectivamente hacia la transcripción no ha cambiado en gran medida. Si bien la actividad promotora reducida en todo el genoma no pudo explicar el fenotipo de transcripción reducido, esperábamos una transcripción alterada por una actividad promotora más alta o más baja. Todos los genes expresados (n = 3970) que representan >90 % de la producción de ARN naciente dependiente de RNAPII se dividieron en 3 contenedores iguales desde su TSS hasta el sitio de terminación de la transcripción (TTS) y se mapearon las lecturas correspondientes del ARN naciente y de RNAPII ChIP-seq en cada contenedor se compararon entre hígado viejo y adulto. Mediante el análisis de agrupamiento, identificamos genes que se regularon transcripcionalmente al alza o a la baja en el envejecimiento en todos los contenedores tanto en el ARN naciente como en RNAPII ChIP-seq (Fig. 2f y Extended Data Fig. 3a-c), que reflejan la regulación del promotor. Para analizar si los genes regulados transcripcionalmente al alza (n = 778) o regulados a la baja (n = 394) son biológicamente relevantes para el envejecimiento, utilizamos la herramienta Enrichr para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)27,28 para comparar estas firmas genéticas con las publicadas. base de datos de perturbaciones de envejecimiento que contiene 34 perfiles de expresión de ARNm de hígado de ratón y 15 de hígado de rata. Las firmas genéticas reguladas al alza y a la baja transcripcionalmente se parecían mucho a los perfiles de envejecimiento del hígado de roedores publicados (Fig. 2g, h), lo que indica que los programas reguladores del promotor durante el envejecimiento se conservan en los estudios de transcriptómica. En resumen, la síntesis de ARN naciente aproximadamente 1,5 veces más baja en el hígado viejo no se debe a una actividad promotora reducida oa la transición de RNAPII a la elongación.

a, b, Abundancia total media de lectura de RNAPII y RNAPII ser5p ChIP-seq alrededor de TSS (TSS ± región de 750 pb) de todos los genes en hígados adultos (azul) y viejos (rojo). La línea gris representa el control de ADN de entrada ChIP–seq. c, diagrama de dispersión XY de la proporción de viajes de RNAPII de todos los genes expresados de hígado adulto (eje x) y viejo (eje y) en datos totales de RNAPII ChIP-seq. Cada punto representa un gen. Cada gen es el promedio de n = 3 ratones por grupo. d, e, diagrama de dispersión XY que representa la síntesis de ARN naciente el primer kb de intrones del TSS (d) o del TSS a 1 kb aguas abajo (e) de todos los genes en hígados adultos (eje y) y viejos (eje x). Cada punto representa un gen en el que la señal representa la media de n = 3 ratones. f, mapa de calor de tres contenedores de log2 cambios de pliegue (viejo/adulto) de ARN naciente (izquierda) y RNAPII total (derecha) en cuerpos de genes de grupos de genes regulados al alza y regulados al promotor. Cada fila representa un gen. g, h, Diagrama de barras que muestra la superposición entre todos los conjuntos de datos de envejecimiento de GSEA de ratones (g) o ratas (h) y los grupos regulados al alza y a la baja transcripcionalmente. La significancia y FDR para cada superposición se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher y la corrección de pruebas múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg. FDR < 0,05 definido como significativo.

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Una inspección minuciosa del mapa de calor de tres contenedores reveló un patrón consistente de disminución gradual de la transcripción naciente a través de contenedores sobre cuerpos genéticos en los genes regulados transcripcionalmente, mientras que los niveles de RNAPII mostraron la tendencia opuesta (Fig. 2f). Para evaluar la generalidad de este fenómeno, extendimos el mapa de calor de tres contenedores a todos los genes expresados ordenados según el grado de disminución transcripcional. Curiosamente, casi todos los genes experimentaron una disminución gradual de la transcripción en el hígado envejecido y, al mismo tiempo, aumentaron la ocupación de RNAPII en todos los cuerpos genéticos, revelando esto como un fenómeno de todo el genoma (Fig. 3a). Los genes regulados al alza por el promotor en el envejecimiento también exhibieron esta disminución transcripcional independiente de la regulación del promotor (Fig. 2f y Datos extendidos, Fig. 3b, c). Para cuantificar mejor el ARN naciente y el comportamiento de RNAPII alargado, todos los genes expresados se dividieron en 20 contenedores de TSS a TTS. Para excluir el mapeo de lecturas a TSS y TTS, solo analizamos los contenedores 2–19, que representan el alargamiento. Como era de esperar, observamos una disminución gradual general independiente de la edad en el ARN naciente en todos los cuerpos genéticos expresados (Fig. 3b), debido a la naturaleza direccional de la transcripción y secuenciación de moléculas de ARN naciente completas (en crecimiento) y no solo la huella RNAPII. Si bien la transcripción en la primera kilobase de los cuerpos genéticos es similar (Fig. 2d, e), la disminución en todos los genes fue significativamente más fuerte en el hígado viejo (Fig. 3b). Denominamos a este exceso de caída relacionado con la edad en la transcripción "pérdida gradual de la transcripción productiva" (GLPT). En contraste, los niveles de RNAPII total y ser2p aumentaron gradualmente en los cuerpos genéticos durante el envejecimiento (Fig. 3c, d), lo cual es consistente con la Fig. 1. La pérdida transcripcional durante el alargamiento proporciona una explicación para la transcripción reducida, que, paradójicamente, coincide con niveles crecientes de elongación de RNAPII.

a, mapa de calor de tres contenedores de cambios log2 (antiguo/adulto) de ARN naciente y ChIP-seq de RNAPII total en cuerpos de genes, ordenados por nivel de disminución transcripcional en todos los genes expresados. b – d, Densidades de secuenciación relativas de la fase de elongación de la transcripción entre TSS y TTS. b, Secuenciación de ARN naciente en hígado adulto (azul) y envejecido (rojo). c, Total RNAPII ChIP–seq en hígado adulto (azul) y envejecido (rojo). d, RNAPII-ser2p ChIP–seq en hígado adulto (azul) y envejecido (rojo). Todos los genes expresados; n = 3 ratones por grupo. Valores de p: prueba t de dos caras no apareada con 32 df Los datos se presentan como la media ± sem e,f, Porcentaje de cambio de densidad de lectura de secuenciación en la fase de elongación de la transcripción en el envejecimiento entre TSS y TTS de categorías de genes basadas en la longitud del gen genómico: EU-seq (e) y RNAPII ChIP–seq total (f). g, cambio de densidad de lectura de secuenciación porcentual (viejo/adulto) en EU-seq como se ve en la Fig. 2e, en el que el eje x es la longitud promedio del gen de cada categoría. h, diagrama de dispersión que representa todas las longitudes de genes expresadas> 20 kb (eje x) y el cambio porcentual entre viejo y adulto en las densidades EU-seq desde TSS hasta 20 kb aguas abajo (eje y) (n = 3308). i, Porcentaje estancado RNAPII en cuerpos genéticos. Los colores indican las clases de longitud de genes como en la Fig. 2e. Los datos son la media ± sd (10–22 kb: n = 662; 22–30 kb: n = 644; 30–50 kb: n = 788; 50–70 kb: n = 587; 70–110 kb: n = 643 y >110 kb: n = 646).

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Anteriormente, informamos la pérdida preferencial de la expresión de ARNm de genes largos en el hígado de roedores envejecidos y el hipocampo humano29, que luego también se observó en los fotorreceptores de la mosca de la fruta30 y el envejecimiento cerebral31,32. Por lo tanto, probamos si la longitud del gen está implicada en GLPT. Primero seleccionamos los genes de la Fig. 3b con la mayor disminución transcripcional relacionada con la edad. Estos genes GLPThigh (n = 914) fueron en promedio significativamente más largos en comparación con todos los genes expresados o genes regulados transcripcionalmente al alza o a la baja (Datos extendidos Fig. 3d). A continuación, agrupamos todos los genes expresados en seis clases de longitud de genes, cada una con un número similar de genes, y determinamos el porcentaje de cambio de ARN naciente y RNAPII en todo el cuerpo del gen en el envejecimiento. Este análisis reveló claras tendencias opuestas dependientes de la longitud del gen: disminución de la transcripción y aumento de la ocupación de RNAPII (Fig. 3e, f). Curiosamente, cuando trazamos la longitud media del gen de cada clase de genes frente al porcentaje de disminución transcripcional sobre los cuerpos genéticos, todas las clases exhibieron una regresión transcripcional lineal similar (Fig. 3g), con un promedio de aproximadamente 0.35% de pérdida por kilobase en hígado viejo. Como confirmación, la disminución transcripcional en los primeros 20 kb del TSS fue similar en todas las longitudes de genes (Fig. 3h). Debido a que los genes> 70 kb ya comprendían aproximadamente el 60% del grupo de ARN naciente dependiente de RNAPII (Datos extendidos Fig. 3e), los genes largos contribuyeron de manera desproporcionada a reducir los niveles de ARN naciente. La disminución en la síntesis de ARN de novo y el aumento de la abundancia de RNAPII en los cuerpos génicos implican tiempos de residencia más prolongados y una menor producción transcripcional de RNAPII. Al cuantificar la discordancia entre los niveles de ARN naciente y la ocupación total de RNAPII (Datos extendidos Fig. 3f), estimamos un RNAPII no productivo general aproximado del 40% en cuerpos genéticos en el hígado de 2 años de edad de una manera dependiente de la longitud del gen (Fig. 3i), lo que implica que están estancados. Suponiendo que los hepatocitos de ratón tienen una cantidad similar de moléculas RNAPII por célula que los fibroblastos humanos cultivados33, creemos que el hepatocito de ratón promedio de 2 años contiene en cualquier momento> 18,000 complejos RNAPII estancados durante la elongación (Datos extendidos Fig. 3g). En resumen, el envejecimiento del hígado se caracteriza por una pérdida de elongación de la transcripción en todo el genoma dependiente de la longitud del gen y un aumento del estancamiento de RNAPII.

Posteriormente, evaluamos si varios parámetros potenciales estaban correlacionados con el grado de GLPT para identificar un mecanismo que explicara el estancamiento de RNAPII. No encontramos diferencias significativas entre los genes GLPThigh y otras categorías de genes (regulados transcripcionalmente al alza y a la baja; resto) en el contenido de nucleótidos en los cuerpos de los genes, la tasa de error transcripcional, el empalme alternativo, la accesibilidad de la cromatina, las modificaciones de histonas asociadas con la eucromatina o los patrones de metilación del ADN, lo que apuntan a que los cambios epigenéticos son los responsables (Datos ampliados Figs. 4–6). Estos factores no se correlacionan con el grado de GLPT relacionado con la edad, que se espera cuando dicho factor está causalmente involucrado y, por lo tanto, no explican la disminución transcripcional observada.

En vista del estancamiento transcripcional dependiente de la longitud del gen, una explicación plausible es la acumulación de daño en el ADN que bloquea la transcripción porque los genes largos tienen una mayor probabilidad de adquirir lesiones estocásticas26,29. Por lo tanto, monitoreamos la síntesis de ARN de novo en los hígados de ratones Xpg-/-, que muestran muchas características de envejecimiento prematuro generalizado y una vida útil de 20 semanas debido a defectos en las vías de reparación del ADN TCR y reparación por escisión de nucleótidos del genoma global mediante la cual son incapaces de eliminar las lesiones que bloquean la transcripción34. Tanto la tinción EU como EU-seq a la edad de 7 y 14 semanas (Fig. 4a-c) revelaron una disminución pannuclear progresiva y dependiente de la edad en la transcripción. EU-seq en la reparación por escisión de nucleótidos del genoma global del envejecimiento prematuro y ratones Ercc1Δ/− defectuosos para TCR que muestran una patología de envejecimiento hepático más grave debido a un defecto adicional en la reparación de enlaces cruzados entre hebras35,36, que ya mostraban una pérdida de transcripción alta a los 4 años e incluso más a las 10 semanas (Fig. 4d), lo que muestra que el grado de disminución transcripcional, la deficiencia en la reparación del ADN y la gravedad de la patología hepática están correlacionados.

a, ARN naciente marcado con UE (verde) en núcleos hepáticos de ratones Xpg-/- de 7 y 14 semanas de edad en comparación con ratones WT de 7 semanas. b, Cuantificación del diagrama de caja y bigotes de la Fig. 4a. Las líneas centrales muestran las medianas, los límites de la caja marcan el IQR y los bigotes indican los valores mínimo y máximo. Valores de P: Xpg-/- de 7 semanas de edad versus WT P = 2,4688 × 10-285; Xpg-/- de 14 semanas de edad versus WT P = 0; prueba t no apareada bilateral, 3 ratones por grupo; núcleos contados n = 916, 864 y 738 para WT, Xpg-/- de 7 y 14 semanas. c, d, porcentaje de cambios en la densidad de lectura de EU-seq entre TSS y TTS en ratones Xpg-/- (c) y Ercc1Δ/- (d) en comparación con el envejecimiento del hígado WT (104 semanas, línea negra). e, Disminución porcentual en la producción de ARN naciente en MDF inactivos Xpg-/-, Ercc1Δ/- y WT después de 1, 2 y 4 semanas de cultivo en condiciones hipóxicas (3%) y normóxicas (20%). Los datos son los valores medios ± sd P (prueba t no pareada bilateral) son: semana 2: Ercc1Δ/− frente a WT: P = 0,002353336; semana 4, Xpg−/− frente a WT: P = 6,13324 × 10−9; Ercc1Δ/− frente a WT: P = 1,21727 × 10−9. Número de núcleos: 3% O2, semana 1: 14 Xpg-/- y 14 WT; 17 Ercc1Δ/− y 14 WT; semana 2: 15 Xpg-/- y 16 WT; 17 Ercc1Δ/− y 13 WT; semana 4: 29 Xpg-/- y 27 WT; 34 Ercc1Δ/− y 28 WT. f, Diagrama de caja y bigotes de ARN naciente marcado con UE fluorescente en MDF Ercc1Δ/− 24 h después de la irradiación UVC. Las líneas centrales muestran las medianas, los límites de la caja marcan el IQR y los bigotes indican los valores mínimo y máximo. Valores de P (prueba t no pareada bilateral): 2 J m−2 frente a 0 J m−2 = 5,66445 × 10−8; 4 J m−2 frente a 0 J m−2 = 2,92531 × 10−28; 6 J m−2 frente a 0 J m−2 = 5,59594 × 10−52. Núcleos contados: 0 J m−2, n = 146; 2 J m−2, n = 118; 4 J m−2, n = 132; 0 J m−2, n = 137. g, Porcentaje de densidades de lectura EU-seq de genes >110 kb del TSS a 10 kb aguas arriba en Ercc1Δ/− MDF 24 h después de la irradiación UVC en comparación con las células no irradiadas. Línea negra: clase de gen >110 kb a partir de datos de envejecimiento del hígado normal. h, sesgo (fracción) de lecturas de secuenciación asignadas a la hebra codificante durante el envejecimiento de WT a partir de datos totales de RNAPII y RNAPII-ser2p ChIP-seq en todos los genes (n = 3809), cortos (10–22 kb, n = 512) y más largos genes (>110 kb, n = 779). P < 0,0001, prueba t no pareada de dos caras en comparación con genes con una longitud de gen de 1 a 10 kb, 3 ratones por grupo. Los datos son la media ± sem i, sesgo (fracción) de las lecturas de secuenciación asignadas a la hebra codificante durante el envejecimiento de WT a partir de datos totales de RNAPII y RNAPII-ser2p ChIP–seq a través del cuerpo del gen (3 contenedores) en todos los genes y los genes más largos (> 110 kb, n = 779). Los datos son la media ± sem j, los perfiles de densidad de lectura de secuenciación del gen Ghr de EU-seq, el RNAPII total (todas las lecturas agregadas) y el RNAPII total dividido en la hebra de codificación y plantilla en el hígado adulto (azul) y envejecido (rojo) WT. k, ATM fosforilado (rojo) y γH2A.X (verde) en hígado de ratón adulto y anciano. Derecha, intensidades de fluorescencia mostradas como diagramas de caja y bigotes. Las líneas centrales muestran las medianas, los límites de la caja marcan el IQR y los bigotes indican los valores mínimo y máximo. P = 7.19752 × 10−27 (prueba t no pareada de dos caras). Núcleos contados: adulto n = 313; edad n = 315; n = 3 ratones por grupo. Barra de escala, 50 μm.

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Para examinar más a fondo el daño del ADN endógeno espontáneo como instigador de la disminución de la transcripción, cultivamos fibroblastos dérmicos de ratón (MDF) inactivos de ratones Xpg-/-, Ercc1Δ/- y WT durante 1, 2 y 4 semanas para permitir que se acumule el daño del ADN endógeno. La quietud evita la dilución de la lesión, que ocurre cuando las células proliferan. Curiosamente, los MDF Xpg-/- y Ercc1Δ/- demostraron una disminución dependiente del tiempo en la síntesis de ARN naciente cultivada con oxígeno al 20% (Fig. 4e). Los MDF cultivados al 3% de oxígeno no mostraron una transcripción significativamente reducida, lo que sugiere que el daño oxidativo del ADN es la causa de la pérdida de transcripción. A continuación, evaluamos el nivel de daño en el ADN que induce el mismo grado de disminución transcripcional que se observa en el hígado envejecido. Los MDF Ercc1Δ/− inactivos se expusieron a dosis crecientes de luz ultravioleta C (UVC), que induce cantidades conocidas de lesiones de ADN que bloquean la transcripción37. La tinción EU y EU-seq demostraron una disminución transcripcional dependiente de la dosis, en la que 2 J m−2 UVC, que corresponde a aproximadamente 1,6 lesiones bloqueadoras de la transcripción por 100 kb de ADN37, indujo niveles de transcripción 24 h después de la exposición UV similares a los hígados de Ratones WT de 2 años (Fig. 4f, g). Estos niveles de daño en combinación con una reducción de la transcripción del 0,35% por kilobase también explican por qué RNAPI, RNAPIII y RNAP mitocondrial (mtRNAP) no muestran una disminución significativa ya que sus especies de ARN diana son muy pequeñas.

Si una fracción significativa de la elongación de RNAPII en el envejecimiento se detiene debido a lesiones endógenas que bloquean la transcripción, se espera que durante el paso de amplificación de ADN específico de la cadena en el protocolo de la biblioteca RNAPII ChIP-seq, la lesión en la cadena de plantilla que realmente detiene el RNAPII también perjudican la amplificación del ADN de esa hebra, en contraste con la hebra (codificante) no dañada. Esto debería conducir a un sesgo de amplificación de cadena a favor de la cadena de codificación que se puede visualizar mediante ChIP-seq específica de cadena, como se muestra para las lesiones de bloqueo de la transcripción inducidas por UV38. Primero, confirmamos que el daño del ADN inducido por los rayos UV conduce a un sesgo de la cadena de codificación en nuestro protocolo ChIP-seq, que desapareció después de un tiempo de reparación (Datos extendidos Fig. 7a). Es importante destacar que, en hígados viejos, encontramos un sesgo de cadena de codificación dependiente de la longitud del gen relacionado con la edad en los conjuntos de datos totales y RNAPII-ser2p ChIP-seq (Fig. 4h). Las regiones con un alto sesgo de cadena de codificación tenían un estado de metilación del ADN local o un contenido de nucleótidos inalterados (datos extendidos Fig. 7b-f), lo que indica que las perturbaciones de bloqueo de la polimerasa están presentes en el ADN aislado y purificado de hígados envejecidos, identificándolos como ADN dañado . Además, el sesgo de la cadena de codificación relacionado con la edad aumentó hacia los extremos del gen, especialmente en los genes largos (Fig. 4i), lo que se correlaciona con el estancamiento de RNAPII en los cuerpos de los genes (Fig. 3) y el TCR es más activo al comienzo de los genes39. Un ejemplo es el gen del receptor de la hormona del crecimiento (Ghr), un gen de más de 265 kb de longitud con frecuencia regulado a la baja en hígados de edad avanzada en numerosos estudios independientes40, en ratones mutantes Xpg-/- y Ercc1Δ/-18,34 y en cultivos celulares expuestos a luz ultravioleta41 . Ghr demuestra un claro GLPT y una mayor abundancia de RNAPII en todo el cuerpo del gen. También notamos un cambio del 20% en las lecturas hacia la cadena de codificación en hígados envejecidos (Fig. 4j), lo que indica que la regulación negativa de Ghr es el resultado directo de lesiones que bloquean la transcripción. El estancamiento de RNAPII inducido por daños en el ADN provoca la fosforilación de ATM del punto de control de daños en el ADN no canónico en ausencia de roturas de ADN de doble cadena42, que también observamos en hígados envejecidos (Fig. 4k), lo que demuestra aún más el estrés transcripcional frecuente en el envejecimiento. Debido a que el alcance del sesgo de la cadena de codificación se corresponde con el nivel esperado cuando se extrapola de las células tratadas con UV38, nuestros datos revelan que las lesiones endógenas que bloquean la transcripción causan el estancamiento de RNAPII de una manera dependiente de la longitud del gen, que designamos estrés transcripcional relacionado con la edad.

Para evaluar la importancia funcional del estrés transcripcional, cuantificamos su efecto al nivel más relevante, el ARNm maduro. La pérdida transcripcional a través de los cuerpos genéticos afectó tanto a los intrones como a los exones, como lo ejemplifica el gen Igf1 (Fig. 5a,b), un regulador clave de la detección de nutrientes implicado en la salud y la determinación de la duración de la vida43,44, cuya expresión disminuye con la edad45,46. Como se esperaba, RNAPII se acumuló en el cuerpo del gen Igf1 de 79 kb. Curiosamente, el sesgo de la cadena de codificación no estaba presente en el primer tercio del cuerpo del gen que también se caracterizó por niveles normales o incluso más altos de ARN naciente y RNAPII, lo que indica que la disminución transcripcional se correlaciona con el sesgo de la cadena de codificación. Por lo tanto, el estrés transcripcional inducido por el daño del ADN y no el silenciamiento del promotor es el impulsor de la expresión más baja de IGF1 en el hígado envejecido. Para cuantificar las consecuencias del estrés transcripcional en los exones de todo el genoma, calculamos la pérdida del primero al último exón en el ARN naciente, que aumentó aproximadamente 1,5 veces con el envejecimiento en todos los genes expresados y dependía de la longitud del gen (Fig. 5c). Esto fue consistente con una menor producción de ARNm en el envejecimiento (Fig. 5d), proporcionando un mecanismo para la disminución del contenido de ARNm celular observado previamente durante el envejecimiento2,3. Esto implica una producción transcripcional decreciente y un sesgo de la expresión génica hacia genes pequeños durante el envejecimiento.

a,b, Perfiles de densidad de secuenciación de todo el gen Igf1 (mm10, chr10:87,858,265–87,937,047), incluido el sesgo de la cadena de codificación RNAPII (a) y exones solo (b) de EU-seq de adulto (azul) y anciano (rojo) Hígado de ratón WT. Los exones 1a y 1b son sitios de inicio alternativos. c, proporciones de densidad EU-seq entre el último y el primer exón para todos los genes expresados (P = 5.06731 × 10−9), genes cortos (10–22 kb) y largos (> 110 kb, P = 0.000482946). Los datos son la media ± sem Los valores P son de una prueba t no pareada bilateral (viejo versus adulto). d, Abundancia de transcripción completa (en relación con el adulto) estimada mediante lecturas que cubren 3'UTR de EU-seq de todos los genes expresados (P = 0,048761825), genes cortos (10–22 kb) y largos (>110 kb, P = 1,78654 × 10-6). Los datos son la media ± sem, los valores de P son de una prueba t no pareada bilateral. e, Vías sobrerrepresentadas significativas en genes TShigh por IPA, KEGG, Reactome y GSEA-marcas distintivas clasificadas por categoría de proceso principal (negrita). Los valores de P agregados se obtuvieron a partir de la prueba exacta de Fisher. Consulte la Tabla complementaria 2 para obtener información detallada sobre la ruta.

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Dado que el estrés transcripcional reduce y sesga la producción transcripcional, analizamos qué procesos y vías celulares eran más susceptibles. Seleccionamos genes con una pérdida transcripcional del primer al último exón de> 1.5 veces en el envejecimiento (n = 830), que representan genes con altos niveles de estrés transcripcional (TShigh), para un examen funcional. En particular, encontramos una superposición muy significativa con los perfiles generales de seis estudios independientes que representan ARNm regulados a la baja después del daño del ADN inducido por UVC (Tabla complementaria 1), lo que respalda aún más el vínculo entre las lesiones de ADN que bloquean la transcripción y el estrés transcripcional relacionado con la edad. El examen funcional identificó varias vías celulares significativamente sobrerrepresentadas previamente clasificadas como características del envejecimiento1 (Fig. 5e y Tabla complementaria 2), como las vías de detección de nutrientes IGF1, la insulina, la hormona del crecimiento y la señalización de mTOR, que se sabe que influyen en la duración de la vida1,44 . También se identificaron la autofagia, la respuesta de la proteína desplegada y la vía de estrés del retículo endoplásmico, lo que vincula el estrés transcripcional con la pérdida de proteostasis. Además, encontramos procesos metabólicos energéticos clave, como la fosforilación oxidativa y el metabolismo del piruvato, que se redujeron funcionalmente por el estrés transcripcional en los hígados de ratones Ercc1Δ/−26. Los procesos adicionales identificados incluyeron factores inmunitarios, metabolismo de ácidos grasos y la vía antioxidante NRF2, que están todos causalmente involucrados en la duración de la vida y/o enfermedades relacionadas con la edad47,48,49,50. En conclusión, el estrés transcripcional parece ser una causa crítica de la desregulación de las vías y procesos característicos del envejecimiento en ratones de envejecimiento WT.

Finalmente, abordamos si el estrés transcripcional se limita al hígado o también ocurre en otros órganos y especies. El conjunto de genes regulados al alza por el promotor contenía una firma de células B, lo que indica una infiltración de células B relacionada con la edad que también mostró estrés transcripcional (Fig. 2f). EU-seq de riñones de ratón de 2 años también mostró GLPT similar al hígado de ratón envejecido (Fig. 6a). A continuación, buscamos y volvimos a analizar conjuntos de datos públicos de envejecimiento de secuenciación de ARN total que contenían suficientes lecturas de mapeo de intrones que representan el ARN naciente. En dos conjuntos de datos extensos y adecuados, tendón humano envejecido51 y Caenorhabditis elegans52, descubrimos un GLPT similar al del hígado de ratón envejecido WT (Fig. 6a). Dado que la mayoría de los conjuntos de datos públicos se derivan de la secuenciación de ARNm, también usamos nuestro conjunto de genes TShigh para hacer coincidir todos los conjuntos de genes relacionados con la edad seleccionados (n = 198) en la biblioteca de perturbaciones del envejecimiento utilizando la herramienta Enrichr para GSEA. A modo de comparación, también se incluyeron conjuntos de genes regulados al alza y a la baja transcripcionalmente. Encontramos una presencia significativa de genes TShigh en el 65% de todos los conjuntos de datos de envejecimiento (Fig. 6b). Las firmas reguladas al alza o a la baja transcripcionalmente obtuvieron una puntuación mucho más baja (Fig. 6b), mientras que no se encontró superposición con seis conjuntos de genes aleatorios de tamaño similar, lo que indica que el estrés transcripcional es un impulsor principal de los cambios transcripcionales en los órganos que envejecen.

a, Porcentaje de cambios en la densidad de lectura de EU-seq del alargamiento de la transcripción entre TSS y TTS de genes expresados (distribución de 5 bins) en datos de EU-seq de hígado de ratón envejecido WT (negro, este estudio, n = 3 por grupo, n = 3,970 genes), riñón de ratón envejecido (n = 2 por grupo, n = 2135 genes, 7,5 semanas frente a 104 semanas, azul) y ARN-seq total de tendón humano (n = 4 por grupo, n = 773 genes, 69,5 ± 7,3 años versus 19 ± 5,8 años; marrón) y C. elegans (n = 3 por grupo, n = 2872 genes, día 10 versus día 1 después de la etapa de adulto joven; verde). Los datos son la media ± sem b, Diagrama de barras de la superposición entre los conjuntos de datos de envejecimiento de GSEA y TShigh, las clases de genes reguladas al alza y reguladas a la baja del promotor identificadas en nuestro estudio. La significación y la FDR se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher y el método de Benjamini-Hochberg. c, Proporción de enriquecimiento de genes (eje x) entre grupos de genes identificados y conjuntos de datos de envejecimiento de GSEA en tres especies: ratón (arriba), rata (medio) y humano (abajo); TShigh (izquierda), promotor regulado a la baja (centro) y promotor regulado al alza (derecha). El tamaño de punto representa la cantidad de conjuntos de datos de antigüedad GEO. Si estaba presente >1 conjunto de datos de un tejido, se muestran la media ± sd y el valor de P agregado (prueba exacta de Fisher).

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A continuación, visualizamos qué órganos y tejidos se enriquecieron significativamente. Para los órganos que tienen múltiples entradas en la base de datos, calculamos la superposición promedio y los valores de P agregados corregidos de la tasa de descubrimiento falso (FDR). Como se esperaba, los perfiles de ARNm de hígado relacionados con la edad de ratón y rata compartieron la mayor similitud con el conjunto de genes TShigh (Fig. 6c). De hecho, el estrés transcripcional fue un mecanismo más dominante que da forma al transcriptoma del envejecimiento hepático que la regulación de la transcripción por la actividad del promotor. Además, muchos otros órganos, como los riñones, el corazón, el tejido adiposo, la retina, los músculos, los pulmones, la neocorteza y la médula espinal, también aparecieron significativamente enriquecidos en genes propensos al estancamiento de RNAPII, lo que revela que muchos órganos exhiben estrés transcripcional relacionado con la edad, lo que explica la superposición. patrones de expresión génica y también tiene un mayor impacto en la expresión génica que la regulación del promotor relacionada con la edad. No todos los órganos mostraron una firma de estrés transcripcional de ARNm. Esto podría deberse a que nuestra lista de genes de consulta de estrés transcripcional está sesgada hacia genes específicos del hígado y/o que algunos órganos son menos propensos al estancamiento de la transcripción; esto último está de acuerdo con la naturaleza segmentaria del fenotipo de envejecimiento prematuro en los síndromes TCR y los ratones mutantes correspondientes34,36. Los tejidos proliferativos, por ejemplo, las células madre hematopoyéticas, la piel y el intestino parecían menos vulnerables, lo que puede explicarse por la capacidad de la replicación del ADN para resolver el RNAPII estancado en el daño del ADN, que protege las lesiones de la reparación por otros mecanismos20. Además, la división celular diluye el daño del ADN y también puede permitir la reparación. Por lo tanto, identificamos el estrés transcripcional como un factor principal que da forma a los transcriptomas relacionados con la edad y como un fenotipo de envejecimiento general en muchos tejidos y especies.

Este estudio proporciona evidencia de que el daño del ADN que bloquea la transcripción durante el envejecimiento normal causa un estancamiento frecuente de RNAPII que se alarga en todo el genoma, lo que conduce a una producción transcripcional reducida, dependiente de la longitud del gen, lo que resulta en la desregulación de muchas vías que se sabe que afectan el envejecimiento (Fig. 7). Con base en las similitudes de bloqueo de la transcripción en las células tratadas con UV38, estimamos que un RNAPII inicial bloqueado en una lesión bloqueará aproximadamente tres complejos RNAPII posteriores que causan colas. Los mecanismos subyacentes responsables de los cambios en la expresión génica relacionados con la edad han sido en gran medida esquivos y, a menudo, se cree que son el resultado de mecanismos reguladores activos, como la regulación del promotor8, también en modelos de ratones con envejecimiento prematuro mutante para la reparación del ADN17. Sin embargo, sugerimos que el estrés transcripcional pasivo por daño en el ADN en combinación con la arquitectura del gen, es decir, la longitud del gen, representa una fracción sustancial de estos cambios.

Modelo que describe el estancamiento de RNAPII por daño en el ADN y sus consecuencias en el envejecimiento.

Cada célula puede sufrir hasta 100 000 lesiones de ADN por día53, de las cuales la mayoría se reparan rápidamente mediante procesos de reparación dedicados. El daño del ADN como causa del envejecimiento se basa en gran medida en los síndromes de envejecimiento prematuro con inestabilidad genómica subyacente, como el síndrome de Cockayne defectuoso en TCR y la tricotiodistrofia, que muestran una vida corta y muchas características de envejecimiento prematuro predominantemente en los tejidos posmitóticos. Los modelos de ratón correspondientes34,35,54 muestran transcriptomas de ARNm que se superponen significativamente con ratones WT envejecidos18,19. Ahora mostramos que el estrés transcripcional pasivo, en lugar de la regulación génica activa, es responsable de dar forma al transcriptoma envejecido. Aunque no descartamos todas las razones putativas que explican el fenotipo de estrés transcripcional observado, identificamos un sesgo hacia la hebra no transcrita en los datos RNAPII ChIP-seq de hígados envejecidos WT, lo que indica que el daño del ADN que bloquea la transcripción en hebras de plantilla es la causa más probable de Estancamiento RNAPII. Aunque el daño del ADN se acumula durante el envejecimiento, hasta ahora no estaba claro si estos niveles son suficientes para provocar respuestas de envejecimiento en los organismos WT. Las lesiones bloqueadoras de la transcripción endógenas candidatas, los aldehídos21, los productos finales de la glicación avanzada22 y las ciclopurinas23,24,25, pueden acumularse en órganos envejecidos hasta niveles suficientes para explicar el estrés transcripcional observado. Por lo tanto, la acumulación de daño en el ADN endógeno y espontáneo, similar al síndrome de Cockayne progeroide y la tricotiodistrofia, causa estrés transcripcional en el envejecimiento normal.

Nuestros datos indican cómo el daño en el ADN provoca el envejecimiento a través del estrés transcripcional. El estrés transcripcional determina en gran medida los perfiles de expresión del envejecimiento en múltiples órganos que afectan la función de los órganos y, en particular, provoca la disfunción de muchas vías características del envejecimiento. Además, la naturaleza estocástica de las lesiones del ADN puede explicar el ruido transcripcional, que aumenta con el envejecimiento4,5,6. El estrés transcripcional podría afectar aún más el funcionamiento celular al promover la pérdida de la estequiometría del complejo proteico, un fenotipo observado en los killifish55 y C. elegans56 envejecidos. Además, la expresión desequilibrada de genes grandes y pequeños debido a lesiones que bloquean la transcripción en cultivos celulares puede inducir la muerte celular y se ha propuesto que es una señal de envejecimiento prematuro en el síndrome de Cockayne57. Finalmente, el propio estancamiento de RNAPII también es una señal directa del envejecimiento. La disección genética de TCR y los síndromes hereditarios correspondientes indica que las consecuencias moleculares de las mutaciones de TCR se correlacionan con la gravedad del envejecimiento prematuro20. Los defectos de TCR que bloquean permanentemente RNAPII en las lesiones de ADN conducen a formas más graves de envejecimiento acelerado que los defectos de reparación que aún permiten la accesibilidad de la lesión para otras vías de reparación20. Esto se demostró aún más en ratones mutantes con una mutación puntual en RNAPII que suprime la ubiquitinación inducida por daños en el ADN necesaria para eliminar el RNAPII estancado de una lesión de ADN, que mostró una vida útil reducida y un envejecimiento prematuro38. El RNAPII estancado en una lesión de ADN conduce a la formación del bucle R y la activación del punto de control de daños en el ADN ATM42, que puede inducir la muerte celular o la senescencia58, lo que proporciona un mecanismo por el cual el estancamiento de RNAPII conduce al envejecimiento. Los bucles R aumentan en los ojos de moscas de la fruta envejecidas, predominantemente en genes largos59, lo que proporciona una prueba más de este escenario. Mostramos que aproximadamente el 40% de todos los complejos RNAPII que se alargan se estancan por daño en el ADN en hígados envejecidos WT; por lo tanto, la señal de envejecimiento idéntica que causa los síndromes progeroides también ocurre en el envejecimiento normal. Curiosamente, los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer también mostraron una expresión reducida de genes largos en comparación con los controles de la misma edad60, lo que sugiere que la magnitud del estrés transcripcional está involucrada en la etiología de la enfermedad relacionada con la edad. Por el contrario, la restricción dietética de intervención que promueve la longevidad restaura la pérdida de expresión génica larga29, lo que indica que las intervenciones de longevidad pueden aliviar el estrés transcripcional. En conclusión, proponemos que la acumulación de lesiones endógenas en el ADN con la edad desencadena un estrés transcripcional que da forma a los perfiles de expresión génica relacionados con la edad en muchos órganos y tejidos, está presente a lo largo de amplias distancias evolutivas y puede explicar cómo la acumulación de daños en el ADN provoca un deterioro funcional, fortaleciendo así el sistema primario. papel del daño del ADN en el proceso de envejecimiento16,17.

El alojamiento y los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la Ley de bienestar animal del gobierno holandés, siguiendo la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con las pautas aprobadas por el Comité de ética holandés en total conformidad con la legislación europea. El comité ético institucional para el cuidado y uso de animales aprobó todos los protocolos con animales. Ratones macho WT (Mus musculus) en fondo híbrido F1 C57BL6J/FVB (1:1), fueron sacrificados a las 15 semanas y 104 semanas de edad. Las cepas WT C57BL6J y FVB se obtienen con frecuencia de Jackson Laboratories para mantener un antecedente genético estándar. Los modelos de ratones con envejecimiento prematuro y reparación de ADN deficientes que se generaron internamente y los compañeros de camada WT en antecedentes híbridos F1 C57BL6J/FVB (1:1) se sacrificaron a las 4 y 10 semanas para los mutantes Ercc1Δ/−35; y 7 y 14 semanas para los mutantes Xpg-/-34. Todos los animales se criaron y mantuvieron con gránulos sintéticos AIN93G (Research Diet Services; contenido bruto de energía 4,9 kcal g-1 de masa seca, energía digestible 3,97 kcal g-1). Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado (20–22 °C, ciclo de 12 h de luz: 12 h de oscuridad) y se alojaron individualmente en jaulas individuales ventiladas en condiciones específicas libres de patógenos en el Centro de Recursos Animales (Centro Médico de la Universidad Erasmus). No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los informados en publicaciones anteriores8,18,26,29,38,41. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas de las condiciones de los experimentos y no se aplicó la aleatorización de los animales a los grupos experimentales. Ningún animal fue excluido de los grupos experimentales en ningún análisis.

Para evaluar la síntesis de ARN de novo inducida por daños en el ADN endógeno, se aislaron MDF de Ercc1∆/−, Xpg−/− y WT (todos en antecedentes genéticos híbridos C57BL6J/FVB F1) de las colas de los modelos de ratón correspondientes y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FCS y 1% PS a 5% CO2 y 3% O2.

A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 5-EU (AXXORA) 0,088 mg por gramo de peso corporal. Cinco horas después de la inyección intraperitoneal, los ratones fueron sacrificados. Las muestras de tejido se fijaron con formalina para la tinción de fluorescencia o se congelaron instantáneamente para el aislamiento de ARN y los experimentos de ChIP.

Se cortaron rebanadas de 3 a 5 µm de piezas de hígado fijadas con formol e incluidas en parafina. Los cortes se montaron en portaobjetos de microscopio (Superfrost Ultra Plus Adhesion Slides, Thermo Fisher Scientific). Para la tinción con RNAPII, las muestras se desparafinizaron con xileno, se rehidrataron con un gradiente de alcohol y se lavaron con agua Milli-Q antes de la recuperación del antígeno (30 min en tampón de citrato, pH 6). Los anticuerpos utilizados fueron: anticuerpo Alexa Fluor 594-RPB1 (en dilución 1:250), que reconoce todas las formas de RNAPII independientemente del estado de fosforilación de su CTD (cat. no. 664908, BioLegend); RNAPII-ser2p (cat. n.º ab5095, Abcam); RNAPII-ser5p (cat. n.º ab5131, Abcam); fosfo-ATM (Ser1981, nº de cat. 4526, Tecnología de señalización celular); y fosfohistona H2A.X (Ser139, n.º de cat. 9718; tecnología de señalización celular), todo en una dilución de 1:500. Para reducir el nivel de fluorescencia de fondo, se utilizó un kit de detección de ratón sobre ratón (n.º de catálogo BMK-2202, Vector Laboratories). Las secciones se contrastaron con DAPI o Hoechst 33342.

Después de los pasos de eliminación de parafina basada en xileno y rehidratación (se omitió el paso de recuperación de antígeno para la tinción con UE), utilizamos el kit de imágenes Click-iT RNA Alexa Fluor 488 (n.º de cat. c10329; Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo de inmunofluorescencia estándar. . Las imágenes fueron tomadas por un sistema ZEISS LSM 700. La intensidad de tinción de ARN naciente se cuantificó calculando los valores de densidad integrados para cada tinción nuclear utilizando el software Fiji61. La significación estadística se calculó a partir de los valores de intensidad de fluorescencia normalizados usando una prueba t de Student no apareada en Prism versión 7.04 (Software GraphPad). Para la tinción de ARN naciente marcado con UE in vitro, las células se cultivaron en cubreobjetos. En placas de crecimiento confluentes, el medio se reemplazó con medio nuevo complementado con FCS al 1 % y (cuando se indicó) se movió a O2 al 20 % durante el tiempo indicado. El medio se renovó dos veces por semana. Para medir la síntesis de ARN de novo después del tratamiento con UVC, se cultivaron Ercc1∆/- y WT MDF (ambos con fondo híbrido C57BL6J/FVB F1) hasta la confluencia y se mantuvieron como se describió anteriormente seguido de irradiación con UVC (0, 2, 4 y 6 J m- 2 UVC) utilizando una lámpara germicida de 254 nm (Philips). Los ensayos se realizaron 24 h más tarde para permitir que los MDF se recuperaran de los efectos transcripcionales inmediatos en trans. Para evaluar su nivel transcripcional, se añadió EU 1 mM al medio durante 1 h antes de la recolección de células para la extracción de ARN total o se fijó para la tinción de fluorescencia. Las células se lavaron con solución salina tamponada con tris (TBS) enfriada con hielo y se fijaron durante 20 min en hielo en formalina al 4%. Posteriormente, las células se lavaron en albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en TBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en TBS durante 20 min a temperatura ambiente. Luego, los cubreobjetos se lavaron dos veces con BSA al 3 % en TBS y se incubaron con la mezcla de reacción Click-iT (Invitrogen) durante 30 min. Después de la reacción Click-iT, las células se lavaron una vez con BSA al 3 % en TBS y una vez con TBS antes de incubarlas en TBS que contenía Hoechst 33342 1:1000 durante 30 min. Las muestras se montaron utilizando Prolong Diamond (Invitrogen). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio LSM700 ZEISS y la intensidad de la tinción de UE en los núcleos se cuantificó con Fiji (Imagen J 1.53q).

El ARN total se aisló de cortes de hígado y riñón ultracongelados o de células raspadas utilizando el kit miRNeasy (QIAGEN), incluido el paso de DNasa en columna (Conjunto de DNasa libre de RNasa, QIAGEN). La calidad y la cantidad de ARN se estimaron con el Bioanalyzer (Agilent Technologies) y solo se utilizó ARN de alta calidad (número de integridad de ARN >8) para análisis posteriores. La secuenciación del ARN total se realizó como se describe en otra parte62. Para aislar selectivamente el ARN naciente marcado con UE, utilizamos el kit de captura de ARN naciente Click-iT (n.º de cat. c10365, Thermo Fisher Scientific): la azida de biotina se unió a los grupos de etileno del ARN marcado con UE utilizando la química Click-iT . El ARN naciente marcado con UE se purificó utilizando perlas magnéticas MyOne Streptavidin T1. El ARN-EU capturado unido a perlas de estreptavidina se sometió inmediatamente a la generación de bibliotecas de secuenciación en perlas utilizando el kit de preparación de muestras de ARNm TruSeq v2 (Illumina) de acuerdo con los protocolos del fabricante con modificaciones. Se saltaron los primeros pasos del protocolo; El ADN complementario (ADNc) directamente en las perlas se sintetizó mediante transcriptasa inversa (Super-Script II) utilizando cebadores hexámeros aleatorios. A continuación, los fragmentos de cDNA se hicieron romos a través de una reacción de reparación de extremos, seguida de colas dA. Posteriormente, se ligaron adaptadores con código de barras de doble cadena específicos y se realizó la amplificación de la biblioteca durante 15 ciclos. Las bibliotecas de PCR se limpiaron, se midieron en un Agilent Bioanalyzer usando el ensayo DNA1000, se agruparon en concentraciones iguales y se secuenciaron por tres en un carril en un HiSeq 2500.

Se picó hígado ultracongelado en PBS enfriado con hielo, se homogeneizó en un homogeneizador Dounce y se filtró a través de un colador de células (Falcon). Después de agregar formaldehído (total 1%), el homogeneizado se agitó en hielo durante 10 minutos y se inactivó con glicina. El homogeneizado granulado se lavó con PBS helado, se resuspendió en tampón de lisis celular (0,25 % Triton X-100, EDTA 10 mM, EGTA 0,5 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0, sin EDTA completo y PhosSTOP, Sigma-Aldrich) y incubado durante 10 min en hielo. Las muestras se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis de núcleos (NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0, sin EDTA completo y PhosSTOP). Las muestras se homogeneizaron adicionalmente con un homogeneizador Dounce y se incubaron en hielo durante 10 min. La fracción nuclear se resuspendió en tampón de sonicación (HEPES 50 mM, pH 7,8, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,1 %, dodecilsulfato de sodio al 1 %, libre de EDTA completo y PhosSTOP). La cromatina se sonicó con un sonicador Bioruptor (Diagenode) en fragmentos de 100 a 500 pb y se centrifugó para eliminar los restos celulares restantes. Del sobrenadante, se usaron 15 µg de cromatina para una ronda de inmunoprecipitación. Para ChIP-seq, se agruparon cinco muestras. Se utilizaron perlas Dynabeads M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG para el paso de inmunoprecipitación. Las muestras de cromatina se preaclararon con perlas a 4 °C, durante 2 h. Las muestras de cromatina previamente aclaradas se rotaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos RNAPII: RNAPII-ser2p, RNAPII-ser5p o anticuerpo específico RNAPII RPB1-NTD (clon D8L4Y, Cell Signaling Technology). Se agregaron Dynabeads durante 2 h a las muestras para reducir los complejos proteína-ADN. Después de la inmunoprecipitación, las muestras se lavaron dos veces con los siguientes tampones: tampón de sonicación, dos veces con tampón A (HEPES 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,1 %, SDS al 0,1 %). , sin EDTA completo y PhosSTOP), dos veces con tampón B (Tris 20 mM, pH 8, EDTA 1 mM, LiCl 250 mM, NP-40 al 0,5 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, sin EDTA completo y PhosSTOP) y finalmente dos veces con tampón Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM). La fracción unida de la cromatina se aisló utilizando el kit IPURE DNA recovery for ChIP (Diagenode). Las bibliotecas de secuenciación se generaron con el kit de preparación de bibliotecas Illumina TruSeq ChIP. Las muestras se secuenciaron en la plataforma HiSeq 4000.

Las lecturas de EU-seq se preprocesaron con el software de control de calidad FastQC v.0.11.9, FastQScreen v.0.14.0 y Trimmomatic v.0.35 (ref. 63) usando los parámetros: SLIDINGWINDOW:4:15 LEADING:3 TRAILING:3 ILLUMINACLIP :adapter.fa:2:30:10 LÍDER:3 FINAL:3 MINELEN:36. Las lecturas restantes se alinearon sucesivamente con el ADN ribosómico del ratón (BK000964.3), las secuencias mitocondriales (UCSC, mm10) y el genoma de referencia del ratón (GRCm38/mm10) utilizando Tophat2 v.2.0.9 (ref. 64) con la configuración predeterminada excepto para la opción -g 1. Las lecturas de ChIP-seq se alinearon con el genoma de referencia del ratón mm10 utilizando Bowtie65 v.2.1.0. El conjunto de datos de RNA-seq total público aplicó el mismo algoritmo de mapeo con EU-seq usando el genoma de referencia correspondiente (hg19 y ce10) para estudiar la dinámica del RNA naciente en el envejecimiento entre especies. El mismo algoritmo de mapeo que se usó con ChIP-seq se aplicó a los otros datos públicos.

Todos los genes, exones e intrones de RefSeq (versión: 95) se extrajeron del UCSC Genome Browser66 y las listas de genes se colapsaron en la transcripción más larga de cada gen. Se eliminaron los genes con regiones que se solapaban con otro gen codificante o no codificante. Por lo tanto, los genes que tienen solo regiones únicas para un gen RefSeq específico se usaron para análisis posteriores. En algunos experimentos, como se indica en este estudio, regiones genómicas específicas (desde TSS hasta 1 kb aguas abajo; regiones intrónicas únicamente; desde TSS hasta 20 kb aguas abajo; 3′UTR; primer y último exón de genes expresados; alrededor de la región TSS (−0,75 kb a +0,75 kb y -0,3 kb a +0,3 kb) se generaron de la misma manera. Para investigar el proceso de elongación productiva por gen, las regiones genómicas alrededor del TSS y TTS de los genes se dividieron en k contenedores proporcionales (k = 20 por defecto ; debido a la calidad de los datos en diferentes conjuntos de datos, la cantidad de contenedores varía (detalles a continuación)). Los genes con una longitud inferior a 10 kb se eliminaron del estudio para evitar demasiadas lecturas mapeadas en contenedores superpuestos de genes cortos en el análisis de elongación proporcional de genes .

Se creó una canalización de Python (K_bining.py) que toma lecturas alineadas de RNA/EU/ChIP–seq en formato BAM/BW como entrada para cuantificar las lecturas en la región de alargamiento de la transcripción de los genes y se realizó HTSeq para la cuantificación de lectura en las regiones genómicas antes mencionadas. . Se aplicaron lecturas por millón (RPM) para normalizar diferentes bibliotecas de secuenciación para excluir la variación técnica (especialmente la profundidad de secuenciación) en estudios posteriores. El conjunto de genes 'todos los genes' comprende todos los genes con al menos un mapeo de lectura en la primera kilobase. Se construyó un conjunto de genes con genes que tienen al menos 1 RPM en cada uno de los 20 contenedores y se denominó "todos los genes expresados". Para estudiar la distribución de lectura en los cuerpos genéticos y debido a la profundidad de la secuencia y la calidad de los datos, se seleccionó un número diferente de contenedores (k) y el número de todos los genes expresados (n) para cada conjunto de datos de ARN total público y EU-seq. Por lo tanto, el conjunto de "todos los genes expresados" en el envejecimiento WT contiene: n = 3970 genes y se dividieron en k = 20 contenedores (> 90% de todas las lecturas EU-seq se asignan a estos genes). ratones Ercc1Δ/− (k = 20, n = 2430); ratones Xpg-/- (k = 20, n = 3842); MDF Ercc1Δ/− tratados con UV (k = 10, n = 1974); Riñón envejecido WT (k = 20, n = 2135); tendón humano (k = 5, n = 773); C. elegans (k = 5, n = 2872). Para hacer coincidir los datos EU-seq de envejecimiento de WT con los datos RNAPII ChIP-seq correspondientes (generados a partir del mismo hígado), los genes correspondientes del conjunto de genes 'todos los genes expresados' también se seleccionaron en los conjuntos de datos RNAPII ChIP-seq. El fondo específico dentro de la muestra se determinó calculando las lecturas en las regiones intergénicas y se eliminó proporcionalmente. La señal de fondo general se restó utilizando las muestras de entrada de ADN. Para definir biológicamente los 'todos los genes expresados' (n = 3970) en el envejecimiento WT, realizamos un análisis de agrupamiento de k-media combinado con EU-seq y lecturas totales de ChIP-seq entre muestras adultas y antiguas. Según el criterio descrito en Datos extendidos Fig. 3a, definimos los cuatro patrones principales encontrados en el análisis de conglomerados de k-media como cuatro grupos biológicos: genes regulados al alza por el promotor, n = 778 (el nivel de EU-seq y RNAPII ChIP-seq aumentó en tres papeleras); genes regulados negativamente por el promotor, n = 394 (el nivel de EU-seq y RNAPII ChIP-seq disminuyó en tres contenedores); Genes GLPThigh, n = 914 (disminución progresiva del nivel EU-seq pronunciado, aumento pronunciado del nivel RNAPII ChIP-seq en tres contenedores); genes restantes, n = 1,884 (disminución progresiva del nivel leve de EU-seq, aumento leve de RNAPII ChIP-seq en tres contenedores). Para estudiar la relación entre la longitud del gen y el fenotipo de estrés transcripcional, los genes expresados (n = 3970) en ratones WT se dividieron en seis grupos según su longitud, cada uno con un número similar de genes: 10–22 kb (n = 662, media = 16,47 kb, mediana = 16,75 kb); 22–30 kb (n = 644, promedio = 26,87 kb, mediana = 26,94 kb); 30–50 kb (n = 788, promedio = 40,19 kb, mediana = 39,68 kb); 50–70 kb (n = 587, promedio = 59,18 kb, mediana = 59,02 kb); 70–110 kb (n = 643, promedio = 87,93 kb, mediana = 86,75 kb) y >110 kb (n = 646, promedio = 199,47 kb, mediana = 160 kb). En las cifras que miden el comportamiento de la clase de genes, primero calculamos la señal promedio por gen de n = 3 ratones, seguido de un promedio de la señal para todos los genes en la clase de genes.

Los análisis de ontología génica y agrupamiento funcional de genes TShigh se realizaron mediante el uso de múltiples bases de datos y software: Ingenuity Pathway Analysis, GSEA v.4.2.2 que también incluye la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG), Reactome Pathway Databases, Aging Perturbations de GEO y los conjuntos de datos inactivos de Enrichr27,28,67,68. Los conjuntos de datos en Perturbaciones de envejecimiento de GEO y los conjuntos de datos de Enrichr solo se incluyeron si joven/adulto> 8 semanas, mayor de 14 meses y la diferencia de edad entre jóvenes/adultos y órganos envejecidos es> 6 meses (ratón, rata); la edad humana es >56 años con al menos una diferencia de edad de >12 años. Adoptamos un umbral FDR < 0,05. Los valores de P agregados para los principales procesos biológicos identificados se calcularon combinando los valores de P de las subvías detectadas correspondientes utilizando la prueba exacta de Fisher.

La proporción de viajes de RNAPII es la proporción entre RNAPII en el TSS y RNAPII en el cuerpo del primer gen de 1 kb en personas mayores y adultas. El valor de densidad total de RNAPII alrededor del TSS (± 300 pb) se dividió por el valor de densidad total de RNAPII en el primer cuerpo del gen de 1 kb medido desde 300 pb aguas abajo del TSS para cada gen. Para comparar la síntesis de ARN naciente de la primera región de 1 kb de los primeros intrones o del TSS a 1 kb aguas abajo de todos los genes entre hígados de ratones adultos y viejos, todos los conjuntos de datos solo se normalizaron en función de la profundidad de lectura de secuenciación, sin corregir aproximadamente Reducción de 1,5 veces en el número de secuencias intrónicas en hígado envejecido. Para medir el alargamiento de la transcripción productiva, todos los genes expresados se dividieron en k contenedores proporcionales, donde se calcularon los recuentos de lectura promedio del conjunto de datos EU-seq y RNAPII ChIP-seq. Los recuentos se normalizaron posteriormente al primer contenedor y se representaron gráficamente. Los cambios de densidad porcentual por contenedor se calcularon mediante: viejo (recuento de lecturas) / adulto (recuento de lecturas) × 100 %. Dado que el primer y el último contenedor incluyen la señal en el TSS en el que está presente la pausa proximal del promotor RNAPII, y el TTS en el que se acumula RNAPII, definimos los 18 contenedores centrales como la fase de elongación de la transcripción. El mapa de calor de 3 bins se deriva de los datos de 18 bins mediante la agregación de 6 bins subsiguientes y el cálculo de cambios log2 veces de cada gen entre muestras viejas y adultas para lecturas de EU-seq y RNAPII ChIP-seq total. Para determinar el aumento del porcentaje de estancamiento de RNAPII o RNAPII improductivo en hígados envejecidos (Datos extendidos Fig. 3f), asumimos una línea de base en hígados adultos en los que el nivel de ARN naciente total en la fase de elongación (18 contenedores) es el resultado del RNAPII total niveles en la fase de elongación (18 bins). La relación media entre n = 3 ratones se establece como línea de base. Dado que hay un aumento en los niveles de RNAPII y una reducción en los niveles de ARN naciente en todo el cuerpo del gen en el hígado envejecido, se calculó el número esperado de lecturas totales de RNAPII ChIP-seq que deberían respaldar estos niveles de ARN naciente en función de la línea de base del hígado adulto, que es decir, la relación entre los recuentos de lectura de EU-seq y los recuentos totales de lectura de RNAPII ChIP–seq en la fase de elongación (18 contenedores). Posteriormente, se determinó el recuento total observado de lecturas RNAPII ChIP-seq por muestra en cada muestra de hígado envejecido. Luego, restamos el conteo total esperado de lecturas RNAPII ChIP-seq del conteo total observado de lecturas RNAPII ChIP-seq y lo dividimos por el conteo esperado de lecturas en hígado envejecido: estancamiento RNAPII en el envejecimiento (%) = (recuento observado de lecturas RNAPII − esperado Recuento de lecturas de RNAPII) / Recuento de lecturas de RNAPII esperado × 100 %. Para analizar la composición de nucleótidos, los 50 genes superiores de GLPThigh y los 50 inferiores de los genes restantes se seleccionaron dentro del rango de longitud de 70–110 kb y se dividieron en 35 contenedores de TSS a TSS + 70 kb (2 kb por contenedor). El porcentaje de composición de nucleótidos (citidina, timina, adenina y guanina) se determinó mediante Qualimap v.2.21 (ref. 69). La proporción de errores de transcripción en los conjuntos de datos EU-seq se calculó utilizando BioConductor seqTools (R v.1.2.0. y paquetes IRanges)70. Las tasas de error totales se calcularon como el porcentaje de lecturas totales con una base no coincidente en cada posición de lectura durante el paso de alineación. El análisis de la abundancia de lecturas de EU-seq en los sitios donantes y aceptores de empalme se llevó a cabo utilizando un script personalizado: Splicingdonor&acceptorfinder.py en el que los valores de expresión de ±49 pb alrededor del sitio donante y aceptor de empalme para todos los genes seleccionados fueron capturados por el HTSeq v.0.6.0. Astalavista v.4.0 (ref. 71) detectó eventos de empalme alternativo con la configuración predeterminada. El estado de metilación del ADN fue detectado por Qualimap v.2.21 y deepTools v.2.0 (ref. 72). Los perfiles promedio de RNAPII en los promotores (±750 pb alrededor del TSS) y los perfiles promedio de modificación de histonas (H3K27ac, H3K4me3 y metilación del ADN) en el TSS y los cuerpos genéticos se trazaron utilizando el software HOMER v.4.11 (comando annotatePeak.pl)73.

Para calcular el número de RNAPII detenido en una lesión en comparación con la cola detrás del RNAPII inicialmente detenido, primero estimamos el número de lesiones de ADN en nuestro conjunto de datos de genes expresados, que tiene una longitud total de 280 010 046 pb. Con una densidad de lesión de 1,6 por 100.000 pb en un genoma diploide, esperamos aproximadamente 8.960 lesiones de ADN. Dado que las lesiones de ADN se producen por igual tanto en la cadena de codificación como en la plantilla, y esta última solo es importante para el estancamiento de RNAPII, hay 4.480 lesiones de ADN en la cadena de plantilla del conjunto de genes seleccionado. Si asumimos que todas las lesiones de ADN obstruyen un complejo RNAPII y tenemos un estimado de 18 000 complejos RNAPII estancados por célula, estimamos que por cada RNAPII estancado en una lesión de ADN hay tres complejos RNAPII en cola. El análisis de sesgo de cadena en los datos de RNAPII ChIP-seq se realizó como se describe en otra parte38, que se basa en la observación de que la amplificación por PCR de las bibliotecas de RNAPII ChIP-seq está sesgada hacia la cadena de codificación si hay una lesión de ADN que bloquea la transcripción en la plantilla. hebra en la que está estancado RNAPII, con algunas modificaciones. Primero monitoreamos si nuestro protocolo ChIP-seq específico podía detectar el sesgo de la hebra y optimizamos el análisis utilizando nuestros datos RNAPII ChIP-seq publicados previamente después del tratamiento con UVB74. En resumen, las lecturas directas e inversas de RNAPII ChIP–seq fueron separadas y procesadas por SAMtools v.1.9 (ref. 75) y contadas por BEDtools v.2.27.1 (ref. 76). Para cada gen en el conjunto de genes seleccionado, primero corregimos la orientación de la cadena molde (cadena directa/inversa) porque los genes están ubicados tanto en la cadena directa como en la inversa. Luego, calculamos para cada gen en el conjunto de datos el sesgo de fracción hacia la cadena de codificación y, posteriormente, se calculó el sesgo de cadena en todos los genes expresados en el conjunto de genes.

Los experimentos in vitro se basan en triplicados de experimentos independientes y las gráficas se presentan como medias, a menos que se indique lo contrario. Los detalles de las pruebas estadísticas y cuantificaciones utilizadas en este estudio se describen en las partes correspondientes del texto principal, leyendas de figuras o Métodos. Se asumió que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con Prism o los paquetes o funciones implementados en R (edgeRpackage y funciones fisher.test) excepto el análisis de enriquecimiento con GSEA, Enrichr e Ingenuity Pathway Analysis, que fueron realizados y descritos detalladamente en sus aplicaciones web.

Se generó un marco estadístico y probabilístico para la incorporación a la UE para un rango de distancias entre las moléculas de la UE, y en el caso de una reducción de 1,5 veces para un rango de diferencias de distancia de incorporación a la UE. La probabilidad de que al menos una UE se incorpore al ARN naciente se modeló en la situación en la que hay una reducción de 1,5 veces en la incorporación de UE en hígados de ratones viejos debido a una absorción o procesamiento más bajo o más lento. Los supuestos fueron: (1) como hay al menos un excedente de biotina >400 veces por cada EU incorporado en el ARN naciente en la reacción Click-iT, la reacción está saturada o sigue la misma asíntota; (2) solo una incorporación de UE por molécula de ARN es suficiente para aislar esa molécula específica; (3) La incorporación de la UE es un proceso estocástico en el que la concentración de UE disponible en el grupo total de nucleótidos se correlaciona linealmente con la distancia entre las moléculas de UE en los ARN nacientes. Si hay una diferencia de disponibilidad de UE entre ratones adultos y viejos, se espera que en especies de ARN corto (≤300 nucleótidos) la probabilidad de al menos una incorporación de UE sea significativamente menor y, por lo tanto, observaríamos empíricamente un porcentaje más bajo de mapeo de lectura de secuencia para especies de ARN tan pequeñas en el hígado envejecido. El proceso de incorporación a la UE se modeló en especies de ARN nacientes mediante un proceso de Poisson. Específicamente, uno puede pensar en el número de incorporaciones de UE en el ARN naciente como un proceso de Poisson no en el tiempo, como se usa generalmente, sino en la longitud medida en nucleótidos. Matemáticamente, si X(t) es un proceso de Poisson, entonces la probabilidad de que no haya ningún evento en un intervalo de tiempo (0,t) es exp(-λt) donde λ es la intensidad del proceso de Poisson. Igualmente, la probabilidad de que haya al menos un evento en el intervalo de tiempo (0,t) es entonces 1 − exp(-λt). Para cada especie de ARN en nuestras clases de longitud de ARN especificadas identificadas en los conjuntos de datos EU-seq, la probabilidad de que se haya incorporado al menos una UE se calculó posteriormente utilizando la fórmula anterior. Claramente, dado que \(1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over x}}} > 1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over y} }}\) para todo x < y, los procesos de Poisson con mayor intensidad exhibirán necesariamente una mayor probabilidad de que se haya incorporado al menos un EU que los procesos de Poisson de menor intensidad. Se examinaron tres grupos de especies de ARN: (1) ≤300 nucleótidos (número de especies de ARN n = 7932); (2) entre 1000 y 3000 nucleótidos (número de especies de ARN, n = 1983); y (3) entre 2000 y 4000 nucleótidos (número de especies, n = 1802). El número de especies de ARN refleja el número total presente en la base de datos del genoma de Mus musculus (Ensembl). Las dos últimas clases, aunque siguen representando especies de ARN corto, se incorporan como un control positivo en el que no se espera una diferencia, si hay 1,5 veces menos UE disponible. En todos los casos, los vectores de probabilidad no eran gaussianos según lo calculado por la prueba de Kolmogorov-Smirnov; así, para cada intensidad fija del proceso de Poisson subyacente, se calculan la mediana y el rango intercuartílico (RIC) de la probabilidad de que se incorpore al menos una UE. La significación entre intensidades separadas por 1,5 veces se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de EU-seq y ChIP-seq se han depositado en el sitio web NCBI Sequence Read Archive y están disponibles públicamente (número de acceso PRJNA603447). Las imágenes de microscopía que se informan en este documento serán compartidas por el contacto principal a pedido razonable. Se volvieron a analizar varios conjuntos de datos públicos, incluidos: datos totales de ARN-seq del tendón humano51 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2449/) y Caenorhabditis elegans52 (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA357503) para la Fig. 6a, metilación del ADN (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE95361)77 , histonas H3K27ac y H3K4me3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA281127) para datos extendidos Figs. 5 y 6, datos de MNase-seq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58005)78 y RNAPII ChIP–seq de células irradiadas con UVB (https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA230028) para datos extendidos Fig. 7a. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todo el software utilizado en este estudio está publicado y citado en el texto principal o en Métodos. Todo el código original se ha depositado en: https://github.com/Pothof-Lab/Transcriptional-Stress. Los enfoques de análisis de datos que utilizan paquetes de software publicados se describen en los Métodos.

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Agradecemos a M. Tresini, G. Garinis, P. Mastroberardino y C. Milanese por proporcionar reactivos y protocolos. Damos las gracias a Y. van Loon y W. Vermeij de asistencia general con experimentos con ratones. Damos las gracias a P. van Arp para el apoyo de secuenciación de ARN. La secuenciación del ARN se realizó en las instalaciones de ErasmusMC HuGeF dirigidas por AG Uitterlinden y J. van Meurs y las instalaciones de ErasmusMC Biomics dirigidas por W. van Ijcken. RNAPII ChIP–seq fue realizado por la plataforma GenomEast, miembro del consorcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009). Agradecemos el apoyo financiero de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Envejecimiento (P01 AG017242; reparación de ADN, mutaciones y envejecimiento celular) a JHJH y JP, European Research Council Advanced Grant Dam2Age a JHJH, la dirección ITN de la UE de la Comisión Europea (GA- 316390) a JHJH, organización de investigación holandesa ZonMW Memorabel project no. 733050810 a JP y JHJH, Deutsche Forschungsgemeinschaft (Fundación Alemana de Investigación) proyecto no. 73111208-SFB829 a JHJH y el Programa Conjunto Europeo sobre Enfermedades Raras (EJPRD TC-NER) a JHJH Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Akos Gyenis, Jiang Chang.

Departamento de Genética Molecular, Instituto del Cáncer Erasmus MC, Centro Médico de la Universidad Erasmus, Róterdam, Países Bajos

Akos Gyenis, Jiang Chang, Joris JPG Demmers, Serena T. Bruens, Sander Barnhoorn, Renata MC Brandt, Marjolein P. Baar, Marko Raseta, Kasper WJ Derks, Jan HJ Hoeijmakers y Joris Pothof

Universidad de Colonia, Facultad de Medicina, Grupo de Excelencia para la Investigación del Envejecimiento, Instituto para la Estabilidad del Genoma en el Envejecimiento y las Enfermedades, Colonia, Alemania

Akos Gyenis y Jan HJ Hoeijmakers

Centro de Medicina Molecular, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Marjolein P. Baar

Departamento de Genética Clínica y Escuela de Oncología y Biología del Desarrollo, Centro Médico de la Universidad de Maastricht, Maastricht, Países Bajos

Kasper WJ Derks

Centro Princesa Máxima de Oncología Pediátrica, Instituto Oncode, Utrecht, Países Bajos

Jan HJ Hoeijmakers

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JP concibió y supervisó el proyecto. JP, AG y JC diseñaron los experimentos. JP, AG, JC y JHJH interpretaron los datos. JP, AG y JC escribieron el manuscrito y prepararon las figuras. JHJH leyó críticamente, introdujo el concepto de pérdida de genes largos relacionada con la edad y editó el manuscrito. RMCB y SB realizaron los experimentos con ratones y las inyecciones de UE. AG realizó y analizó la tinción de EU y RNAPII en ratones WT. SB realizó y analizó la tinción con UE en ratones Xpg-/-. AG desarrolló el EU-seq y preparó todas las muestras de secuenciación. JC, AG y KWJD diseñaron la tubería de análisis EU-seq. JC y KWJD crearon la canalización de mapeo y normalización EU-seq. JC diseñó los algoritmos y escribió los scripts para los análisis de datos. JC AG y realizó los análisis de bioinformática. JJPGD realizó los ensayos de acumulación de estrés transcripcional in vitro. MR realizó los análisis estadísticos. STB y MPB realizaron la tinción con UE en cultivos celulares expuestos a UV y analizaron la senescencia celular.

Correspondencia a Joris Pothof.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Genetics agradece a Evgeny Nudler, George Garinis y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a – c, diagramas de dispersión XY de (a) RNAPII total, (b) RNAPII-ser5p y (c) RNAPII-ser2p; AU: unidades arbitrarias. azul: hígados adultos de tipo salvaje; rojo = hígado viejo. n = 3 ratones/grupo. Número total de núcleos contados: a, adulto: n = 206, viejo: n = 155. b, adulto, n = 748; viejo n = 701. c, adulto: n = 984; edad, n = 674.

Datos fuente

a, diagrama de flujo de análisis de secuenciación de ARN naciente marcado con UE (EU-seq). b, c, Distribución de lectura de secuencia en EU-seq y secuenciación de ARN total en intrones y exones (b) y mapeada en genes (c), que muestra un mayor número de lecturas intrónicas en EU-seq, lo que indica un enriquecimiento de ARN naciente. d, Gráficos de Bioanalyzer de cDNA sintetizado en perlas para generar bibliotecas EU-seq. Dado que la transcriptasa inversa no puede sintetizar ADNc a través de la biotina unida covalentemente al ADN, el ADNc solo se genera entre biotinas unidas covalentemente a la UE o desde la biotina unida a la UE hasta el extremo del ARN. El cDNA adulto y antiguo es casi idéntico, lo que indica tasas de incorporación a la UE similares. e, tabla que representa la incorporación a la UE para un rango de distancias entre las moléculas de la UE según el modelo del proceso de Poisson. Se examinaron tres grupos de especies de ARN: 1) ≤300 nucleótidos (n = 7932), 2) 1000 a 3000 nucleótidos (n = 1983) y 3) 2000 a 4000 nucleótidos (n = 1802). Se muestra la mediana y el rango intercuartílico (RIC). f, tabla de marco estadístico y probabilístico que representa una reducción de 1,5 veces para un rango de diferencias de distancia de incorporación de la UE. Si la incorporación a la UE difiere entre adulto y viejo, se espera que en especies de ARN ≤300 nucleótidos la probabilidad de al menos una incorporación a la UE sea significativamente menor. Para cada par especificado de intensidades separadas por 1,5 veces, se calculó el cambio esperado en el hígado envejecido y se compararon los vectores de probabilidades de 7932 dimensiones correspondientes mediante la prueba U de Mann-Whitney. Existe una probabilidad muy alta y significativa de que se observe una diferencia entre adulto y anciano (p < 2,2 × 10−16, columna 3) si hay una reducción de 1,5 veces en la incorporación de UE en el hígado anciano. g, lecturas de secuencia porcentual en conjuntos de datos EU-seq mapeados a categorías de longitud de especies de ARN i) ≤300 nucleótidos, ii) 1000 a 3000 nucleótidos, y iii) 2000 a 4000 nucleótidos. La categoría de longitud ≤300 nucleótidos muestra un aumento de 1,2 veces no significativo (valor p = 0,061093, prueba t no pareada bilateral) en el hígado envejecido, lo que indica que es poco probable que la disponibilidad en la UE sea diferente entre hígados adultos y envejecidos. Los datos son la media ± SEM. h, porcentaje de lecturas de ARN naciente marcadas con UE sintetizadas por diferentes polimerasas de ARN (RNAPI-II-III y RNAP mitocondrial (RNAP-MT)). Los valores antiguos ajustados (naranja) se calcularon mediante la compensación proporcional de la reducción de la transcripción naciente como se observa en la Fig. 1a. n = 3 ratones/grupo. Los datos son la media ± SEM. i, Empalme alternativo en datos EU-seq. n = 3 ratones/grupo. Los datos son la media ± SEM. j, Proporciones de sitios donantes y aceptores de empalme en EU-seq. n = 3 ratones/grupo. Los datos son la media ± SEM.

Datos fuente

a, Representación esquemática de la identificación basada en agrupamiento de k-medias de los mecanismos reguladores putativos detrás de los cambios de expresión génica relacionados con el envejecimiento. b, c, el cambio medio Log2-fold de EU-seq y lecturas RNAPII ChIP-seq totales en hígado envejecido a lo largo de los cuerpos genéticos (3 contenedores) de (b) genes 'regulados por aumento del promotor' (n = 778) y (c ) Genes 'promotor regulados a la baja' (n = 394). Calculado a partir de la figura principal 2 f. Los datos son la media ± SEM. d, Longitud promedio del gen (panel izquierdo) de todos los genes expresados, genes regulados al alza del promotor, genes regulados a la baja del promotor y genes con una pérdida gradual alta de transcripción productiva (GLPThigh) como se ve en la Fig. 2a y clasificados por longitud del gen (derecha panel) Grupos: 10–22 kb (azul; n = 662); 22–32 kb (negro; n = 644); 32–50 kb (rosa; n = 788), 50–70 kb (amarillo; n = 587), 70–110 kb (naranja; n = 643) y >110 kb (rojo; n = 646). Los datos son la media ± SEM. Valor P = 7.84163*10−22, prueba t no pareada bilateral. e, La contribución (%) de cada clase de longitud de genes al conjunto total de ARN naciente en muestras de adultos. f, Cálculo de la fracción de complejos RNAPII improductivos en hígado envejecido. g, Estimación del número de complejos RNAPII estancados en hígado envejecido.

Datos fuente

Parámetros transcripcionales en los grupos de genes funcionales identificados (como se describe en la Fig. 3a extendida): a–d, composición promedio de nucleótidos por kb de longitud del gen en la hebra de plantilla para los primeros 70 kb de TSS de los 50 genes GLPThigh principales 70–80 kb ( línea negra) en comparación con 50 genes restantes de 70–80 kb que contienen niveles bajos de GLPT (línea roja). Los datos son la media ± SEM. e, tasas de error transcripcional en datos EU-seq de hígados adultos (azules) y viejos (rojos) de tipo salvaje en 4 conjuntos de genes diferentes: 'Promotor-regulado al alza' (n = 778), 'Promotor-regulado a la baja' (n = 394), GLPTalto (n = 914), resto (n = 1884). Los datos son la media ± SEM. f, Diagrama de barras que muestra la relación entre las lecturas de EU-seq asignadas a los sitios donantes y aceptores de empalme de genes en cada grupo de genes funcionales en e. Promedio de n = 3 / grupo mostrado. Los datos son la media ± SD.

Datos fuente

Grupos de genes funcionales: genes regulados al alza por el promotor, genes regulados a la baja por el promotor, genes con una pérdida gradual alta de transcripción productiva (GLPThigh) y resto. Los datos son la media ± sd Las líneas azules representan hígado adulto, las líneas rojas representan hígado viejo. Promedio de n = 3 / grupo mostrado para: a, Total RNAPII. b, serina 5 fosforilada (ser5p) RNAPII. c, acetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27Ac; cromatina abierta). d, histona 3 lisina 4 trimetilación (H3K4Me3; cromatina abierta). e, la cromatina inaccesible ya que la MNasa digiere solo el ADN no unido a las proteínas, incluidos los nucleosomas.

Datos fuente

Grupos de genes funcionales: genes regulados al alza por el promotor, genes regulados a la baja por el promotor, genes con una pérdida gradual alta de transcripción productiva (GLPThigh) y resto. Las líneas azules representan hígado adulto, las líneas rojas representan hígado viejo. Promedio de n = 3/grupo mostrado de densidad de lectura de secuenciación de TSS + 750 pb a TTS + 4 kb para: a, acetilación de histona 3 lisina 27 (H3K27Ac; cromatina abierta). b, histona 3 lisina 4 trimetilación (H3K4Me3; cromatina abierta). c, la cromatina inaccesible ya que la MNasa digiere solo el ADN no unido a las proteínas, incluidos los nucleosomas. d, estado de metilación del ADN.

Datos fuente

a, Diagrama de barras que representa el sesgo de la hebra codificante en datos RNAPII ChIP-seq totales 1 hora y 6 horas después de irradiar células MCF7 con 55 J/m2 UVB (datos de 76). Todos los genes (n = 18224), genes cortos (10–22 kb) y genes largos (>110 kb). Los datos son la media ± SEM. Tenga en cuenta que el sesgo de cadena solo está presente en las células MCF7 1 hora después del tratamiento con UVB, cuando RNAPII todavía está estancado en las lesiones de ADN y la reparación del ADN está en curso. Después de 6 horas, la mayor parte del RNAPII detenido se ha eliminado de las lesiones de ADN. Esto muestra que i) el protocolo utilizado es capaz de detectar un sesgo hacia la cadena de codificación y, por lo tanto, puede usarse para analizar muestras envejecidas, ii) el sesgo de la cadena de codificación es un fenotipo transitorio después de UVB. Sobre la base de las cantidades publicadas de sesgo de cadena de codificación después de una densidad de lesión de ADN inducida por UVC conocida38, estimamos que los hígados de ratones envejecidos de tipo salvaje muestran una fracción de sesgo de cadena de codificación en el rango de 0,05 a 0,10. b – f, Cobertura media de metilación del ADN local ( b ) y ( c – f ) estado de composición de nucleótidos locales en cadenas de plantilla de 50 genes que exhiben el sesgo de cadena de codificación más alto en general. La región intrónica intragénica se elige con el sesgo de cadena de codificación más alto (loci de sesgo de cadena alta). Este conjunto de genes loci se compara ti) loci intragénicos seleccionados al azar de tamaño similar: 6 veces 50 ubicaciones intrónicas aleatorias en la hebra molde, y ii) el transcriptoma intrónico completo; todos los intrones del transcriptoma (incluidas las ubicaciones de polarización de cadena alta). Promedio de n = 50 / grupo mostrado. Los datos son la media ± SD.

Datos fuente

Tabla complementaria 1. Superposición entre los genes TShigh y seis estudios de transcriptómica independientes con genes regulados a la baja por el daño de los rayos UV. Tabla relacionada con la Fig. 5. Tabla complementaria 2. Vías y procesos celulares que están significativamente sobrerrepresentados en la categoría TShigh. Tabla relacionada con la Fig. 5.

Fuente de datos estadísticos.

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Gyenis, A., Chang, J., Demmers, JJPG et al. El estancamiento de la polimerasa de ARN en todo el genoma da forma al transcriptoma durante el envejecimiento. Nat Genet 55, 268–279 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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Recibido: 17 diciembre 2021

Aceptado: 07 diciembre 2022

Publicado: 19 enero 2023

Fecha de emisión: febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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